第五章 亲和层析
第五节 亲和层析
早在 1910 年就有人用不溶性淀粉选择吸附、 提纯淀粉酶，这是最早的基于生物特异性进行 分离纯化的实例。事实上几乎所有的生物活性 物质都存在类似于淀粉酶与淀粉间的亲和作用， 如酶与底物（包括酶的竞争性抑制剂和辅助因 子）、抗原与抗体、激素与受体、核酸中的互 补链、多糖与蛋白复合体等。这种利用生物大 分子特异亲和力而设计的层析技术称为亲和层 析（密切关系套色版）。在亲和层析中起可逆 结合的特异性物质称为配基，与配基结合的层 析介质称为载体。
五、亲和色谱操作条件的选择
1．吸附条件的选择 (1）吸附反应条件 吸附条件最好是自然状态下 配体与目的分子之间反应的最佳条件，如缓冲液中 盐的种类、浓度及pH等条件。如果对配体和配基 之间的结合情况不太了解，就必须对盐种类、浓度 和缓冲液的pH进行条件摸索。如果对配体和蛋自 的结合情况比较了解，可以人为设定反应条件，促 进吸附。例如，金黄葡萄球菌蛋白A和免疫球蛋白 IgG之间的结合主要是疏水作用，可以通过增大盐 浓度、调节pH来增强吸附。 (2）流速的控制 流速也是影响吸附的一个因素 流速不能太快；否则，影响吸附程度。
2、常用载体
（1）纤维素 它是自然界中数量最大的大分子生物材料，取材 十分方便。但由于纤维素结构紧密，均一性差， 不利于大分子的渗入。活化后因带有电荷，非特 异性吸附力较强，加上空间位阻等原因，其应用 不如凝胶载体广泛。目前主要用于分离与核酸有 关的物质，如用寡聚脱氧胸腺核苷酸纤维作固定 相分离细胞提取液中的 mRNA 。 市售纤维素商品为无定形微纤维、微晶纤维素以 及珠状纤维素。
在亲和层析中常用小分子化合物 (如小分子底物、辅 酶、抑制剂等) 作为配基亲和吸附大分子物质 (如酶 等) 。当配基小分子与载体相连接时，载体所形成的 空间位阻会影响到配基与亲和物的密切吻合，往往 不能形成有效的吸附。活化后的琼脂糖要求与带游 离氨基的配基相连接，如果配基不具有游离的氨基， 就无法与载体相连接。
AC_XP
第七节 应 用
1. 2. 3. 4. 5. 6.
抗原、抗体的纯化 受体蛋白的纯化 糖蛋白的纯化 同工酶的纯化 亲和标记肽的纯化 核酸的纯化
|-O – CH2 – CH – CH2 – NH – Pro. | OH
二．手 臂 的连 接
接臂的方法： 1.手臂先接配体后偶联 2.手臂先偶联后接配体 NH2(CH2)nNH2 n=2 - 12 手臂的类型： 接手臂：
三． 蛋白质偶联的特殊问题
在较低 pH 偶联可减少蛋白质与活化琼脂糖的多 点结合。
5.多孔玻璃 ：物理性能好，有非特异性吸附。
Scanning electron micrograph of an agarose gel
Magnification x 50,000
Ref: Anders S. Medin, PhD Thesis, Uppsala University 1995
Chroatography media
1.
E = 乳糖合成酶A蛋白 B = α- 乳清蛋白 E + A EA + B A = N – 乙酰 – D – 氨基葡萄糖
EAB
负洗脱
两元专一性三元专一性的源自亲和层析洗脱设计正洗脱 A = NAD+ B = AMP C = Py E = LDH
五、化学裂解
连二亚硫酸硫酸钠还原、高氯酸、盐酸胍 三氯醋酸、尿素
核酸：互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶
、
结合蛋白 激素及维生素：受体、载体蛋白 细胞：细胞表面特异蛋白、外源凝集素
三、配体的浓度
一般使用较高的固定化配体浓度
当配体亲和力高，且本身带电则固定化 配体浓度须降低
亲和层析_精品文档
利于酸性蛋白的偶联。
36
5、CM-生物胶A、亲和胶202和亲和胶102 CM Bio-Gel A，无“手臂” 的羧基衍生物； Affi-Gel 102具有6个原子“手臂”，未端为氨基。 Affi-Gel202具有10个原子的“手臂”，未端具有羧基；
（二）、空间障碍的影响
空间位阻。 对于分子大的配体以及小分
子配基更明显。
“手臂”，增加与载体相连 配基的活动度，减轻载体的 立体障碍。
常用的“手臂”多为烃链。
40
（三）、配基与载体的结合位点的影响
多肽或蛋白质等大分子配基 须控制偶联反应条件，使它以最少的功能基
团与载体连接。 保持蛋白质原有的高级结构，使亲和吸附剂
（2）当ESI稳定性与EI相同时，I的存在并不 影响E对S的结合，非竞争性效应。
（3）反竞争性效应，即ESI比EI稳定，I使E与 S结合更紧密（负洗脱） 。
55
反竞争性效应
56
亲和层析中配基的选择和洗脱条件
57
（三）、亲和吸附剂的再生
用缓冲液充分平衡后即可重复使用。 亲和力下降，非特异吸附增加，大多由
联。
33
34
3、环氧活化型Sepharose 6B
由亲水“手臂”与Sepharose 6B载体 通过醚链形成的衍生物。
