分子生物学技术

为使核酸牢固结合在膜上，通常还将点样 后的膜进行80℃真空烘烤2h。 应用斑点印迹技术，可在一张膜上同时进 行多个样品的检测，操作简便、快速，在 临床诊断中应用较广。适合进行特定基因 的定性及定量研究，但不能鉴定所测基因 的分子量。(2) Southern印迹(Southern blot) 这是指将DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离 后转移到固相支持物上的过程。常规处理 如下，先用限制性内切酶对DNA样品进行 酶切处理，经琼脂糖凝胶电泳将
用探针对细胞或组织切片中的核酸杂交并 进行检测的方法称之为核酸原位杂交。某 特点是靶分子固定在细胞中，细胞固定在 载玻片上，以固定的细胞代替纯化的核酸， 然后将载玻片浸入溶有探针的溶液里，探 针进入组织细胞与靶分子杂交，而靶分子 仍固定在细胞内。例如。可用特异性的细 菌、病毒的核酸做为探针对组织、细胞进 行原位杂交，以确定有无该病原体的感染 等。原位杂交不需从组织中提取核酸，对 于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感 性，在临床应用上有独特的意义。
目前应用较多的非放射性标记物是生物素 (Biotin)和地高辛(digoxigenin)。二者都是半 抗原。生物素是一种小分子水溶性维生素， 对亲和素有独特的亲和力，两者能形成稳 定的复合物，通过连接在亲和素或抗生物 素蛋白上的显色物质(如酶、荧光素等)进行 检测。地高辛是一种类固醇半抗原分子， 可利用其抗体进行免疫检测，原理类似于 生物素的检测。地高辛标记核酸探针的检 测灵敏度可与放射性同位素标记的相当， 而特异性优于生物素标记，其应用日趋广 泛。
分子生物学技术
一、分子生物学概念 二、核酸探针技术 三、PCR 四、
一、分子生物学概念
（一）基本概念 （二）基因的碱基顺序与蛋白质的氨基酸顺 序 （三）基因的结构 （四）基因的表达与调控
（一）基本概念 基因： 基因：是编码蛋白质或RNA分子遗传信息 的基本遗传单位。从化学角度观察，基因 则是一段具有特定功能和结构的连续的脱 氧核糖核酸序列，是构成巨大遗传单位染 色体的重要组成部分。 顺反子：顺反子和基因这两个术语是互相 顺反子 通用的。一般来说，一个顺反子既是一个 基因，大约含有1500个核苷酸对，是由一 群突变单位和重组单位组成的线性结构。
将 RNA进行反转录，所获得的产物即为 cDNA。cDNA探针适用于RNA病毒的检测。 cDNA探针序列也可克隆到质粒或噬菌体中， 以便大量制备。将信息RNA(mRNA)标记也 可作为核酸分子杂交的探针。但由于来源 极不方便，且RNA极易被环境中大量存在 的核酸酶所降解，操作不便，因此应用较 少。用人工合成的寡聚核苷酸片段做为核 酸杂交探针应用十分广泛，可根据需要随 心所欲合成相应的序列，可合成仅有几十 个bp的探针序列，对于检测点突变和小段
碱基的缺失或插入尤为适用2.按标记物划 分 有放射性标记探针和非放射性标记探 针两大类。放射性标记探针用放射性同位 素做为标记物。放射性同位素是最早使用， 也是目前应用最广泛的探针标记物。常用 的同位素有32P、3H、35S。其中，以32P应用 最普遍。放射性标记的优点是灵敏度高， 可以检测到Pg级；缺点是易造成放射性污 染，同位素半衰期短、不稳定、成本高等。 因此，放射性标记的探针不能实现商品化。 目前，许多实验室都致力于发展非放射性 标记的探针。
因此，顺反子概念表明：基因不是最小单 位，它仍然是可分的；并非所有的DNA序 列都是基因，而只有其中某一特定的多核 苷酸区段才是基因的编码区。 每一个顺反子就是一段核苷酸序列，或者 是一个基因的DNA或RNA单元，它编码一 种完整的多肽链。顺反子是功能单位，它 是由许多可以突变的位点组成的，而这些 位点之间又可以发生交换。 多体蛋白质（multimeric proteins）：由数 多体蛋白质 个亚基组成的蛋白质。
1. 中心法则（central dogma）：既遗传信 息是从DNA流向RNA，再由RNA流向蛋白 质 而遗传信息从DNA直接到蛋白质的传递， 只是一种理论上的可能性，迄今尚未得到 证实。
