分子生物学技术
2024版分子生物学常用技术共35张
电泳法
在电场作用下，利用蛋白质带电 性质和分子大小的差异进行分离， 如SDS-PAGE、双向电泳等。
亲和层析法
利用生物分子间的特异性相互作 用进行分离纯化，如免疫亲和层 析、金属螯合亲和层析等。
蛋白质鉴定和定量分析手段Fra bibliotek质谱法
通过测量蛋白质分子的质 量和碎裂模式进行鉴定和 定量分析，如MALDI-TOF MS、LC-MS/MS等。
信号传导途径涉及多种分子，包括受体、配体、信号转导蛋白和效应器等。
信号传导途径的异常与多种疾病的发生和发展密切相关，如癌症、神经退 行性疾病等。
受体介导信号传导途径研究方法
01
受体结合实验
利用放射性标记的配体或抗体， 检测受体与配体的结合情况，确 定受体的类型和数量。
02
信号转导蛋白活性 检测
通过检测信号转导蛋白的磷酸化、 去磷酸化等修饰状态，评估其活 性。
发展历程
自20世纪50年代以来，随着DNA双螺旋结构的发现、遗传密码 的破译、基因工程技术的建立等一系列重大突破，分子生物学 迅速崛起并渗透到生物学的各个领域，推动了整个生物科学的 飞速发展。
分子生物学研究内容
基因与基因组研究 包括基因的结构、功能、表达调控以 及基因组的结构、功能与进化等。
DNA复制、转录与翻译
工具使用
BLAST、Bowtie、BWA等软件进行序列比对；CAP3、Velvet、 SPAdes等软件进行序列拼接。
基因结构和功能预测方法
基因结构预测
通过识别编码区、非编码区、启动子、终止子等 元素，预测基因的结构和组成。
基因功能预测
利用基因表达谱、蛋白质互作网络、代谢通路等 信息，预测基因的功能和调控机制。
分子生物学实验技术全攻略
分子生物学实验技术目录实验一细菌的培养 2实验二质粒DNA的提取 3实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 4实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 5实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 7实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 8实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA 9实验八 RNA提取与纯化 11实验九 RT-PCR扩增目的基因cDNA 13实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 15实验十一感受态细胞的制备及转化 16实验十二克隆的筛选和快速鉴定 18实验十三 DNA分析——Southern杂交 19一基本操作实验一、细菌培养实验二、质粒DNA提取实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析实验八、植物RNA提取及纯化二、目的基因获取实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA三、目的基因的克隆和表达实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应实验十一、感受态细胞的制备及转化实验十二、克隆的筛选和快速鉴定实验十三、DNA分析——Southern杂交实验一细菌的培养一、目的学习细菌的培养方法及培养基的配置。
二、原理在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。
质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。
特别是常用的大肠杆菌。
大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。
它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。
当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。
然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。
最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。
分子生物学技术
分子生物学技术第一篇：分子生物学技术简介在现代生物学领域中，分子生物学一直在成为一个重要的分支。
分子生物学技术是指通过利用生物大分子（如核酸和蛋白质）的结构、功能和相互作用，并且应用各种技术手段来研究生物学各个领域的过程和现象。
分子生物学技术包括PCR（聚合酶链式反应）、基因组学技术、蛋白质质谱分析、基因编辑技术、CRISPR等。
此外，还有一些深入研究细胞活性和生物分子间相互作用的技术，例如免疫共沉淀、GST pull down等。
PCR技术是现代分子生物学技术的里程碑，被视为分子生物学的“基石”。
PCR技术可以扩增植物、微生物、动物、人类细胞和组织等物种的DNA，并且可以在非常短的时间内扩增一个非常小的DNA片段。
基因组学技术可以检测质粒、细胞、生物样本和组织的基因及其表达的情况。
现代基因组技术已经可以读取大量的基因及其表达信息，可以用于检测一个物种内所有的基因序列，在了解生物基因前提下解析该基因在生物的功能和表达规律。
蛋白质质谱分析可以检测蛋白质组之间的差异，并且可以帮助研究蛋白质结构、功能和相互作用。
基因编辑技术与CRISPR技术相连接，使科学家们能够快速高效地进行基因操纵。
基因编辑技术可以通过人工改变基因，使得特定的序列发生变化，可以用于研究基因的功能和基因治疗等领域。
总的来说，分子生物学技术的发展促进了现代生物学的发展。
无论是学术研究，还是未来医疗、工业和农业领域的应用，都需要分子生物学技术作为基础技术。
第二篇：PCR技术详解PCR是（聚合酶链式反应）的缩写，这是一种灵活、快速、高效、精准的分子生物学技术，用于扩增DNA的特定序列。
PCR技术不仅广泛用于分子生物学研究，还应用于医学、环境监测、食品安全等领域。
PCR技术采用酶促反应而不需要细胞培养或动物宿主，因此可以作为一项独立、快速和低成本的实验技术来进行DNA扩增。
PCR技术的关键在于利用一组半保留的引物（一小段DNA 序列）来选择性扩增在引物之间的目标段。
医学分子生物学 7 分子生物学常用技术
5′
3′
*********G —OH
*********C T T A A — P
3′
5′
5′
3′
P A A T T C*********
OH— G*********
3′ 5′
EcoR I: dATP+ [α-32P]-dTTP
19
根据反应原理确定同位素反应底物名称
• DNA的切口平移标记法 • 随机引物标记法 • DNA的3′末端标记
• 极高的特异性
缺点 半寿期短, 故要随用随标 放射性污染
9
1. DNA探针放射性标记方法
(1) 切口平移标记法 (2) 随机引物标记法 (3) PCR标记法 (4) 5′-末端标记 (5) 3′-末端标记
10
(1) DNA的切口平移标记法
5′
3 ′ 双链DNA
3′
5′
DNase I，Mg2+
② 反应产物的长度与加入的寡核苷酸引物的量呈反比。
当需要较长片段探针，可适当减少随机引物的加入量。
③ 所得到的标记产物为新合成的DNA单链。当采用单链
DNA片段或RNA作为模板时，必须注意得到的标记探针并 不是其本身.