用于小分子配基的固定化。 用于偶联脂多糖、蛋白等大分子配基。
35
4、活化型亲和胶10和15
由N-羟琥珀酰亚胺与琼脂糖衍生物形成的活化酯。 Affi-Gel10的“手臂”长为10个碳原子，产生一些负电荷，有
择性。
48
（二）、亲和层析的洗脱
亲和层析原理和方法
亲和层析原理和方法亲和层析是一种分析方法，通过利用物质之间的亲和性来分离和分析目标物质。
它基于物质之间的特异性亲和作用，通过将目标物质与具有亲和性的固相材料结合，实现目标物质的富集和分离。
亲和层析的原理是基于生物分子之间的亲和性。
在生物体内，许多分子之间存在着特定的亲和性相互作用。
例如，抗体与抗原之间的结合就是一种典型的亲和性相互作用。
利用这种亲和性原理，可以将含有特定抗原的样品与具有相应抗体的固相材料结合，然后通过洗脱的方式将目标物质从固相材料上分离出来。
亲和层析的方法包括亲和层析柱和亲和层析片。
亲和层析柱是将具有亲和性的固相材料填充在柱子中，样品通过柱子时，目标物质会与固相材料结合，非目标物质则通过柱子。
然后可以通过洗脱的方式将目标物质从固相材料上分离出来。
亲和层析片则是将具有亲和性的固相材料固定在薄膜上，样品与薄膜接触时，目标物质会与固相材料结合，非目标物质则被排除。
然后可以通过洗脱的方式将目标物质从薄膜上分离出来。
亲和层析方法具有许多优点。
首先，亲和层析可以选择性地富集目标物质，从而降低了样品中其他干扰物质的影响。
其次，亲和层析具有高灵敏度和高分辨率的特点，可以检测到低浓度的目标物质。
此外，亲和层析还具有快速、简单和可重复性的优点，适用于大规模的样品分析。
亲和层析在许多领域中得到了广泛的应用。
在生物医学领域，亲和层析可以用于分离和富集特定蛋白质或生物分子，以便进行后续的分析和研究。
在药物研发中，亲和层析可以用于筛选和分离具有特定药物靶点亲和性的化合物。
在环境监测和食品安全领域，亲和层析可以用于检测和分离目标污染物或有害物质。
亲和层析是一种基于亲和性相互作用的分析方法，通过选择性地富集和分离目标物质，实现了样品的准确分析。
亲和层析方法具有许多优点，并在各个领域中得到了广泛应用。
未来随着技术的不断发展，亲和层析方法将进一步完善和应用于更多的领域，为科学研究和工业生产提供更多的可能性。
亲和层析的原理及应用
亲和层析的原理及应用1. 什么是亲和层析？亲和层析是一种分离和纯化生物分子的技术方法。
它基于生物分子之间的特异性相互作用，例如抗原与抗体的结合。
亲和层析通过利用这种特异性相互作用，将目标分子从混合物中有效地分离出来。
亲和层析可以用于纯化蛋白质、分离细胞、筛选药物等多种应用。
2. 亲和层析的原理亲和层析的原理基于生物分子之间的相互作用。
在亲和层析中，通常使用的是一对具有特定相互作用的分子，例如抗原与抗体、配体与受体等。
这对分子中的一个部分被固定在固相介质上，而另一个部分则与目标分子发生特异性相互作用。
亲和层析的步骤包括：•预处理：选择适当的固相介质，并将其与特异性相互作用的分子配对。
固相介质可以是固定在柱子或颗粒上的化学物质。
•样品加载：将待分离的混合物样品加到预处理后的固相介质上。
目标分子与固相介质上的特异性配对分子发生结合。
•洗涤：用缓冲液将非特异性结合的物质洗掉，以减少背景噪音。
•洗脱：用特定的洗脱液冲洗固相介质，破坏特异性相互作用，使目标分子从固相介质上解离出来。
•收集纯化物：通过收集洗脱液中的目标分子来获取纯化物。
3. 亲和层析的应用亲和层析在生物科学研究和工业领域中得到了广泛的应用。
以下是亲和层析的一些常见应用：3.1 蛋白质纯化亲和层析可以用于纯化蛋白质。
通过将特异性配对的分子与待分离蛋白质结合，然后用洗脱液洗脱，可以将目标蛋白质从混合物中高效地纯化出来。
亲和层析在蛋白质研究和生物制药等领域具有重要的应用价值。
3.2 细胞分离亲和层析可以用于分离特定种类的细胞。
通过将细胞与特异性配对的分子结合，然后用洗脱液洗脱，可以将目标细胞从混合物中分离出来。
这在细胞学研究和细胞治疗等领域具有重要的应用价值。
3.3 药物筛选亲和层析可以用于筛选药物候选物。
通过将潜在药物分子与特异性配对的分子结合，然后用洗脱液洗脱，可以筛选出具有特定相互作用的药物候选物。
这在药物研发过程中有着重要的应用价值。
3.4 DNA/RNA纯化亲和层析也可以用于DNA/RNA的纯化。
亲和层析AffinityChromatography
29
a
亲和层析法分离豌豆凝集素
30
a
[原理] 亲和层析技术利用豌豆凝集素可与 葡聚糖凝胶发生特异性结合，再用含葡萄 糖的氯化钠溶液将豌豆凝集素洗脱下来。 比较豌豆凝集素和杂蛋白对兔红细胞凝集 作用的差异来进行鉴定。
31
a
[器材] 1.层析柱 2.恒温孵育箱 3.反应板
32
a
[试剂] 1.1mol/L NaCl洗脱液 2.0.2mol/L葡萄糖NaCl洗脱液
结构研究 4.纯化人工合成的多肽和蛋白质 5.解释酶作用机理
23
a
Figure 1. Loading affinity column.