2. 密码子：每3个碱基编码一种氨基酸，就 会编码出64种（43=64）不同的氨基酸。蛋 白质分子是由20种不同的氨基酸构成的， 因此，1种氨基酸可有几个不同的密码子， 既3个碱基甚至更多的碱基编码一种氨基酸 是必要的。 遗传密码是否重叠？研究证实：遗传密码 是不重叠的。 三联体之间是否存在着“逗号”？研究证 实：碱基的阅读是从一个固定的起点按序 进行的，不存在有什么“逗号”的问题。 …QABCQDEFQGHIQJKLQ…
降温复性。）核酸探针是指带有标记物的 已知序列的核酸片段，它能和与其互补的 核酸序列杂交，形成双链，所以可用于待 测核酸样品中特定基因序列的检测。每一 种病原体都具有独特的核酸片段，通过分 离和标记这些片段就可制备出探针，用于 疾病的诊断等研究。
(一) 核酸探针的种类 一 1.按来源及性质划分 可将核酸探针分为 基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针 和人工合成的寡核苷酸探针等几类。 作为诊断试剂，较常使用的是基因组DNA 探针和cDNA探针。其中，前者应用最为广 泛，它的制备可通过酶切或聚合酶链反应 (PCR)从基因组中获得特异的DNA后将其克 隆到质粒或噬菌体载体中，随着质粒的复 制或噬菌体的增殖而获得大量高纯度的 DNA探针。
（三）基因的结构
基因的编码区（即转录区）是连续不断的 序列，包括一个起始密码子ATG和一个终 止密码子TAA。编码区的两侧是转录而不 转译的侧翼序列区，其中5`非转译区简称 5`UTR，含有一个核糖体结合位点及一个 转录起始信号；3`非转译区简称3`UTR含有 一个转录终止信号。 无论是真核的基因还是原核的基因，都可 划分成编码区和非编码区两个基本组成部 分。 编码区含有大量的可以被细胞质中转译机 器阅读的遗传密码，包括起始密码子（通
近年来液相杂交技术有所发展。液相杂交 与固相杂交的主要区别是不用纯化或固定 的靶分子，探针与靶序列直接在溶液里作 用。液相杂交步骤有所简化，杂交速度有 所提高，增加了特异性和敏感性，但与临 床诊断所要求的特异性和敏感性还有一定 的距离。 各种杂交技术中，膜上印迹杂交技术应用 最为广泛，它由以下三个基本过程组成。 1.核酸印迹技术 (1) 斑点印迹(Dot-blot) 将待测核酸样品变 性后直接点样在膜上，称之为斑点印迹。
同型多体蛋白质： 同型多体蛋白质：在多体蛋白质中，如果 所有的亚基都是同样的，这种蛋白质就属 于同型多体（homomultimer）蛋白质，由 一种基因编码。 异型多体（ 异型多体（heteromultimer）蛋白质：亚 ）蛋白质： 基各不相同的蛋白质，由多种基因编码。 如血红蛋白。
（二）基因的碱基顺序与蛋白质的氨 基酸顺序
2. RNA探针 全基因RNA探针可用RNA病毒的基因标记 即可；由DNA转录出探针RNA，可由RNA 聚合酶获得大量高纯度的RNA，其灵敏度 比DNA探针高出10多倍。
(三) 核酸杂交 杂交技术有固相杂交和液 三 相杂交之分。固相杂交技术目前较为常用， 先将待测核酸结合到一定的固相支持物上， 再与液相中的标记探针进行杂交。固相支 持物常用硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC膜)或尼龙膜(nylon membrane)。固相杂交包括膜上印迹杂交和 原位杂交。前者包括三个基本过程：第一， 通过印迹技术将核酸片段转移到固相支持 物上；第二，用标记探针与支持物上的核 酸片段进行杂交；第三，杂交信号的检测。
Northern印迹后进行杂交反应可鉴定其中特 异 mRNA分子的量与大小。 Northern印迹的方法与Southern印迹基本相 同，可参照进行。但RNA的变性方法与 DNA不同。DNA样品可先通过凝胶电泳进 行分离，再用碱处理凝胶使DNA变性。而 RNA不能用碱变性,因为碱会导致RNA水解。 因此，在Northern印迹前，须进行RNA变性 电泳，在电泳过程中使RNA解离形成单链 分布在凝胶上，再进行印迹转移。 RNA变 性电泳的原理，是用一定剂量的乙二醛-二 甲基亚矾，或甲醛和甲基氢氧化汞等处理
