一例副猪嗜血杆菌的分离培养及药敏试验

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副猪嗜血杆菌病原的分离鉴定与药敏试验

（ｘｌ）ｇｎ［］ＩｆｃＩＡｐｌｅｅＪ．ｎｅｔｍｍｕ，９３６（）９７９４１ｎ１９，１３：４ —５．
［］ＢｕｅＫ．ａｈｇｎｓｆｃｉｏａｉｕｌｒｐｅｍｏｉｅ５ｏｋＰｔｏｅｅｉｏｔｂｃｌｓｐｅｏｎｕｎａ；ｓＡｎｌｕ
验和ＰＲ鉴定，定分离的２株茵为副猪嗜血杆茵。药敏试验结果表明，离株对诺氟沙星、氟沙星、Ｃ确分氧环丙沙星、恩诺沙星，以及头孢茵素、四环素和庆大霉素等药物敏感，红霉素、对壮观霉素和洁霉素有抵抗力。
维普资讯
动物医学进展。０７２（２：７２２０，８１）２ — ９
ＰｒｇｅｓｉｔｒｎａｙＭｅｉｉｏｒｓｎＶｅｅｉｒｄｃｎｅ
副猪嗜血杆菌病原的分离鉴定与药敏试验
关键词：副猪嗜血杆菌；离；定；分鉴药敏试验
中图分类号：８２６２￥５．１文献标识码：Ａ文章编号：０７５３（０７１－０７０１０—０８２０）２０２－３
副猪嗜血杆菌（ｅｐｉｓｐｒｓｉ，Ｈｐ）Ｈａｍｏｈｌａａｕｓｕｓ猪表现为多发性浆膜炎、节炎、膜炎等。近年关脑
Ｒｏｅｏｏｉｓａｄｃａａｔｒｚｔｏｆｔｅｌｆｔｘｎｎｈｒｃｅｉａ｜ｎｏｈｖｔｏａｈｓｏｎｏｆｉｒｄｅｉ
［］高永贵，关怡新．７姚善泾，等．包涵体蛋白的变复性研究［］Ｊ．

副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验

副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验薛国聪;任涛;徐成刚;涂玉蓉;蔡绍鑫;阳艳林;蔡丽丽;郑俏伟;张建民;廖明【摘要】对广东15个送检的疑似猪传染性副猪嗜血杆菌病的病猪样品,用TSA培养基进行细菌的分离,并对分离菌株进行细菌的形态观察、培养特性和生化试验鉴定,以及用副猪嗜血杆菌16s rRNA基因的特异性引物进行PCR鉴定.试验结果表明,有7株分离菌株扩增出了821 bp的特异性目的条带,结合形态观察、培养特性和生化试验鉴定,结果表明成功分离到了7株副猪嗜血杆菌;药敏试验结果显示,分离菌株对氨苄西林、多粘菌素、庆大霉素等药物较敏感.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2010(000)001【总页数】4页(P134-137)【关键词】副猪嗜血杆菌;分离鉴定;药敏试验【作者】薛国聪;任涛;徐成刚;涂玉蓉;蔡绍鑫;阳艳林;蔡丽丽;郑俏伟;张建民;廖明【作者单位】华南农业大学兽医学院农业部动物疫病防控重点开放实验室,广州,510642;华南农业大学兽医学院农业部动物疫病防控重点开放实验室,广州,510642;华南农业大学兽医学院农业部动物疫病防控重点开放实验室,广州,510642;华南农业大学兽医学院农业部动物疫病防控重点开放实验室,广州,510642;华南农业大学兽医学院农业部动物疫病防控重点开放实验室,广州,510642;华南农业大学兽医学院农业部动物疫病防控重点开放实验室,广州,510642;华南农业大学兽医学院农业部动物疫病防控重点开放实验室,广州,510642;华南农业大学兽医学院农业部动物疫病防控重点开放实验室,广州,510642;华南农业大学兽医学院农业部动物疫病防控重点开放实验室,广州,510642;华南农业大学兽医学院农业部动物疫病防控重点开放实验室,广州,510642【正文语种】中文【中图分类】S854.4副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)是猪革拉泽氏病(Glasser's disease)的病原菌,属于巴氏杆菌科嗜血杆菌属。