24
a
Figure 2. Proteins sieve through matrix of affinity beads.
25
a
Figure 3. Proteins interact with affinity ligand with some binding loosely and others tightly.
配 基 Ligand: 亲 和 层 析 中 能 被 某 一 生 物大分子识别和可逆结合的生物专一性物 质。
基质Matrix(载体):亲和层析中与配基 共价结合,使其固相化的物质。
7
a
吸附 (Adsorption)
解吸 (Elution )
8
a
9
a
三、载体的选择
应具备的特性： 1.有丰富的可供活化的化学基团，并在温 和条件下能与配基共价结合。 2.惰性的，非专一性吸附无或足够小。 3.多孔网状结构。 4.良好的机械性能，具有好的液体流动性。 5.有较好的物理和化学稳定性。
3
第五章亲和层析分离技术详解
多糖基质
环氧化物法
当前21页，总共43页。
多糖基质
苯醌法
当前22页，总共43页。
多糖基质 其他方法——甲苯磺酰氯
当前23页，总共43页。
聚丙烯酰胺基质
戊二醛法
当前24页，总共43页。
聚丙烯酰胺基质
肼法
当前25页，总共43页。
多孔玻璃与硅胶
当前26页，总共43页。
亲和配基固定偶联的密度的测定
➢ Con A 亲和层析 糖蛋白：免疫球蛋白，IgM 低密度酯蛋白
➢ 肝素亲和层析
当前40页，总共43页。
5.4.6 共价色谱
原理 （a）吸附过程；（b）洗脱过程；（c）再生过程
当前41页，总共43页。
共价介质的合成
引入硫醇基
引入双硫键
当前42页，总共43页。
共价色谱的吸附和解吸
1、上样预处理 2、吸附
当前6页，总共43页。
亲和层析分离技术
➢ 亲和层析的理论 ➢ 亲和介质的制备 ➢ 常见的亲和层析
当前7页，总共43页。
5.2 亲和层析的理论
当蛋白质在非凝胶相和凝胶相之间达到平衡
E K d E 1 L M K lm E LM
Kd
E1 E
Klm EE1LLM M
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N N
N Cl
NH OH R
OH3S
SO3H
HO3S
SO3H
其中R为:
SO3H NN
当前36页，总共43页。
染料亲和层析
染料配基和蛋白质作用大小排列
第一组
第二组
第三组
第四组
第五组
Procion Blue MX-7RX
Cibacron Blue 2-RA
第五章亲和层析
Affinity Chromatography
第五章亲和层析
第一节 亲和层析概述
亲和层析:利用生物分子间专一的亲和力而 进行分离的一种层析技术
第五章亲和层析
历史
• 1910年就有人用不溶性淀粉选择吸附、提纯淀粉 酶，这是最早的基于生物特异性进行分离纯化的 实例。
• 但由于技术上的限制，主要是没有合适的固定配 体的方法，所以在实验中没有广泛的应用。
金属离子如锌和铜，已发现能很好地与组氨酸的咪唑基及 半胱氨酸的巯基结合。含有不同数量的这些基团的蛋白质 可以通过金属离子亲和层析得到分离。
第五章亲和层析
第五章亲和层析
拟生物亲和层析
• 定义：是利用部分分子相互作用，模拟生物分子 结构或某特定部位。以人工合成的配体ion )
第五章亲和层析
一、亲和层析基本原理
基本原理：将具有亲和力的两个分子中一个固定 在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和 可逆性，对另一个分第子五章进亲和行层析分离纯化。
混合蛋白样品
平衡液
带有配体的树脂 珠（或胶粒）
含配体溶液
洗下未结合的蛋白 第五章亲和层析
收集目的蛋白
第五章亲和层析
三、亲和层析的类型
• 生物亲和层析 • 免疫亲和层析 • 固定化金属离子亲和层析 • 拟生物亲和层析
第五章亲和层析
生物亲和层析
• 利用自然界中存在的生物特异性相互作用 物质对的亲和层析。
• 通常具有高的选择性。 • 典型的物质对有酶-底物、酶-抑制剂、激素
-受体等。
第五章亲和层析
免疫亲和层析
第五章亲和层析
固定化金属离子亲和层析
• 固定金属离子亲和吸附剂（IMA）由载体，螯合 基和金属离子三部分组成，利用材料上固定的金 属离子与蛋白表面的组氨酸等残基配位结合，选 择性的吸附蛋白质 。
第5章亲和层析
第5章亲和层析第5章亲和层析一、亲和层析的特点：①待分离物质与配基专一性结合，分辨率高，操作简单，通过一次性操作即可得到较高纯度的分离物质。
②具有浓缩作用，可以从含量很低的溶液中得到高浓度的样品，有的纯化倍数达几千倍。
③利用生物学的特异性进行分离，所以分离条件比较温和，能够很好地保持样品原有的生物学性质。