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（四）基因的表达与调控
结构基因(structural gene)：编码细胞成份， 如代谢酶类、转运蛋白质和细胞骨架成份 等的基因。 调节基因（regulatory gene)：编码控制其他 基因表达的RNA或蛋白质产物的基因。 操纵基因（operator): 指接受来自调节基因 合成的调节蛋白的作用，使结构基因转录 活性得以抑制的特定的DNA区段，也称为 控制单元。
得DNA片段按分子量大小分离，接着对凝 胶进行变性处理，使双链DNA解离成单链， 并将其转移到NC膜或其它固相支持物上， 转移后各DNA片段的相对位置保持不变。 用探针与经Southern印迹处理的DNA样品 杂交，可鉴定待测DNA的大小、进行克隆 基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性 及定量分析、基因突变分析及限制性片段 长度多态性分析(RFLP)等。 (3) Northern印迹(Northern blot)Northern印迹 是指将RNA片段变性及电泳分离后，转移 到固相支持物上的过程。RNA样品经
常是AUG）和终止密码子（UAA，UAG或 UGA）。非编码区结构中的5`末端非转译 区（5`UTR）和3`末端非转译区（3`UTR）， 对于基因遗传信息的表述是必要的，但它 们都不会被转译成多肽序列。 真核基因与原核基因的区别： 事实上，真核生物的基因都是以单顺反子 的形式存在，因此它们编码的也都是单基 因产物。而大肠杆菌类原核生物往往是多 顺反子，它转录的是一种大分子量的 mRNA，可同时编码两种甚至数种的基因 产物。
溴化乙锭（EB）染色，然后分析DNA酶切 片段的数目、迁移率等分析微生物的变异 现象、鉴定毒株、分型及了解基因结构和 进行流行病学研究等等。 方法： 1.DNA抽提 2.DNA 酶切 3.电泳 4.染色 5.观察、照相 6.分析 7.酶切图谱
核酸探针技术
前言
(一) 核酸探针的种类 一 (二) 核酸探针的制备 (三) 核酸杂交 三 (四) 核酸探针技术在动物检疫中的应用 四
储藏在基因中的遗传信息分转录和转译两 步进行表达，这种遗传信息从DNA到RNA 再到蛋白质的流向，在所有的细胞类型中 都是受到高度调节的，同时在有些情况下 也是严格协同的。基因表达的此种严格调 控机理，保证细胞不会浪费能量用于合成 它所不需要的基因产物。 从基因研究上，操纵子概念比顺反子又进 了一步。即基因不但在结构上是可分的， 而且在功能上也是有分工的。同时，有的 基因控制蛋白质产物的合成，而有的基因 并没有直接的产物。 操纵子模型
（二）核酸探针的制备 1. DNA探针制备 （1）以病原细胞核或病毒中提取的特异性 DNA，用理化学方法将其纯化，然后再用 限制性核酸酶将DNA切割成若干片段，电 泳回收目的DNA； （2）酶促反应合成法，即从病原中提取 mRNA，在反转录酶作用下合成互补结构 的DNA（cDNA）； （3） 化学合成法，以单核苷酸为原料， 人工合成DNA的某一片段。
二、核酸探测技术
（一）指纹图谱 （二）核酸分子杂交
（一）、指纹图谱
指纹图谱： 指纹图谱：即核酸酶切图谱，对生物的蛋 白质、DNA和RNA进行分析的电泳图、杂 交放射性自显影图等。在微生物研究上， 主要是用限制性内切酶（ERA）对病毒、 细菌DNA进行酶切分析的图谱。 原理： 原理：在微生物（细菌）细胞中有1种限制 性内切酶类（II，称为RE），能特异性的 识别和切割DNA链上特定的一段DNA片段， 这类酶广泛应用于基因工程的各个方面。 ERA就是用RE消化病毒或细菌的DNA或质 粒，将消化物于琼脂凝胶中电泳分离，经
前言
化学及生物学意义上的探针(probe)，是指 与特定的靶分子发生特异性相互作用，并 可被特殊的方法探知的分子。抗体-抗原、 生物素-抗生物素蛋白、生长因子-受体的相 互作用都可以看作是探针与靶分子的相互 作用。 核酸探针技术原理是碱基配对。互补的两 条核酸单链通过退火形成双链，这一过程 称为核酸杂交。（基本过程是：加热变性