线粒体膜电位(MMP)检测的具体步骤及方法

线粒体膜电位(MMP)检测的具体步骤及方法

一、技术简介

大量的研究表明线粒体与细胞凋亡密切相关，其中线粒体跨膜电位（MMP）的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件之一。它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体跨膜电位崩溃，则细胞凋亡不可逆转。

JC-1是一种碳氰化合物类阳离子荧光染料，可作为检测线粒体跨膜电位指示剂。JC-1在细胞内以聚合体和单体两种不同的物理形式存在，分别处于不同的荧光发射峰。当JC-1 浓度低或膜电位水平低时，主要以单体形式存在，激发波长为527nm，呈绿色荧光；当JC-1浓度升高或线粒体膜电位水平较高时，形成聚合物，发出红色的荧光，激发波长为590nm。当细胞发生凋亡时，线粒体跨膜电位被去极化，JC-1从线粒体内释放，红光强度减弱，以单体的形式存在于胞质内发绿色荧光，根椐这一特征就可以检测线粒体膜电位的变化。

二、实验流程

1. 细胞培养。

2. 用适当的方法诱导细胞凋亡，同时设立阴性依照组合阳性对照组，收集细

胞。

3. 用PBS洗涤细胞三次，收集不多于1×106的细胞。

4. 取100μL 10×Incubation Buffer加900μL灭菌去离子水稀释成

1×Incubation Buffer，混匀并预热至37℃。

5. 吸取500μL 1×Incubation Buffer，加入1μL JC-1，涡旋混匀配成JC-1

工作液。

6. 取500μL JC-1工作液将细胞均匀悬浮，37℃，5% CO2的培养箱中孵育

15~20min。

7. 室温离心（2000rpm, 5min）收集细胞，用1×Incubation Buffer洗两次。

8. 吸取500μL 10×Inc ubation Buffer重新悬浮细胞。

9. 流式细胞仪检测，分析。