④ 反应条件要控制在pH值6.6，抑制Klenow DNA聚合酶
的3′－5′外切酶的活性。
第七章 分子生物学常用技术
1
第一节 核酸分子杂交
2
*核酸分子杂交：
具有一定互补序列的不同来源的核苷酸单 链在一定条件下按照碱基配对的原则形成
杂交双链的过程。
实质: 核酸分子的变性与复性过程
变性：将双链DNA分子解聚成为单链的过程 复性：使单链聚合成双链的过程，又称为退火. 特点：高度特异性和灵敏性 杂交的双方: （靶,target） --待测序列
分子生物学技术
分子生物学技术近年来，心血管疾病的发病率和死亡率急剧增加，已成为危害我国人民群众生命和健康的重大疾病。
人们逐渐认识到,包括心血管疾病在内的许多疾病的生理、病理机制的本质问题是相关基因的表达及其调控。
随着研究的深入, 心血管疾病的研究已深入到分子生物学水平。
人们寻找疾病相关基因, 研究其表达调控机制, 希望在分子水平阐明疾病发生机制, 以期更有效地进行疾病的诊断、治疗。
相应地, 很多分子生物学研究技术也应用到对心血管疾病的研究中来, 成为不可或缺的基本手段, 如分子杂交技术、聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR）技术、反义核酸技术、DNA微阵列、转基因技术等等。
分子诊断学是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据的一门学科。
1953年Watson & Crich发现DNA 双螺旋结构, 标志着分子生物学时代的到来。
随着研究的进展, 人们对心血管疾病的研究也逐步深入到分子水平, 很多分子生物学的研究技术也在疾病机理、药物机理的研究中广泛应用, 成为基本的研究手段。
人类基因组计划完成后, 生命科学研究进入后基因组时代, 进行功能基因组学、蛋白质组学的研究, 相应的实验技术也广泛应用并不断发展。
在过去的短短的10余年中,检验医学发展日新月异、发展迅猛,临床实验室的实验设备已高度自动化及网络化，“实验室全自动化”（Total Laboratory Automation,TLA）、分子诊断（MolecularDiagnostics）、床旁检验（Point of Care Tests,POCT）、循证检验医学（Evidence basedlaboratory medicine,EBLM）的兴起为心血管疾病的诊疗提供了极大帮助。
一、分子生物学技术由于分子生物学技术的快速发展,以及人类基因组序列认识的逐渐完善,以PCR为代表的体外核酸扩增技术已在临床基因诊断中得以较为广泛的应用,如病毒、细菌的基因快速检测,遗传性疾病的诊断,肿瘤的基因诊断等。
分子生物学技术
降温复性。）核酸探针是指带有标记物的已知 序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列 杂交，形成双链，所以可用于待测核酸样品中 特定基因序列的检测。每一种病原体都具有独 特的核酸片段，通过分离和标记这些片段就可 制备出探针，用于疾病的诊断等研究。
第17页，本讲稿共43页
(一) 核酸探针的种类
1. 中心法则（central dogma）：既遗传信息是 从DNA流向RNA，再由RNA流向蛋白质 而遗传信息从DNA直接到蛋白质的传递，只是
一种理论上的可能性，迄今尚未得到证实。
第6页，本讲稿共43页
2. 密码子：每3个碱基编码一种氨基酸，就会 编码出64种（43=64）不同的氨基酸。蛋白质 分子是由20种不同的氨基酸构成的，因此，1种 氨基酸可有几个不同的密码子，既3个碱基甚
等。 (3) Northern印迹(Northern blot)Northern印迹是指
将RNA片段变性及电泳分离后，转移到固相 支持物上的过程。RNA样品经
第25页，本讲稿共43页
近年来液相杂交技术有所发展。液相杂交与 固相杂交的主要区别是不用纯化或固定的靶 分子，探针与靶序列直接在溶液里作用。液 相杂交步骤有所简化，杂交速度有所提高， 增加了特异性和敏感性，但与临床诊断所要 求的特异性和敏感性还有一定的距离。 各种杂交技术中，膜上印迹杂交技术应用最 为广泛，它由以下三个基本过程组成。 1.核 酸印迹技术 (1) 斑点印迹(Dot-blot) 将待测核酸样品变性 后直接点样在膜上，称之为斑点印迹。
码两种甚至数种的基因产物。
第9页，本讲稿共43页
（四）基因的表达与调控
结构基因(structural gene)：编码细胞成份，如代 谢酶类、转运蛋白质和细胞骨架成份等的基因。 调节基因（regulatory gene)：编码控制其他基
分子生物学常用技术
切除所有结合与不 结合蛋白质的DNA 带，并用六氢吡啶 切割甲基化的G残 基
缺失的DNA带表 结合带 非结合带 明相应G残基的重 要意义，它得到 结合蛋白质的保 护
甲基化干扰实验
4、体内足迹实验
完整的细胞 × G G
DMS
裸露的DNA G G
× G
me
G
分离DNA并用 六氢吡啶切割
Me Me
G
G
PCR扩增 凝胶分析
1× 29× 1×
*This cycle is normally included in a PCR assay in order to allow any “unfinished” product from previous amplification to achieve its full length
PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引 物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反 应参数是94℃变性1min， 60 ℃退火1min， 72 ℃ 延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增 产物的数量满足实验需求为止。
Reaction Condition for a Typical PCR Assay
2、诺赛恩RNA印迹技术（Northern blotting）
1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝 胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行 核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩DNA印迹杂交 技术十分类似，所以叫做诺赛恩RNA印迹技术（Northern blotting）。 而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后 同放射性同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技 术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术（Western blotting）。
分子生物学技术
分子生物学技术
分子生物学技术：
1、核酸技术
核酸技术是一种分子生物学手段，用于检测、分析及操纵生物分子，其中主要有聚合酶链式反应（PCR）、克隆、序列测定、探针和杂交以及核糖体克隆等过程，能够分析及操纵基因表达、调控等生物学现象。
采用核酸技术可有效检测和分析遗传突变体、重组基因、病毒感染和肿瘤等，包括许多关键步骤，如克隆、DNA提取、核苷酸序列测定、生物信息分析、蛋白质结构测定等，是生物科学领域最重要和基础的技术之一。
2、生物材料技术
生物材料技术是一种新兴的生物学技术，利用有机或无机天然材料制备的生物小体系以及各种生物标记和测试物质，用以揭示生物事件及其机制。
此技术不仅可以检测活性蛋白、核酸分子等物质，而且可用于替代人体实验和动物模型，具有更快捷、更小开成本等优势，可以快速进行基础研究、病原检测及定点药物的研发等多种应用。
3、单细胞膜免疫印迹
单细胞膜免疫印迹（sMFI）技术是一种准确而又灵敏的技术，可高效检测和分析单个细胞的内外分子环境，比如细胞表面CD4 / CD8受体的种类、状态和浓度变化。
这种先进技术不仅可以获得大量具有单细胞精确度的样本，而且可以快速界定病原体在犹太人细胞内的毒性等特征，为疾病诊断与治疗提供科学依据。
4、蛋白质组学技术
蛋白质组学技术是一种建立在分子生物学、生物化学等基础技术之上的新技术，也称蛋白质质谱技术。
它可以用于研究特定生物体内不同组织和细胞中的蛋白质表达，从而分析生物体关键细胞组成部分及它们之间的关系。
其主要步骤包括组织提取、蛋白组分离、蛋白鉴定和蛋白质序列鉴定等。
利用蛋白质组学技术，可以揭示和分析不同疾病状态下特异蛋白的表达、结合和变化，为研究和治疗疾病提供重要依据。
生物学中的分子生物学技术
生物学中的分子生物学技术生物学是研究生命现象和生命规律的科学，而分子生物学则是生物学的一个重要分支，它研究生物体的分子结构、功能和相互关系。
分子生物学技术则是通过一系列的实验方法和技术手段，揭示生物体内分子的组成和功能，为生物学研究和生物工程应用提供了强大的工具。
一、基因克隆技术基因克隆技术是分子生物学中最重要的技术之一。
它通过将目标基因从一个生物体中复制并插入到另一个生物体中，实现基因的扩增和转移。
基因克隆技术的核心是重组DNA技术，它包括DNA分离、限制性内切酶切割、DNA连接和DNA转化等步骤。
通过基因克隆技术，科学家们可以对基因进行研究，揭示基因的结构和功能，也可以利用基因克隆技术进行基因工程，生产重要的生物制品。
二、PCR技术PCR（聚合酶链式反应）技术是分子生物学中最重要的实验方法之一。
它是一种体外扩增DNA的技术，可以在短时间内扩增出大量的DNA片段。
PCR技术的原理是利用DNA聚合酶酶活性，通过不断重复的循环反应，在DNA模板上合成新的DNA链。
PCR技术广泛应用于基因检测、疾病诊断、基因工程和法医学等领域。
它的快速、高效和精确性使得科学家们能够更加深入地研究基因和DNA序列。
三、基因测序技术基因测序技术是分子生物学中的另一个重要技术。
它通过确定DNA序列来揭示基因的结构和功能。
随着测序技术的不断发展，人类已经完成了许多生物体的基因组测序工作，包括人类基因组计划。
基因测序技术的发展使得科学家们能够更加深入地了解基因，揭示基因与生命现象之间的关系，也为基因工程和疾病治疗提供了重要的依据。
四、蛋白质分析技术蛋白质是生物体中最重要的分子之一，它参与了几乎所有的生物过程。
蛋白质分析技术是分子生物学中研究蛋白质结构和功能的重要手段。
常用的蛋白质分析技术包括SDS-PAGE、Western blot、质谱分析等。
通过这些技术，科学家们可以确定蛋白质的分子量、电荷、结构和功能，揭示蛋白质与生命现象之间的关系，也为药物研发和疾病治疗提供了重要的依据。
分子生物学技术及其应用