副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验

副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验张立宪;游一【摘要】Five strains of gram negative bacilli were isolated from a pig farm of Jiaozuo, which were suspected to be Haemophilus parasuis.Inorder to control the epidemic,Haemophilus parasuis was finally diagnosed by cultural and infection characteristics,biochemical tests,PCR and pathogenicity examination. The results of drug sensitivity test indicatedthat the isolated strains were sensitive to ceftiofur,cefotaxime, amikacin,lomefloxacin, and not sensitive tochloramphenicol,amoxicillin,clindamycin,chlortetracycline, enrofloxacin,doxycyclile, and resistant to penicillinG,ampicillin,streptomycin,sulfamonomethoxine.%从焦作市疑似感染副猪嗜血杆菌病的某猪场送检病料中分离到5株致病杆菌后，为控制疫情，对细菌进行培养特性、生化特性及PCR鉴定，并进行致病性和药敏试验。

结果显示，分离菌株为副猪嗜血杆菌，该菌对丁胺卡那、洛美沙星、头孢噻肟、头孢噻呋较为敏感，对强力霉素、恩诺沙星、金霉素、克林霉素、阿莫西林、氯霉素不太敏感，对链霉素、氨苄西林、青霉素G、磺胺间甲氧嘧啶耐药。

副猪嗜血杆菌病的检验与药敏试验

１００一
分离细菌对头孢拉定、先锋Ｖ、氟哌酸均高度
敏感；对环丙沙星、四环素、强力霉素均中度敏感；对阿莫西林、金霉素呈低度敏感：对链霉素、青霉素均为耐药。
药敏试验结果表明，该菌株对对头孢拉
题，建议政府财政加以扶持。另外，针对机械存在的振动
（１）探索秸秆气化集中供气技术。即将农作物秸秆等生物质原料粉碎后在气化反应炉中通过热解反应或高温裂解，
变成ＣＯ和Ｈ为主的可燃气体。
｜ｌ一ｊ鞠ｉ态藏骥
褥
为了调查副猪嗜ｍ杆菌病的流行情况，从
将各种药敏纸片分别平贴于培养基表面．３７ ℃
培养２４ｈ后测量抑菌圈直径。判断标准为：抑
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
阜蒙县部分发病的猪场采集病料８份。经实验
过分离培养得到革兰氏阴性短小杆菌，无芽
孢，具有多种不同的形态，从单个的球杆菌到
一一长的、细长的以致细丝状菌体．符合副猪嗜血
杆菌的形态特征。
徘
一曩
＿。
定、先锋Ｖ、氟哌酸高敏；而对链霉素、青霉
环丙沙星头孢拉定阿莫西林

副猪嗜血杆菌的分离鉴定及药敏试验

福建畜牧兽医第35卷第2期2013年步跟踪检测研究。

参考文献：[1]何爱华,林奕坚,郭永健,等.大黄鱼幼鱼虹彩病毒感染的电镜研究[J].福建水产,1999(3):56-59.[2]Chen X H,Lin K B,Wang X W.Outbreaks of an iridovirus disease in maricultured large yellow croaker,Larimichthyscrocea (Richardson)in China [J].Journal of Fish Diseases,2003,26:615-619.[3]陈新华,董燕红.大黄鱼虹彩病毒PCR 快速检测试剂盒的研制[J].生物技术,2005(3):38-40.[4]OIE.Red Sea Bream Iridoviral Disease Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals [M].Paris:OfficeInternational des Epizooties,2009:251-261.[5]赵玉然,岳志芹,谭乐义,等.山东沿海部份地区真鲷虹彩病毒病初步调查与分析[J].渔业科学进展,2011,32(6):31-36.[6]萧枫,张奇亚.水生动物虹彩病毒的分子生物学[J].水生生物学报,2004,28(2):202-206.[7]李华,孙志鹏,李强,等.条石鲷检出的虹彩病毒特性研究[J].病毒学报,2011,27(2):158-164.[8]洪健,周雪平.ICTV 第八次报告的最新病毒分类系统[J].中国病毒学,2006,21(1):84-96.副猪嗜血杆菌（Hps ）常引起猪的多发性浆膜炎、关节炎以及脑膜炎，由该菌引起的病又称为猪革拉泽氏病［1］。