二、基本原理：生物大分子的识别功能：①酶：底物、抑制剂底物类物；②抗体：抗原、病毒细胞；③激素：受体；④外源凝集素：糖蛋白、表面受体蛋白；⑤核酸：互补碱基链段、组蛋白。
1 配基：亲和层析介质的配基有很多，归纳起来主要有以下几类：①有机小分子类主要有苯基类、烷基类、氨基酸类、核苷酸类等。
②生物大分子类主要有酶类、抑制剂类、蛋白质、抗原抗体类等。
③染料主要有蓝色葡聚糖、荧光染料等。
2 载体：纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶。
3 活化剂：（最常用的几种活化剂）溴化氰(CNBr)、环氧氯丙烷、1，4-丁二醚、戊二醛、高碘酸盐等。
三、亲和层析介质的制备：1 配基的选择（配基必备条件）：①能与活化剂的活化基团发生偶联作用，偶联后不影响配基和目标分子的专一结合特性。
②专一亲和性要强，能有效地分离目标分子。
③配基与目标分子结合后，在一定条件下能够被解吸附，且不破坏目标分子的生物活性。
④在分离过程中配基与目标分子无空间阻碍。
常用的配基：①酶：底物、底物类似物、抑制剂、辅因子（辅酶、金属离子等）；②抗体----抗原、病毒、细胞、激素、维生素----受体蛋白、载体蛋白；③外源凝集素----多糖化合物、糖蛋白、细胞表面受体蛋白、细胞；④核酸----互补碱基链段、组蛋白、核酸聚合物、核酸结合蛋白。
2 载体的选择（理想载体的特性）：①不溶于水，但具有高度亲水性。
②具有多孔网状结构和良好的流动性和渗透性。
③机械性能良好，在一定静水压下不变形。
④有足够数量的化学基团与大量的配基相偶联。
亲和层析原理和方法
亲和层析原理和方法引言亲和层析是一种常用的分离纯化生物大分子的方法，广泛应用于生物工程、生物医学和生物化学等领域。
本文将介绍亲和层析的基本原理和常用方法。
一、亲和层析的基本原理亲和层析是利用化学结合的特异性，将目标分子与固定在层析柱上的亲和配体结合，从而实现目标分子的分离纯化。
其基本原理如下：1. 亲和配体选择性结合目标分子：亲和配体是一种具有特异性结合目标分子的生物大分子或化学物质。
通过选择合适的亲和配体，可以实现对目标分子的选择性结合。
2. 层析柱固定亲和配体：亲和配体通常通过共价键或非共价键的方法固定在层析柱的填料上。
固定亲和配体后，层析柱具有了对目标分子的特异性结合能力。
3. 样品溶液通过层析柱：样品溶液中含有目标分子和其他杂质分子。
当样品溶液通过层析柱时，目标分子会与层析柱上的亲和配体结合，而杂质分子则流经层析柱。
4. 目标分子的洗脱和回收：通过改变洗脱缓冲液的条件，可以使目标分子与亲和配体解离，从而实现目标分子的洗脱和回收。
二、常用的亲和层析方法亲和层析方法根据亲和配体的性质和结合方式的不同，可以分为多种不同的方法。
以下是几种常用的亲和层析方法：1. 金属离子亲和层析：利用金属离子与亲和配体之间的配位作用，实现对目标分子的选择性结合。
常用的金属离子包括Ni2+、Cu2+和Zn2+等。
2. 免疫亲和层析：利用抗体与抗原之间的特异性结合，实现对目标分子的选择性结合。
免疫亲和层析广泛应用于生物医学领域，用于分离纯化抗体和抗原。
3. 亲和色谱层析：利用染料、受体或配体等分子与目标分子之间的特异性结合，实现对目标分子的选择性结合。
常用的亲和色谱层析方法有离子交换层析、亲和柱层析等。
4. 亲和吸附层析：利用亲和吸附剂与目标分子之间的特异性结合，实现对目标分子的选择性结合。
常用的亲和吸附层析方法有亲和蛋白A/G层析、亲和葡萄糖层析等。
三、亲和层析的应用领域亲和层析作为一种常用的分离纯化方法，广泛应用于生物工程、生物医学和生物化学等领域。
第五章 亲和层析
3．配体结合量的测定
配体结合量：一般是用每毫升或每克贮存胶结合配体
的量表示的。如用mg/ml 表示。
测得的配体结合量，可作为决定亲和吸附剂实际用量
的参数。
具体测定方法有两种，即直接测定法和间接测定法。
•
•
(1) ① ② (2)
直接测定法 2，4，6—三硝基苯磺酸钠的颜色试验 根据配体的特性进行测定 间接测定法
亲和层析原理
生物分子之间特异性结合
抗原－－抗体
激素－－受体 酶－ － 底物、底物类似物、抑制剂、辅基 核酸－－互补链
第二节
亲和层析操作
配基
载体
一、载体的选择
理想的载体应满足下面的要求：
具有较好的物理化学稳定性 较多的活性基团 能够和配体稳定的结合 结构为均匀的多孔网状结构 与样品中的各个组分均没有明显的非特异性吸附
例如 实验现象： 葡萄球菌核酸酶经亲和标记物标记后，发现： 该标记物与酶活性中心的酪氨酸结合，
可导致酶活力丧失83％，剩余酶活力17％。
问题： 该实验的现象，
究竟是核酸酶的活性中心被结合后仍有17％的酶活力?