如CRISPR-Cas9等，用于对生物体的基因 组进行精确编辑，实现基因功能的研究和基 因治疗等应用。
技术应用前景与挑战
应用前景
分子生物学技术在医学、农业、工业、环保等领域具有广泛 的应用前景，如疾病诊断与治疗、作物遗传改良、生物制药 、环境监测与治理等。
挑战
随着技术的不断发展，分子生物学面临着伦理道德、生物安 全、知识产权保护等方面的挑战，需要加强相关法规的制定 和实施，确保技术的合理应用。
药物研发和临床试验
药物靶点筛选
利用分子生物学技术筛选 疾病相关基因或蛋白质作 为药物靶点，为新药研发 提供方向。
药物作用机制研究
通过分子生物学手段揭示 药物与靶点的相互作用机 制，为药物优化和改良提 供依据。
临床试验评估
在临床试验阶段，利用分 子生物学技术对药物疗效 和安全性进行评估，加速 药物的研发进程。
通过边合成边测序或边连接边测序的方法，对数百万至数十亿个DNA 片段进行同时测序，具有高通量、高灵敏度、低成本等优点。
03
第三代测序技术
以单分子测序为主要特点，无需PCR扩增，可直接对单个DNA分子进
行测序，具有超长读长、无GC偏好等优点。
基因组组装与注释
基因组组装
将测序得到的DNA片段通过计算 机算法拼接成完整的基因组序列 ，包括重叠群组装和染色体组装 两个层次。
提取
通过细胞裂解和核酸分离等方法 从生物样品中提取RNA。
纯化
利用层析、电泳等技术去除RNA中 的蛋白质、DNA等杂质，获取高 质量的RNA。
检测
通过紫外分光光度计、荧光定量等 方法对RNA的浓度、纯度和完整性 进行检测。
RNA逆转录成cDNA
逆转录原理
以RNA为模板，在逆转录酶的作用下 合成cDNA。
分子生物学基本技术
分子生物学基本技术包括核酸的纯化，体外合成、分子杂交、基因克隆、基因表达研究技术等第一节DNA的体外合成一、DNA的化学合成 （无要求）－亚磷酸三酯法DNA的化学合成广泛用于合成寡核苷酸探针和引物，有时也用于人工合成基因和反义寡核苷酸。
目前寡核苷酸均是用DNA合成仪合成的，大多数DNA合成仪是以固相亚磷酸三酯法为基础设计制造的合成的原理：核酸固相合成的基本原理是将所要合成的核酸链的末端核苷酸先固定在一种不溶性高分子固相载体上，然后再从此末端开始将其他核苷酸按顺序逐一接长。
每接长一个核苷酸残基则经历一轮相同的操作，由于接长的核酸链始终被固定在固相载体上，所以过量的未反应物或反应副产物可通过过滤或洗涤的方法除去。
合成至所需长度后的核酸链可从固相载体上切割下来并脱去各种保护基，再经纯化即可得到最终产物。
（末端核苷酸的3′-OH与固相载体成共价键，5′-OH被二甲氧基三苯甲基(DMT)保护，下一个核苷酸的5′-OH亦被DMT保护，3′-OH上的磷酸基上氨基亚磷酸化合物活化。
碱基上的氨基用苯甲酸保护。
每延伸一个核苷酸需四步化学反应(1) 脱DMT游离出5′-OH 。
(2) 缩合（偶联反应）：新生成的5′-OH与下一个核苷活化的3′单体缩合成亚磷酸三酯使链增长(3) 盖帽（封端反应）：有少量(小于0.5%)未缩合的5′-OH 要在甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化下用乙酸苷乙酰化封闭，以防进一步缩合造成错误延伸。
(4) 氧化：新增核苷酸链中的磷为三价亚磷，需用碘氧化成五价磷（磷酸三酯）。
上述步骤循环一次，核苷酸链向5′方向延伸一个核苷酸二、聚合酶链式反应技术聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是一种体外特定核酸序列扩增技术。
一)PCR的基本原理双链DNA热变性成两条单链，降温使反应体系中的两个引物分别与两条DNA单链两侧的序列特异性复性，在合适的条件下，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，利用反应体系中的4种dNTP 合成其互补链(延伸)，在适宜的条件下，这种变性→复性→延伸的循环重复1次DNA的量可以增加1倍，30次循环后，DNA的量增加230倍。
分子生物学技术
分子生物学技术分子生物学技术是一门研究生物分子的结构、功能和相互作用的科学领域。
它通过一系列研究方法和实验技术，揭示生物体内分子的组成，研究其在生物规律中的作用，为生物科学的发展和应用提供了有力的支持。
本文将介绍几种常见的分子生物学技术及其在科学研究和应用中的重要性。
第一种技术是聚合酶链式反应（PCR）。
PCR是一种能够快速、准确地复制DNA片段的技术。
通过PCR，可以从微量的DNA模板扩增出大量的DNA片段，为后续的实验提供足够的样本。
PCR的过程包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性过程中，DNA双链被加热分离为两条单链；在退火过程中，引物与目标DNA序列互补结合；在延伸过程中，DNA聚合酶通过合成新的DNA链。
PCR技术在基因克隆、基因检测和基因定量等领域得到广泛应用。
第二种技术是DNA测序。
DNA测序是确定DNA序列的方法。
通过对DNA分子进行测序，可以了解其中所包含的信息，以及基因在细胞中的功能。
测序的过程中，通常使用Sanger方法，也就是反复进行DNA聚合酶链式延伸反应，结果是生成一系列不同长度的DNA片段。
这些片段会被分离、检测和记录，得到DNA序列。