随着世界养猪业的发展，该病已成为全球范围内影响养猪业的一种重要细菌性疾病。

副猪嗜血杆菌在实验室分离培养困难，生长条件苛刻，需要高营养成分和特殊的生长因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD ，又称辅酶Ⅰ）［2］。

规模猪场副猪嗜血杆菌的分离鉴定及药物试验

养．５菌体形态及染色
对该病的治疗临床上目前还是以使用抗生素为主。但是由于抗生素的耐药性，不同菌株对同一种抗生素的敏感性有很大差异，因
使用同一种药，要交替轮换使用。
挑去上述纯化培养物，涂片，革兰氏染色，镜检，观察观察此，要在进行药敏试验的基础上，选择药物，不能长期、大剂量细菌形态。
副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌（ＨＰＳ）引起猪的以纤维
愿活动等副猪嗜血杆菌只感染猪，一般多发生于断奶前后及保育左右的小菌落。分离到的３株细菌被别命名为ＬＳ１、ＬＳ２、ＬＳ３。猪，感染高峰期通常见于４周～６周，病死率可达５０％，给养猪业２．２卫星现象观察
１．６卫星现象观察
参考文献
［１Ｊ马增军．副猪嗜血杆菌重要生物学特性测定［Ｊ１．黑龙江畜牧兽医，
２００５，（１）：２８ — ２９．［２］陆承平．兽医微生物学ｆＭ１．北京：中国农业大学出版社，２００１：
按常规方法进行，将分离到的单个细菌菌落均匀涂于氧氟沙
原菌是副猪嗜血杆菌。同时，对分离菌进行药敏试验，为今后防星、丁胺卡那霉素、阿莫西林、环丙沙星、替米考星等ｌＯ种抗生控该病提供试验依据。素药敏试纸，３７。ｃ培养２４ｈ后，观察测定抑菌圈的大小。