还是因为有少量的核酸酶未标记上而残存酶活力?
研究思路： 将标记和未标记的酶分离出来，进行活性检测。
蛋白质亲和层析中的合适配体
配体 待纯化的蛋白质 配体 待纯化的蛋白质
抗原
特定单克隆抗体或多 克隆抗体
特定抗原 免疫球蛋白 蛋白酶 磷酸酶 脱氢酶、激酶、聚合 酶、限制酶、干扰素 含生物素的酶
肝素
凝聚因子、脂酶、结 缔组织蛋白酶、DNA 聚合酶
胆固醇受体、胆固醇 结合蛋白 脂肪酸结合蛋白、白 蛋白 核苷酸结合蛋白、需 核苷酸的酶 糖蛋白 糖蛋白 凝集素、糖苷酶
亲和层析的原理
亲和层析的原理亲和层析是一种重要的生物分离技术，其原理基于生物分子之间的特异性相互作用。
在亲和层析中，利用生物分子之间的特异性结合，将目标蛋白或其他生物分子从混合物中分离出来，从而实现其纯化和富集。
亲和层析技术已经成为生物化学和生物技术领域中不可或缺的一部分，被广泛应用于蛋白质纯化、抗体富集、药物筛选等多个领域。
亲和层析的原理基于生物分子之间的特异性相互作用。
这种相互作用可以是蛋白质与配体之间的结合，也可以是抗体与抗原之间的结合。
在亲和层析中，通常会使用具有特定亲和性的配体或抗体来固定在固定相（如琼脂糖、琼脂糖珠等）上，然后将混合物通过固定相，利用目标分子与固定相上的配体或抗体之间的特异性结合来实现目标分子的分离。
亲和层析的选择性和特异性是其最大的优势之一。
通过选择合适的配体或抗体，可以实现对特定目标分子的高效分离和富集。
此外，亲和层析还可以在温和的条件下进行，避免了对目标分子的结构和活性产生不可逆的影响。
因此，亲和层析在生物分离领域中具有广泛的应用前景。
亲和层析的原理还可以进一步细分为不同的类型，如亲和色谱、亲和吸附等。
在亲和色谱中，通常会利用配体与目标蛋白质之间的特异性结合来实现分离；而在亲和吸附中，则是利用抗体与抗原之间的特异性结合来实现分离。
这些不同类型的亲和层析技术可以根据具体的实验需求进行选择和应用。
总之，亲和层析作为一种重要的生物分离技术，其原理基于生物分子之间的特异性相互作用。
通过选择合适的配体或抗体，可以实现对特定目标分子的高效分离和富集。
亲和层析技术在生物化学和生物技术领域中有着广泛的应用前景，对于促进生物分离和纯化技术的发展具有重要意义。
第五节 亲和层析
2、基质的活化
亲和层析的基本原理
亲和层析的基本原理
亲和层析是一种常用的蛋白质纯化技术，适用于从复杂的混合物中富集特定的目标蛋白质。
它基于蛋白质与其结合物之间的特异性相互作用，利用这种特异性相互作用将目标蛋白质从混合物中选择性地捕获和纯化。
亲和层析的基本原理是通过引入特定的配体，配体与目标蛋白质之间具有高亲和力。
这个配体可以是抗体、金属离子、亲和标签等，与目标蛋白质特定的结合。
通常，在亲和层析中，可以将这些配体固定在亲和树脂上。
具体操作过程中，混合物经过预处理得到样品溶液，然后与亲和树脂接触，目标蛋白质会与树脂上固定的配体结合。
其他非目标蛋白质则会被洗脱，目标蛋白质则保留在树脂上。
之后，通过改变环境条件，如pH值、盐浓度等，或者采用特定的洗脱剂，可以将目标蛋白质从树脂上洗脱下来。
亲和层析的基本原理主要依赖于配体与目标蛋白质之间的结合特异性。
通过合理选择合适的配体，可以实现对目标蛋白质的高选择性捕获和纯化。
亲和层析技术在生物医药领域中具有广泛的应用，可以用于快速纯化目标蛋白质，提高纯度和产量，为进一步的研究和应用打下基础。
总而言之，亲和层析的基本原理是通过引入特定的配体与目标蛋白质之间的高亲和力相互作用，实现对目标蛋白质的选择性捕获和纯化。
这种技术是一项重要的分离纯化工具，对于蛋白质研究和生物医药领域的应用具有重要意义。
亲和层析原理
亲和层析原理首先，亲和层析原理的基本原理是什么呢？亲和层析原理是利用生物大分子与其特异性亲和配体之间的非共价相互作用来实现目标生物大分子的选择性吸附和分离。
亲和配体通常是一种具有高亲和性的小分子化合物，它可以与目标生物大分子的特定结构域或功能基团结合，形成稳定的复合物。