DNA测序技术对于遗传病的诊断和治疗、疾病基因的研究以及进化生物学的研究等有着重要意义。
第三种技术是凝胶电泳。
凝胶电泳是一种常用的分离和分析DNA、RNA、蛋白质等生物大分子的方法。
凝胶电泳通过电场的作用，使带电粒子在凝胶基质中迁移，根据它们的大小和电荷进行分离。
凝胶电泳可实现DNA分子的分离和纯化，以及分析DNA片段的大小、形状和数量等信息。
凝胶电泳技术在基因分型、基因突变检测、DNA指纹鉴定等领域被广泛应用。
第四种技术是基因克隆。
基因克隆是指将DNA片段插入到载体DNA中，并通过细胞转化等方法使其复制。
基因克隆技术在分子生物学研究和基因工程中具有重要的应用价值。
通过基因克隆，可以扩大DNA 片段的数量，并将其引入到其他生物系统中进行研究。
分子生物学技术
少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互 补性。 ✓ 引物5'端对扩增特异性影响不大, 可在引物设计时加上限 制酶位点、核糖 体结合位点、起始密码子、缺失或插入 突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等. 通常应在 5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基
◦ 弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75% 乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。
◦ 小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不 要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于 水中，必要时可55℃-60℃水溶 10分钟。RNA可进行 mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。
✓PCR：以cDNA为模板，PCR扩增合成目的片段。
✓琼脂糖凝胶电泳
Hale Waihona Puke RT-PCR应用◦ 用途: 1.检测目的基因mRNA表达水平（定性、半定量） 2.获得目的基因全长编码序列，用于基因克隆
◦ 优点：简单、敏感 ◦ 局限性：不能准确反应基因表达状况
PCR产物的克隆
所用PCR循环数应尽量小,以减少平台效应，非特 异性扩增产物的干扰。PCR产物插入到载体中有下 列一些方法：
◦ 克隆原理 ◦ 先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所
得到重组质粒转化细菌,即可完成。
重组质粒的连接
◦ 外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：
◦ 带有相同的粘性末端： 用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。 ◦ 带有平末端： 是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚
分子生物学常用检测技术
分子生物学常用检测技术分子生物学是一门研究生物体内分子互动和功能的科学，其研究领域涵盖了基因组学、蛋白质组学、转录组学、代谢组学等。
这些领域的研究需要借助各种检测技术来实现，以下是几种常用的分子生物学检测技术。
1、基因测序技术：基因测序技术是测定DNA序列的技术，它可以直接读出基因序列，是分子生物学研究的重要工具。
基因测序技术可用于基因组学研究，解析物种的基因组结构和功能，也可以用于疾病的诊断和治疗。
2、聚合酶链式反应（PCR）：PCR是一种用于快速、灵敏地扩增特定DNA片段的分子生物学技术。
通过PCR，我们可以将微量的DNA片段进行数百万倍的扩增，从而可以进行后续的分析和检测。
PCR技术广泛应用于基因克隆、突变分析、疾病诊断等领域。
3、生物芯片技术：生物芯片是一种高密度DNA阵列技术，可以同时对大量基因进行检测和分析。
生物芯片技术可用于基因表达谱分析、基因多态性研究、疾病预测和诊断等。
4、质谱技术：质谱技术是一种用于分析生物样品中分子质量和组成的技术。
通过质谱技术，我们可以对蛋白质、多糖、脂质等生物分子进行定性和定量分析。
质谱技术广泛应用于蛋白质组学研究、药物发现、疾病诊断等领域。
5、细胞荧光染色技术：细胞荧光染色技术是一种用于观察细胞内生物分子活性的技术。
通过荧光染料对目标分子进行标记，我们可以在显微镜下观察到细胞内分子的分布和活性。
细胞荧光染色技术广泛应用于细胞信号转导、药物筛选等领域。
以上仅是分子生物学领域中的几种常用检测技术，实际上还有许多其他的实验技术和方法如核磁共振技术、双向电泳、免疫沉淀等等，这些技术的发明和发展都为分子生物学的研究提供了强有力的支持。
各种技术的选择和使用主要取决于研究目的和研究样本的类型。
随着科学技术的发展，未来的分子生物学检测技术将更加灵敏、高效和个性化。
分子生物学常用技术及其应用分子生物学是一门研究生物大分子结构和功能的科学，包括DNA、RNA 和蛋白质等。
分子生物学技术
分子生物学技术引言分子生物学技术是指利用分子生物学方法和工具进行生物学研究和应用的技术手段。
随着分子生物学的发展，许多可靠、高效的分子生物学技术被广泛应用于基础研究、医学诊断、基因工程、药物开发等领域。