猪场副猪嗜血杆菌的分离鉴定及药敏试验

猪场副猪嗜血杆菌的分离鉴定及药敏试验张㊀静ꎬ史开志∗ꎬ王㊀婧ꎬ张㊀雄(贵州省农业科学院畜牧兽医研究所ꎬ贵州贵阳５５０００５)摘要:为查明贵阳市花溪区麦坪镇某猪场仔猪发生呼吸道疾病的病因ꎬ对送检的２头病猪采集病料进行细菌分离培养㊁染色镜检㊁生化试验㊁ＰＣＲ扩增及测序㊁药敏试验ꎮ结果:从病料样本中分离得到１株细菌ꎬ根据形态学和生化试验初步鉴定为副猪嗜血杆菌ꎻ应用细菌１６ＳｒＲＮＡ序列分析技术从分子水平对分离细菌进行分型鉴定ꎬ运用ＤＮＡＳｔａｒ软件与不同血清型副猪嗜血杆菌基因序列进行比对ꎬ发现分离菌与不同血清型副猪嗜血杆菌菌株１６ＳｒＲＮＡ序列同源且相似性为９７.４％~１００％ꎬ其中与血清５型相似性最高ꎻ系统进化分析显示ꎬ分离菌株与血清５型副猪嗜血杆菌进化关系最近ꎻ分离菌株对利福平㊁头孢氨苄㊁阿米卡星㊁环丙沙星㊁万古霉素敏感ꎮ结论:综合分离细菌传统鉴定方法和分子生物学鉴定方法的实验结果ꎬ确定分离菌株属于血清５型副猪嗜血杆菌ꎮ关键词:副猪嗜血杆菌ꎻ分离鉴定ꎻ１６ＳｒＲＮＡꎻ血清型ꎻ药敏试验中图分类号:Ｓ８５２.６１:Ｑ７㊀㊀㊀文献标识码:Ａ㊀㊀㊀文章编号:１００７－１４７４(２０１９)０２－００１９－０５ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓａｎｄＤｒｕｇＳｅｎｓｉｔｉｖｅＴｅｓｔＩｓｏｌａｔｅｓｆｒｏｍＰａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌＰｉｇｌｅｔｓＺｈａｎｇＪｉｎｇꎬＳｈｉＫａｉｚｈｉ∗ꎬＷａｎｇＪｉｎｇꎬＺｈａｎｇＸｉｏｎｇ(ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＧｕｉｚｈｏｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＧｕｉｙａｎｇＧｕｉｚｈｏｕ５５０００５ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:ＩｎｏｄｅｒｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｃａｕｓｅｓｏｆｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｄｉｓｅａｓｅｓｏｆｐｉｇｌｅｔｓｏｆｐｉｇｆａｒｍꎬｉｎＭａｉｐｉｎｇꎬＨｕａｘｉｄｉｓｔｒｉｃｔｏｆＧｕｉｚｈｏｕｐｒｏｖｉｎｃｅ.Ｂａｃｔｅｒｉａｌｉｓｏ￣ｌａｔｉｏｎａｎｄｃｕｌｔｕｒｅꎬｓｔａｉｎｉｎｇａｎｄｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎꎬｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｔｅｓｔꎬＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇꎬａｎｄｄｒｕｇｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｅｓｔｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄｏｎｔｗｏｓｉｃｋｐｉｇｓ.Ｒｅｓｕｌｔ:ｏｎｅｓｔｒａｉｎｓｕｓｐｅｃｔｅｄＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｂｙｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｃｕｌｔｕｒｅｍｅｔｈｏｄｓꎬｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓｐｒｅ￣ｌｉｍｉｎａｒｉｌｙａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｔｅｓｔｓ.Ｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｌ１６ＳｒＲＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｗａｓａｐｐｌｉｅｄｔｏｃｌａｓｓｉｆｙａｎｄｉｄｅｎｔｉ￣ｆｙｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｄｂａｃｔｅｒｉａａｔｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｅｖｅｌ.ＤＮＡＳｔａｒｓｏｆｔｗａｒｅｗａｓｕｓｅｄｔｏｃｏｍｐａｒｅｔｈｅＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓ１６ＳｒＲＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｅｒｏ￣ｔｙｐｅｓｓｔｒａｉｎｓꎬａｎｄｉｔｗａｓｆｏｕｎｄｔｈａｔｉｔｓｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｏｆｉｓｏｌａｔｅｓｔｒａｉｎａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｅｒｏｔｙｐｅｓｗｉｔｈｔｈｅｐｕｂｌｉｓｈｅｄｗｅｒｅ９７.４％~１００％ꎬｗｉｔｈｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｓｉｍｉ￣ｌａｒｉｔｙｗｉｔｈｓｅｒｏｔｙｐｅ５.Ｔｈｅｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆ１６ＳｒＲＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｉｓｏｌａｔｅｓｔｒａｉｎｗａｓｃｌｕｓｔｅｒｅｄｉｎｔｏｏｎｅｂｒａｎｃｈｗｉｔｈｓｅｒｕｍｔｙｐｅ５.ＤｒｕｇｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｅｓｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓｉｓｏｌａｔｅｓｉｎｔｈｉｓｆｉｅｌｄｗｅｒｅｓｅｎｓｉｔｉｖｅｔｏｒｉｆａｍｐｉｃｉｎꎬｃｅｆｔｒｉａｘｉｎꎬａｍｉｋａｃｉｎꎬｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎａｎｄｖａｎ￣ｃｏｍｙｃｉｎ.Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ:ｔｈｅｉｓｏｌａｔｉｏｎｗａｓｓｅｒｕｍｔｙｐｅ５Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓｂｙｃｏｍｂｉｎｉｎｇｔｈｅｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓꎻＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎꎻ１６ＳｒＲＮＡꎻＳｅｒｏｔｙｐｅꎻＤｒｕｇＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙＴｅｓｔ㊀㊀副猪嗜血杆菌(ＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓꎬＨｐｓ)是收稿日期:２０１９－０２－０５基金项目: 基于ＰＡＭｓ转录组的ＨＰ－ＰＲＲＳＶ＆ＨＰＳ协同感染致病机制贵州省农科院青年基金项目(黔农科院青年基金[２０１８]９２号)ꎻ 生猪健康养殖配套技术服务企业行动计划贵州省科研机构服务企业行动计划项目(黔科合服企[２０１５]４００３号)ꎻ 基于免疫应答能力的贵州省地方猪抗病性研究贵州省科技计划项目(黔科合支撑[２０１６]２５１０号)作者简介:张静(１９９３ )ꎬ女ꎬ硕士研究生ꎬ主要研究方向:畜禽重大疫病分子遗传机制ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｇｚｓｘｍｓ＿ｚｊ＠１６３.