在亲和层析过程中，混合物经过填料床层后，非特异性成分通过洗脱缓冲液被洗脱，而目标生物大分子则与亲和配体形成的复合物保持在填料上，最终通过改变条件将目标生物大分子从亲和填料上洗脱出来，实现其分离和纯化。
其次，亲和层析原理的应用范围非常广泛。
在生物技术领域，亲和层析技术被广泛应用于蛋白质、核酸、多肽等生物大分子的分离和纯化。
例如，利用亲和层析技术可以从复杂的细胞提取物中高效地纯化目标蛋白质，为后续的功能研究和结构分析提供高纯度的样品。
在制药工业中，亲和层析技术也被用于生物药物的生产和纯化过程中，例如单克隆抗体、重组蛋白等生物药物的制备工艺中都离不开亲和层析技术的应用。
此外，亲和层析原理还具有许多优点。
首先，亲和层析技术具有高选择性，可以实现对目标生物大分子的高效分离和纯化，避免了传统分离方法中多次反复操作的繁琐和耗时。
其次，亲和层析技术操作简单，不需要复杂的设备和操作条件，适用于实验室规模的小型分离和纯化工作。
最后，亲和层析技术还可以实现对生物大分子的非变性分离，保持目标生物大分子的天然构象和生物活性，有利于后续的功能研究和应用。
总的来说，亲和层析原理是一种基于生物大分子与特定亲和配体之间特异性相互作用的分离和纯化技术，具有广泛的应用前景和许多优点。
随着生物技术和制药工业的不断发展，亲和层析技术将在更多领域发挥重要作用，为生物大分子的研究和应用提供有力支持。
希望本文对您了解亲和层析原理有所帮助，谢谢阅读！。
亲和层析原理
亲和层析原理亲和层析原理是一种利用生物分子之间特异性相互作用进行分离的技术。
其基本原理是利用亲和配体和靶分子之间的特异性结合来实现对靶分子的选择性捕获和分离。
亲和配体可以是抗体、酶、亲和素等，而靶分子则是需要分离或纯化的生物大分子，如蛋白质、核酸等。
在亲和层析过程中，样品混合物首先通过填料，亲和配体与靶分子结合，非特异性的成分被洗脱，最后通过改变条件来实现靶分子的解离和纯化。
亲和层析原理在生物化学领域有着广泛的应用。
例如，在蛋白质纯化方面，可以利用蛋白质与亲和配体的特异性结合来实现对目标蛋白的高效纯化。
在药物研发中，亲和层析技术也被广泛应用于药物靶点的筛选和鉴定。
此外，亲和层析还可以用于分离和纯化DNA、RNA等核酸分子，具有广泛的应用前景。
与其他分离技术相比，亲和层析具有许多优点。
首先，它具有高选择性和高分辨率，可以实现对目标分子的高效分禶。
其次，亲和层析技术操作简单，易于扩展和自动化，适用于大规模生产。
此外，亲和层析技术还可以在温和的条件下进行，有利于保持靶分子的生物活性。
然而，亲和层析技术也存在一些局限性。
首先，亲和层析柱的填料选择和修饰需要针对不同的亲和配体和靶分子进行优化，成本较高。
其次，亲和层析柱的再生和重复使用也是一个挑战，需要综合考虑填料的稳定性和再生性。
综上所述，亲和层析原理是一种重要的分离和分析技术，具有广泛的应用前景。
通过对其基本原理、应用领域以及优缺点的了解，可以更好地应用亲和层析技术进行生物分离和纯化，推动生物医药和生命科学领域的发展。
《亲和层析》课件
流动相可以是缓冲液、有机溶剂等
亲和层析可以分离纯化生物大分子，如蛋 白质、核酸、多糖等
亲和层析的应用广泛，如蛋白质纯化、药 物筛选、生物检测等
03
亲和层析的实验流 程
亲和层析的实验准备
材料准备：亲和 层析柱、缓冲液、 样品、洗脱液等
设备准备：层析 仪、离心机、紫 外分光光度计等
亲和层析的应用领域
生物制药：分离 纯化蛋白质、多 肽等生物大分子
食品工业：分离 纯化食品添加剂、 天然色素等
环境监测：分离 纯化重金属离子、 有机污染物等
化学分析：分离 纯化有机化合物、 无机化合物等
亲和层析的基本原理
亲和层析是一种分离纯化生物大分子的方 法
原理：利用生物大分子与固定相之间的亲 和力进行分离
06
亲和层析的发展趋 势和展望
亲和层析技术的未来发展方向
提高分离效率：通过改进亲和层 析技术，提高分离效率，降低成 本
智能化发展：结合人工智能技术， 实现亲和层析的自动化、智能化
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扩大应用领域：将亲和层析技术 应用于更多领域，如生物制药、 食品加工等