本文将介绍几种常见的分子生物学技术，并讨论其原理、应用以及前景。
PCR技术PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种通过不断复制目标DNA片段的技术。
它是由美国科学家凯瑟琳·莫尔斯于1983年首次提出的。
PCR技术利用一个DNA聚合酶、一对引物和一种DNA模板，通过不断重复的三步循环反应来复制目标DNA片段。
这种技术可以快速、高效地产生大量特定DNA片段，广泛应用于基因克隆、基因检测、疾病诊断等领域。
PCR技术的原理是利用DNA聚合酶将两个引物结合到DNA模板的两端，然后在适当的温度下进行DNA的变性、连接和扩增。
在循环反应的每一轮中，引物会结合到模板DNA的两端，聚合酶会合成新的DNA链。
通过连续反复的循环反应，目标DNA片段的数量呈指数增长。
PCR技术的应用非常广泛。
在基因克隆方面，PCR技术可以快速地从全基因组DNA中扩增出目标基因，用于构建基因工程载体。
在基因检测方面，PCR技术可以用于检测基因突变、基因拷贝数变异等，对遗传病的诊断具有重要意义。
此外，PCR技术还可以用于病原微生物的检测、药物开发等领域。
PCR技术的未来发展方向主要包括提高扩增效率和准确度，减少扩增偏差，缩短反应时间等。
同时，与其他分子生物学技术的组合应用也是一种发展趋势，如与DNA测序技术的结合可以实现快速而准确的基因分型。
DNA测序技术DNA测序技术是指通过分析DNA序列来确定DNA中碱基的排列顺序的技术。
DNA测序技术是20世纪70年代末到80年代初发展起来的，它的发展使得人们能够更深入地研究DNA的结构和功能，对遗传病的研究也产生了深远的影响。
DNA测序技术的原理是利用DNA聚合酶和DNA链终止剂，在DNA复制过程中有选择地将碱基添加到正在合成的DNA链上。
分子生物学技术
分子生物学技术分子生物学技术是研究和应用分子生物学的一系列实验方法和技术。
这些技术广泛应用于基因组学、蛋白质研究、遗传工程、疾病诊断和治疗等领域。
以下是一些常见的分子生物学技术：1. PCR（聚合酶链反应）：PCR是一种体外扩增DNA的技术，通过引物与DNA片段的特异性连接，并利用聚合酶酶活来合成新的DNA链，从而扩增目标DNA序列。
2. 胶体电泳：胶体电泳是一种常用的分离和分析DNA、RNA和蛋白质的方法。
该技术通过将目标分子置于电场中，利用其电荷差异、大小差异或空间结构差异而进行分离。
3. 基因克隆：基因克隆是将目标DNA片段插入载体DNA的过程。
常用的载体包括质粒、噬菌体等。
通过基因克隆，可以将目标基因表达在宿主细胞中，从而研究基因功能和产生蛋白质。
4. DNA测序：DNA测序是确定DNA序列的方法。
常用的测序方法包括Sanger测序和高通量测序（如Illumina 测序），通过读取DNA碱基的顺序来确定DNA的序列。
5. 基因组学：基因组学是研究基因组结构、功能和演化的学科。
通过高通量测序技术，可以在较短时间内测序大量基因组DNA，进一步了解生物的遗传信息。
6. 蛋白质表达和纯化：蛋白质表达和纯化是研究蛋白质结构和功能的关键步骤。
通过基因工程技术，将目标基因转入表达宿主中，使其表达目标蛋白质，并通过柱层析等技术纯化目标蛋白质。
7. RNA干扰（RN）：RNA干扰是一种通过转染或合成小RNA来沉默目标基因的技术。
RN可用于研究基因功能、筛选潜在药物靶点等。
8. 基因编辑：基因编辑是利用CRISPR-Cas9等基因编辑工具来对基因组进行定点修饰的技术。
基因编辑技术可以用于研究基因功能、治疗遗传病等。
这些技术使得分子生物学研究更加精确、高效和全面，为生命科学的发展和应用提供了基础。
常用分子生物学技术的原理及应用
常用分子生物学技术的原理及应用1.聚合酶链反应（PCR）：PCR是一种在体外快速合成特定DNA片段的技术。
它的原理是基于DNA的逐步复制。
PCR需要DNA模板、DNA聚合酶、引物和dNTPs等反应物。
通过多个循环的高温退火、DNA扩增和DNA合成过程，可以在短时间内扩增指定的DNA片段。
应用：PCR在许多领域得到广泛应用。
它可用于基因组学、遗传学、医学诊断、病毒学等领域。
例如，PCR可以用于检测基因突变、诊断遗传疾病、鉴定病原体等。
2.DNA测序：DNA测序是一种确定DNA序列的技术。
目前主要有Sanger测序和高通量测序两种方法。
（1）Sanger测序原理：Sanger测序是一种经典的测序方法，基于DNA的DDN反应。
它利用碱基的链终止效应，使DNA合成过程在产生溶胶碱基的情况下中断，从而得到不同长度的DNA片段。
通过电泳分离并测定不同长度的DNA片段，可以确定DNA序列。
（2）高通量测序原理：高通量测序技术，如Illumina测序、Ion Torrent测序和Pacific Biosciences测序等，通过以平行方式同时测序多个DNA片段，大大提高了测序效率和数据产量。
应用：DNA测序技术在基因组学、癌症研究、生物进化等方面具有广泛应用。
它可以用于发现新基因、研究遗传变异、揭示物种演化等。
3.基因克隆：基因克隆是将DNA片段插入载体（如质粒）中并转化到细胞中，从而实现特定基因的复制和表达。
基因克隆包括DNA片段的剪接、连接、转化和筛选等步骤。
应用：基因克隆技术是分子生物学研究的基础。
它可以用于制备重组蛋白、构建转基因植物和动物、研究基因功能等。