ｃｏｍ∗通讯作者:史开志(１９８２ )ꎬ男ꎬ副研究员ꎬ研究方向:生猪疫病防控及贵州地方猪产业化与品牌化发展技术ꎮＥ－ｍａｉｌ:１８１９４３８５３＠ｑｑ.ｃｏｍ１种革兰氏阴性㊁具有多种不同形态的条件性致病菌ꎬ会引起纤维素性多发性浆膜炎㊁关节炎㊁脑膜炎㊁心包炎为主要病理特征的疾病[１]ꎮ主要引起２周龄到４月龄的猪发病ꎬ严重时病死率可达５０％[２]ꎮ近年来ꎬ贵州省生猪产业快速发展ꎬ养殖规模日益扩大ꎬ与此同时猪场内各种免疫抑制性疾病情况日趋复杂ꎬ猪场单独感染或继发感染副猪嗜血杆较为普遍ꎬ造成的经济损失也越发严重ꎮ副猪嗜血杆菌有１５种血清型ꎬ各血清型之间的致病力存在极大的差异ꎬ其中血清１型㊁５型㊁１０型㊁１２型㊁１３型和１４型具有高致病性ꎬ通常在感染４天后发病或死亡ꎮ我国的猪群中广泛存在且流行的血清型主要是血清４型㊁５型㊁１２型和１３型为主[３]ꎮ鉴于副猪嗜血杆菌生长条件严苛ꎬ且传统方法无法完全区分副猪嗜血杆菌的血清型[４]ꎬＯｌｖｅｒａＡ等[５]从细菌１６ＳｒＲＮＡ的种属特性出发ꎬ设计了副猪嗜血杆菌１６ＳｒＲＮＡ基因特异性引物ꎬ扩增得到８２２ｂｐ特异片段ꎬ经过序列分析可针对性地鉴定副猪嗜血杆菌ꎬ且可通过酶切将不同血清型的副猪嗜血杆菌分为不同的基因型ꎮ综合传统培养特性和１６ＳｒＲＮＡ序列特性对副猪嗜血杆菌临床分离株进行鉴定和分型ꎬ能有效克服传统方法对副猪嗜血杆菌分型鉴定存在的困难ꎮ２０１８年９月初ꎬ贵阳市花溪区麦坪镇某猪场陆续发生疫病ꎬ病猪临床表现为发热㊁呼吸困难㊁跛行等症状ꎻ剖检病理变化主要为肺实质性病变ꎬ心包内充满积液ꎬ胸腹腔有纤维素性渗出ꎬ胸腔积水ꎬ关节肿大ꎬ关节腔内积液ꎮ为确诊和控制疫情ꎬ本实验对送检的病料进行细菌分离培养ꎬ并对分离菌株进行鉴定和药敏试验ꎬ现报道如下ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀材料１.１.１㊀病料来源:发病猪场送检的２头疑似感染副猪嗜血杆菌病猪ꎮ１.１.２㊀主要试剂:(１)营养琼脂㊁酵母粉㊁ＮａＣｌ㊁蛋白胨㊁牛肉浸膏㊁新生牛血清㊁ＮＡＤ㊁革兰氏染色试剂ꎬ购自北京索莱宝科技有限公司ꎮ(２)细菌生化鉴定管和药敏纸片ꎬ购自杭州滨和微生物试剂有限公司和杭州微生物试剂有限公司ꎮ(３)２ˑＥｓＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ(Ｄｙｅ)ꎬ购自北京康为世纪生物科技有限公司ꎮ(４)ＤＮＡｉｓｏｐｌｕｓ㊁ＤＬ－２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎬ购自ＴａＫａＲａ生物公司ꎮ１.１.３㊀培养基:(１)副猪嗜血杆菌固体培养基:营养琼脂３.３ｇꎬ酵母粉１ｇꎬ溶于超纯水９０ｍＬ中ꎬ调节ｐＨ值至７.３~７.４ꎬ１２１ħ灭菌２５ｍｉｎꎬ冷却至５０ħ左右ꎬ加入ＮＡＤ１ｍＬ和新牛血清１０ｍＬꎬ倒入平皿ꎬ凝固后倒置于３７ħ培养箱中过夜无杂菌生长ꎬ４ħ保存备用ꎮ(２)副猪嗜血杆菌液体培养基:ＮａＣｌ１ｇꎬ蛋白胨１ｇꎬ酵母粉０.５ｇꎬ牛肉浸膏１ｇꎬ加入蒸馏水９０ｍＬꎬ调节ｐＨ值至７.３~７.４ꎬ１２１ħ灭菌２５ｍｉｎꎬ冷却至室温ꎬ加入ＮＡＤ１ｍＬ和新牛血清１０ｍＬꎬ４ħ保存备用ꎮ１.２㊀方法１.２.１㊀细菌分离培养及涂片镜检:无菌条件下ꎬ取发病猪的肺脏分别接种于液体培养基和固体培养基上ꎬ置于体积分数５％ＣＯ２培养箱ꎬ３７ħ培养２４~４８ｈꎬ观察菌落生长状况和形态ꎬ挑取菌落进行纯培养ꎬ革兰氏染色ꎬ显微镜下观察细菌形态ꎮ１.２.