环保化发展：采用环保材料和工 艺，降低对环境的影响，实现可 持续发展
亲和层析在生物医药领域的应用
蛋白质纯化： 分离、纯化蛋 白质，提高纯
度
药物筛选：筛 选药物，提高 药物研发效率
疫苗生产：分 离、纯化疫苗， 提高疫苗质量
诊断试剂：制 备诊断试剂， 提高诊断准确
性
亲和层析在环境监测领域的应用
土壤监测：检测土壤中的污 染物，如农药残留、重金属 等
大气监测：检测大气中的污 染物，如二氧化硫、氮氧化
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① 推算法 一般情况下，从加入配体的数量中减去配体与活化琼脂糖偶联后洗涤 出来的配体量，即可大致推算出配体的结合量。 ② 根据亲和吸附剂对被吸附物质的操作容量可计算配体的结合量 其方法有： 一是把亲和吸附剂装入柱(0.5cm×10cm)内，加入过量的欲分离大分 子物质，使其结合量达到最大，用适当的洗涤剂彻底洗去非专一性的物 质，然后再用特异的洗脱剂洗出欲分离的大分子物质。根据分离出的大 分子物质的量，计算出配体的结合量。 二是把少量纯品大分子物质陆续加到亲和层析柱中，直到饱和平衡为 止，根据上样量即可推算出配体的结合量。
第三节
亲和层析应用
一、纯化大分子物质
1） 抗原、抗体、抗原－抗体结合物（以 金黄色葡萄球菌蛋白为配体） 2）糖蛋白 以凝集素为配体 3）核酸 PolyU-Sepharose分离mRNA PolyA-Sepharose分离与mRNA特异结 合的蛋白质
二、研究酶的结构和功能
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在进行酶的结构与功能研究时，经常使用专一的化学 试剂改变酶的功能团。 这种操作往往会引起酶活力的不完全丧失，但是难以 确定残留的酶活力是代表残留的天然酶活力 ? 还是化 学试剂作用后酶的催化能力变小了? 这就须将具有生物活性的和失去活性的蛋白质分开后， 进行活力检测才能确定。 它们之间的分离是比较困难的。 然而，亲和层析法是可以解决这一问题的。 原理：失去活性的蛋白质与配体无亲和力，有活性的 则与配体有亲和力。以此分离。
第五章
亲和层析
第一节
第二节 第三节
亲和层析基本原理
亲和层析操作 亲和层析应用
第一节 亲和层析基本原理
亲和层析定义
亲和层析是通过生物分子之间特异可逆 结合与解离的原理，进行生物分子特异 分离的层析技术。
亲和层析发展过程
在1968—1972年Anfinsen创建了亲和层 析技术。
交联葡聚糖
聚丙烯酰胺
稳定性较好
同上
孔径较小、稳定性不好
同上
琼脂糖
多孔玻璃
非特异性吸附低、稳定性好、 孔径均匀适当、宜于活化
机械强度好，化学稳定性好 活性基团较少、对蛋白 质有较强的吸附作用
二、配体的选择
可选择的配体有抑制剂、效应物、酶的 辅助因子、类似底物、抗体； 其他物质，如外源凝集素、polyA、 polyU、染料和金属离子。
五、分离大分子物质（洗脱）
除去杂质 样品过柱后，可用大量的平衡液即起始缓冲液洗去无亲和 力的杂蛋白，有时也可用不同的缓冲液洗涤去除之；
最后留在柱上的只有专一吸附的大分子物质。
洗脱有效成分 将柱上专一吸附的大分子物质洗脱下来。 洗脱液要能使复合物完全分离，其具体作法可根据亲和力 决定。
亲和层析常用的载体
纤维素 交联葡聚糖 琼脂糖 交联琼脂糖 聚丙烯酰胺凝胶 多孔玻璃珠 目前应用最多的是Sepharose4B，是由D-半乳糖 和3,6-脱水-L-半乳糖结合成的链状多糖，基本能 符合理想载体的要求。
优点
纤维素
价格低、活性基团较多
缺点
非特异性吸附强、稳定 性和均一性较差
例如 实验现象： 葡萄球菌核酸酶经亲和标记物标记后，发现： 该标记物与酶活性中心的酪氨酸结合，
可导致酶活力丧失83％，剩余酶活力17％。
问题： 该实验的现象，
究竟是核酸酶的活性中心被结合后仍有17％的酶活力?
还是因为有少量的核酸未标记上而残存酶活力?