4.蛋白质表达：蛋白质表达是将基因转录为mRNA，再通过翻译作用合成蛋白质的过程。
蛋白质表达技术包括原核和真核表达系统。
（1）原核表达系统：原核表达系统常用的有大肠杆菌表达系统和酵母表达系统。
这些系统可以用于高效表达蛋白质，并且易于操作。
（2）真核表达系统：真核表达系统是利用真核细胞如CHO、HEK293等表达蛋白质。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
为使核酸牢固结合在膜上，通常还将点样 后的膜进行80℃真空烘烤2h。 应用斑点印迹技术，可在一张膜上同时进 行多个样品的检测，操作简便、快速，在 临床诊断中应用较广。适合进行特定基因 的定性及定量研究，但不能鉴定所测基因 的分子量。(2) Southern印迹(Southern blot) 这是指将DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离 后转移到固相支持物上的过程。常规处理 如下，先用限制性内切酶对DNA样品进行 酶切处理，经琼脂糖凝胶电泳将
用探针对细胞或组织切片中的核酸杂交并 进行检测的方法称之为核酸原位杂交。某 特点是靶分子固定在细胞中，细胞固定在 载玻片上，以固定的细胞代替纯化的核酸， 然后将载玻片浸入溶有探针的溶液里，探 针进入组织细胞与靶分子杂交，而靶分子 仍固定在细胞内。例如。可用特异性的细 菌、病毒的核酸做为探针对组织、细胞进 行原位杂交，以确定有无该病原体的感染 等。原位杂交不需从组织中提取核酸，对 于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感 性，在临床应用上有独特的意义。
碱基的缺失或插入尤为适用2.按标记物划 分 有放射性标记探针和非放射性标记探 针两大类。放射性标记探针用放射性同位 素做为标记物。放射性同位素是最早使用， 也是目前应用最广泛的探针标记物。常用 的同位素有32P、3H、35S。其中，以32P应用 最普遍。放射性标记的优点是灵敏度高， 可以检测到Pg级；缺点是易造成放射性污 染，同位素半衰期短、不稳定、成本高等。 因此，放射性标记的探针不能实现商品化。 目前，许多实验室都致力于发展非放射性 标记的探针。
（三）基因的结构
基因的编码区（即转录区）是连续不断的 序列，包括一个起始密码子ATG和一个终 止密码子TAA。编码区的两侧是转录而不 转译的侧翼序列区，其中5`非转译区简称 5`UTR，含有一个核糖体结合位点及一个 转录起始信号；3`非转译区简称3`UTR含有 一个转录终止信号。 无论是真核的基因还是原核的基因，都可 划分成编码区和非编码区两个基本组成部 分。 编码区含有大量的可以被细胞质中转译机 器阅读的遗传密码，包括起始密码子（通
降温复性。）核酸探针是指带有标记物的 已知序列的核酸片段，它能和与其互补的 核酸序列杂交，形成双链，所以可用于待 测核酸样品中特定基因序列的检测。每一 种病原体都具有独特的核酸片段，通过分 离和标记这些片段就可制备出探针，用于 疾病的诊断等研究。
(一) 核酸探针的种类 一 1.按来源及性质划分 可将核酸探针分为 基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针 和人工合成的寡核苷酸探针等几类。 作为诊断试剂，较常使用的是基因组DNA 探针和cDNA探针。其中，前者应用最为广 泛，它的制备可通过酶切或聚合酶链反应 (PCR)从基因组中获得特异的DNA后将其克 隆到质粒或噬菌体载体中，随着质粒的复 制或噬菌体的增殖而获得大量高纯度的 DNA探针。
因此，顺反子概念表明：基因不是最小单 位，它仍然是可分的；并非所有的DNA序 列都是基因，而只有其中某一特定的多核 苷酸区段才是基因的编码区。 每一个顺反子就是一段核苷酸序列，或者 是一个基因的DNA或RNA单元，它编码一 种完整的多肽链。顺反子是功能单位，它 是由许多可以突变的位点组成的，而这些 位点之间又可以发生交换。 多体蛋白质（multimeric proteins）：由数 多体蛋白质 个亚基组成的蛋白质。
2. RNA探针 全基因RNA探针可用RNA病毒的基因标记 即可；由DNA转录出探针RNA，可由RNA 聚合酶获得大量高纯度的RNA，其灵敏度 比DNA探针高出10多倍。
(三) 核酸杂交 杂交技术有固相杂交和液 三 相杂交之分。固相杂交技术目前较为常用， 先将待测核酸结合到一定的固相支持物上， 再与液相中的标记探针进行杂交。固相支 持物常用硝酸纤维素膜(nitroce，简称NC膜)或尼龙膜(nylon membrane)。固相杂交包括膜上印迹杂交和 原位杂交。前者包括三个基本过程：第一， 通过印迹技术将核酸片段转移到固相支持 物上；第二，用标记探针与支持物上的核 酸片段进行杂交；第三，杂交信号的检测。
目前应用较多的非放射性标记物是生物素 (Biotin)和地高辛(digoxigenin)。二者都是半 抗原。生物素是一种小分子水溶性维生素， 对亲和素有独特的亲和力，两者能形成稳 定的复合物，通过连接在亲和素或抗生物 素蛋白上的显色物质(如酶、荧光素等)进行 检测。地高辛是一种类固醇半抗原分子， 可利用其抗体进行免疫检测，原理类似于 生物素的检测。地高辛标记核酸探针的检 测灵敏度可与放射性同位素标记的相当， 而特异性优于生物素标记，其应用日趋广 泛。