研究思路： 将标记和未标记的酶分离出来，进行活性检测。
思考题
1、什么是亲和层析？其原理是什么？ 2、亲和层析时，优良的配体应具备什么条件？ 3、亲和层析特异性吸附的影响因素有哪些？ 4、亲和层析操作洗脱时，根据亲和力大小的 不同，如何选择洗脱液？
亲和力较小时，可连续用大体积平衡缓 冲液洗脱，得到迟缓的大分子物质峰。 亲和力一般时，主要改变缓冲液的性质 (如改变pH值或离子强度)，使复合物之 间的亲和力降到足以分离的程度。 亲和力较大时，可用与配体竞争的溶液 或者用蛋白质变性剂洗脱。
六、亲和层析柱的再生
当洗脱结束后连续用大量的洗脱液或高 浓度的盐溶液彻底洗涤柱子，接着再用 平衡缓冲液使层析柱重新平衡。 经过这样处理的柱子可以再次上样，进 行第二次亲和层析。
生成亚胺碳酸活性基团，它可以和伯氨(NH2)反应， 主要生成异脲衍生物
缺点： 非特异性吸附，影响亲和层析的分辨率。 与配体结合不够稳定 溴化氰有剧毒、易挥发，操作不便。
环氧乙烷基活化
活化后的基质都含有环氧乙烷基 ，可以结合含有伯氨 基(NH2)、羟基(OH)和硫醇基(SH)等基团的配体
优点 不引入电荷基团，与配体形成的N－C、 O－C 和S－C 键都很稳定，使用寿命长
缺点 与配体偶联时需要碱性条件，温度为20~40 ℃， 对于一些比较敏感的配体可能不适用
溴化氰偶联法为例，包括步骤： 活化 偶联 配体结合量的计算
1．活化基质
在一定量的贮存载体Sepharose 4B(即用布氏漏斗抽干的胶)中，加 入等量的蒸馏水和2 mol／L Na2C03溶液(pH 11~12)，混匀。 另将称量的固体 CNBr(50~300mg／g贮存胶)溶于二甲基甲酰胺溶 液中。随后迅速把此液加到搅拌的琼脂糖悬浮液内进行活化，其 pH值始终维持在11~12之间。 接着把冷却的反应液转到布氏漏斗中，用10~20倍凝胶体积的冷水 及0.07mol／L NaHC03溶液(pH8.5)洗涤。
3．配体结合量的测定
配体结合量：一般是用每毫升或每克贮存胶结合配体
的量表示的。如用mg／m1表示。
测得的配体结合量，可作为决定亲和吸附剂实际用量
的参数。
具体测定方法有两种，即直接测定法和间接测定法。
•
•
(1) ① ② (2)
直接测定法 2，4，6—三硝基苯磺酸钠的颜色试验 根据配体的特性进行测定 间接测定法
配体的分类
特异性配体
只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结 合的配体 如：抗原和抗体、酶和它的抑制剂
通用性配体
特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物 大分子结合的配体 如：凝集素可以结合各种糖蛋白
优良的配体须具备的条件
与待分离的物质有适当的亲和力 与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特 异性 与基质稳定的共价结合 自身应具有较好的稳定性
单克隆抗体 蛋白质A/蛋白 质G 蛋白酶抑制剂 磷酸 三嗪染料 抗生物素蛋白
胆固醇 脂肪酸 核苷酸 苯基硼酸 盐 凝集素 糖
三、亲和吸附剂的制备
1、载体的活化
指通过对载体进行一定的化学处理，使载体表 面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的 活性基团。 溴化氰活化法
环氧乙烷基活化法
溴化氰活化
四、特异性吸附
当样品开始加到已知具有一定配体浓度的亲和层 柱时，欲分离的大分子物质在柱中的浓度等于零； 当样品开始进入柱中时，配体和欲分离的大分子 物质间相互触，并形成复合物，当样品不断地通 过柱子，欲分离的大分子物质与配体之间形成的 复合物浓度越来越大。
特异性吸附影响因素
配体与欲分离物质的亲和力：亲和力大 时，吸附量大。 pH：随pH降低，吸附量减少。 离子强度：在相同pH条件下，离子强度 降低，吸附量反而增大。
亲和层析原理
生物分子之间特异性结合
抗原－－抗体
激素－－受体 酶－ － 底物、底物类似物、抑制剂、辅基 核酸－－互补链
第二节
亲和层析操作
配基
载体
一、载体的选择
理想的载体应满足下面的要求：
具有较好的物理化学稳定性 较多的活性基团 能够和配体稳定的结合 结构为均匀的多孔网状结构 与样品中的各个组分均没有明显的非特异性吸附
蛋白质亲和层析中的合适配体
配体 待纯化的蛋白质 配体 待纯化的蛋白质
抗原
特定单克隆抗体或多 克隆抗体
特定抗原 免疫球蛋白 蛋白酶 磷酸酶 脱氢酶、激酶、聚合 酶、限制酶、干扰素 含生物素的酶
肝素
凝聚因子、脂酶、结 缔组织蛋白酶、DNA 聚合酶
胆固醇受体、胆固醇 结合蛋白 脂肪酸结合蛋白、白 蛋白 核苷酸结合蛋白、需 核苷酸的酶 糖蛋白 糖蛋白 凝集素、糖苷酶
20世纪70年代有了惊人的发展，并逐步 得到广泛的应用。 目前，已有活化载体及其衍生物产品出 售，使得亲和层析变得更简捷。
亲和层析优点
其他方法利用理化性质的差异，许多分子
差异很小，要得到纯度高的单一分子，要
联合运用多种方法，最终得率低；
而亲和层析迅速、简单、高效、特异。
亲和层析缺点
要分离一种物质必须找到适宜的配体， 并将其制成固相载体之后方可进行。
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通过活化反应形成的化合物可能有两种： 其一是具有反应能力的亚氨碳酸盐衍生物；
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其二是无反应能力的氨基碳酸盐。
2．偶联
配体和~0.25mol／L碳
酸盐缓冲液(含0.5mol／L NaCl和1~10pmol配体／ml 基质溶液)混合，缓慢搅拌(勿用磁力搅拌器)2h(室温) 或过夜(4℃)，以便配体和基质充分偶联而形成固相载 体。