储藏在基因中的遗传信息分转录和转译两 步进行表达，这种遗传信息从DNA到RNA 再到蛋白质的流向，在所有的细胞类型中 都是受到高度调节的，同时在有些情况下 也是严格协同的。基因表达的此种严格调 控机理，保证细胞不会浪费能量用于合成 它所不需要的基因产物。 从基因研究上，操纵子概念比顺反子又进 了一步。即基因不但在结构上是可分的， 而且在功能上也是有分工的。同时，有的 基因控制蛋白质产物的合成，而有的基因 并没有直接的产物。 操纵子模型
将 RNA进行反转录，所获得的产物即为 cDNA。cDNA探针适用于RNA病毒的检测。 cDNA探针序列也可克隆到质粒或噬菌体中， 以便大量制备。将信息RNA(mRNA)标记也 可作为核酸分子杂交的探针。但由于来源 极不方便，且RNA极易被环境中大量存在 的核酸酶所降解，操作不便，因此应用较 少。用人工合成的寡聚核苷酸片段做为核 酸杂交探针应用十分广泛，可根据需要随 心所欲合成相应的序列，可合成仅有几十 个bp的探针序列，对于检测点突变和小段
（二）核酸探针的制备 1. DNA探针制备 （1）以病原细胞核或病毒中提取的特异性 DNA，用理化学方法将其纯化，然后再用 限制性核酸酶将DNA切割成若干片段，电 泳回收目的DNA； （2）酶促反应合成法，即从病原中提取 mRNA，在反转录酶作用下合成互补结构 的DNA（cDNA）； （3） 化学合成法，以单核苷酸为原料， 人工合成DNA的某一片段。
溴化乙锭（EB）染色，然后分析DNA酶切 片段的数目、迁移率等分析微生物的变异 现象、鉴定毒株、分型及了解基因结构和 进行流行病学研究等等。 方法： 1.DNA抽提 2.DNA 酶切 3.电泳 4.染色 5.观察、照相 6.分析 7.酶切图谱
核酸探针技术
前言
(一) 核酸探针的种类 一 (二) 核酸探针的制备 (三) 核酸杂交 三 (四) 核酸探针技术在动物检疫中的应用 四
前言
化学及生物学意义上的探针(probe)，是指 与特定的靶分子发生特异性相互作用，并 可被特殊的方法探知的分子。抗体-抗原、 生物素-抗生物素蛋白、生长因子-受体的相 互作用都可以看作是探针与靶分子的相互 作用。 核酸探针技术原理是碱基配对。互补的两 条核酸单链通过退火形成双链，这一过程 称为核酸杂交。（基本过程是：加热变性
同型多体蛋白质： 同型多体蛋白质：在多体蛋白质中，如果 所有的亚基都是同样的，这种蛋白质就属 于同型多体（homomultimer）蛋白质，由 一种基因编码。 异型多体（ 异型多体（heteromultimer）蛋白质：亚 ）蛋白质： 基各不相同的蛋白质，由多种基因编码。 如血红蛋白。
（二）基因的碱基顺序与蛋白质的氨 基酸顺序
常是AUG）和终止密码子（UAA，UAG或 UGA）。非编码区结构中的5`末端非转译 区（5`UTR）和3`末端非转译区（3`UTR）， 对于基因遗传信息的表述是必要的，但它 们都不会被转译成多肽序列。 真核基因与原核基因的区别： 事实上，真核生物的基因都是以单顺反子 的形式存在，因此它们编码的也都是单基 因产物。而大肠杆菌类原核生物往往是多 顺反子，它转录的是一种大分子量的 mRNA，可同时编码两种甚至数种的基因 产物。
1. 中心法则（central dogma）：既遗传信 息是从DNA流向RNA，再由RNA流向蛋白 质 而遗传信息从DNA直接到蛋白质的传递， 只是一种理论上的可能性，迄今尚未得到 证实。
2. 密码子：每3个碱基编码一种氨基酸，就 会编码出64种（43=64）不同的氨基酸。蛋 白质分子是由20种不同的氨基酸构成的， 因此，1种氨基酸可有几个不同的密码子， 既3个碱基甚至更多的碱基编码一种氨基酸 是必要的。 遗传密码是否重叠？研究证实：遗传密码 是不重叠的。 三联体之间是否存在着“逗号”？研究证 实：碱基的阅读是从一个固定的起点按序 进行的，不存在有什么“逗号”的问题。 …QABCQDEFQGHIQJKLQ…
近年来液相杂交技术有所发展。液相杂交 与固相杂交的主要区别是不用纯化或固定 的靶分子，探针与靶序列直接在溶液里作 用。液相杂交步骤有所简化，杂交速度有 所提高，增加了特异性和敏感性，但与临 床诊断所要求的特异性和敏感性还有一定 的距离。 各种杂交技术中，膜上印迹杂交技术应用 最为广泛，它由以下三个基本过程组成。 1.核酸印迹技术 (1) 斑点印迹(Dot-blot) 将待测核酸样品变 性后直接点样在膜上，称之为斑点印迹。
二、核酸探测技术
（一）指纹图谱 （二）核酸分子杂交
（一）、指纹图谱
指纹图谱： 指纹图谱：即核酸酶切图谱，对生物的蛋 白质、DNA和RNA进行分析的电泳图、杂 交放射性自显影图等。在微生物研究上， 主要是用限制性内切酶（ERA）对病毒、 细菌DNA进行酶切分析的图谱。 原理： 原理：在微生物（细菌）细胞中有1种限制 性内切酶类（II，称为RE），能特异性的 识别和切割DNA链上特定的一段DNA片段， 这类酶广泛应用于基因工程的各个方面。 ERA就是用RE消化病毒或细菌的DNA或质 粒，将消化物于琼脂凝胶中电泳分离，经
（四）基因的表达与调控
结构基因(structural gene)：编码细胞成份， 如代谢酶类、转运蛋白质和细胞骨架成份 等的基因。 调节基因（regulatory gene)：编码控制其他 基因表达的RNA或蛋白质产物的基因。 操纵基因（operator): 指接受来自调节基因 合成的调节蛋白的作用，使结构基因转录 活性得以抑制的特定的DNA区段，也称为 控制单元。