２㊀生化试验:将分离细菌纯培养物分别接种于添加１μｇ/ｍＬＮＡＤ的葡萄糖㊁蔗糖㊁半乳糖㊁麦芽糖㊁甘露醇等微量生化鉴定管ꎬ置体积分数５％ＣＯ２培养箱ꎬ３７ħ培养２４ｈꎬ观察生化反应结果ꎮ１.２.３㊀ＰＣＲ扩增及测序:提取菌液ＤＮＡ为模板ꎬ应用ＯｌｖｅｒａＡ等[５]设计的１６ＳｒＲＮＡ序列引物(Ｆ:５－ＧＴＧＡＴＧＡＧＧＡＡＧＧＧＴＧＧＴＧＴ－３ ꎬＲ:５－ＧＧＣＴＴＣＧＴＣＡＣＣＣＴＣＴＧＴ－３ )对目的基因进行ＰＣＲ扩增ꎬ预扩增片段大小为８２２ｂｐꎮ(１)ＰＣＲ扩增体系２５μＬ:２ˑＥｓＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ(Ｄｙｅ)１２.５μＬꎬ１μｍｏｌ/Ｌ上游引物１μＬꎬ１μｍｏｌ/Ｌ下游引物１μＬꎬ模板ＤＮＡ２μＬꎬ无菌水补齐至２５μＬꎮ(２)ＰＣＲ反应程序:９４ħ预变性２ｍｉｎꎻ９４ħ变性３０ｓꎬ５９ħ退火３０ｓꎬ７２ħ延伸３０ｓꎬ共３５个循环ꎻ７２ħ延伸２ｍｉｎꎬ４ħ冷却２ｍｉｎꎮ取ＰＣＲ产物６μＬ于１.５％琼脂糖凝胶电泳观察ꎮＰＣＲ产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序ꎮ１.２.４㊀１６ＳｒＲＮＡ基因同源性比较与系统进化分析:运用ＤＮＡＳｔａｒ软件ꎬ将分离菌株与ＮＣＢＩ上１５种血清型副猪嗜血杆菌参考株１６ＳｒＲＮＡ基因的核酸序列进行同源性分析ꎬ并构建系统进化树ꎮ１.２.５㊀药敏试验:无菌条件下ꎬ取处于对数增长期的菌液１００μＬ于固体培养基上ꎬ用无菌涂布器将菌液均匀涂满整个平皿ꎬ然后用灭菌镊子夹取１３种药敏纸片放在适当的位置ꎬ轻轻按压固定ꎮ晾干后倒置于体积分数５％ＣＯ２培养箱ꎬ３７ħ培养２４ｈꎬ观察结果ꎬ测定抑菌环的大小ꎬ判断药物敏感性ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀分离细菌形态学特征㊀分离菌在固体培养基上生长ꎬ肉眼可观察到针尖大小㊁无色透明的菌落(见图１)ꎮ挑取单个菌落涂片进行革兰氏染色ꎬ镜检为革兰氏阴性菌ꎬ呈短杆状㊁长线状等多种形态(见图２)ꎮ２.２㊀生化试验结果㊀对纯化细菌进行生化试验ꎬ结果显示该菌株各项生化鉴定结果符合副猪嗜血杆菌标准菌株的特征[６]ꎮ见表１ꎮ图１㊀分离菌菌落形态图２㊀分离菌革兰氏染色镜检(１０ˑ１００)表１㊀分离菌株生化鉴定结果㊀项目葡萄糖麦芽糖蔗糖乳糖木糖甘露醇阿拉伯糖半乳糖七叶苷尿素酶㊀硝酸盐(还原)结果＋－＋＋－－＋＋－＋－㊀㊀注:＋为阳性ꎬ－为阴性２.３㊀ＰＣＲ扩增及测序结果㊀为进一步确定该菌ꎬ以该分离菌株ＤＮＡ为模板ꎬ利用副猪嗜血杆菌１６ＳｒＲＮＡ引物成功扩增出长度约为８２２ｂｐ的基因片段ꎬ得到与预期目的片段大小相一致的扩增产物(见图３)ꎬ确定为副猪嗜血杆菌(命名为:ＧＺ＿ＭＰ＿ＨＰＳ００１)ꎮＰＣＲ产物测序结果见图４ꎮ２.４㊀１６ＳｒＲＮＡ基因同源性比较与系统进化分析结果２.４.１㊀１６ＳｒＲＮＡ基因同源性比较分析:将ＧＺ＿ＭＰ＿ＨＰＳ００１的１６ＳｒＲＮＡ基因核苷酸序列与其他参考菌株进行同源性比对ꎬ结果见图５ꎮＧＺ＿ＭＰ＿ＨＰＳ００１与参考菌株的１６ＳｒＲＮＡ核苷酸序列同源ꎬ且相似性为９７.４％~１００％ꎻ与血清５型参考菌株的核苷酸序列相似性高达１００％ꎮ图３㊀分离菌１６ＳｒＲＮＡ基因ＰＣＲ扩增结果Ｍ:ＤＬ－２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻ１:阴性对照ꎻ２:分离菌株图４㊀分离菌(ＧＺ＿ＭＰ＿ＨＰＳ００１)１６ＳｒＲＮＡ序列图５㊀ＧＺ＿ＭＰ＿ＨＰＳ００１与参考菌株同源性比对结果２.４.２㊀１６ＳｒＲＮＡ基因系统进化分析:应用ＤＮＡＳｔａｒ软件ＣｌｕｓｔａＷ算法对ＧＺ＿ＭＰ＿ＨＰＳ００１分离株１６ＳｒＲＮＡ基因核苷酸序列及参考菌株绘制系统发育进化树ꎬ结果ＧＺ＿ＭＰ＿ＨＰＳ００１与血清５型Ｈｐｓ参考株属于同一分支ꎮ见图６ꎮ图６㊀基于Ｈｐｓ１６ＳｒＲＮＡ基因核苷酸序列的系统进化树２.５㊀药敏试验结果㊀选择１３种药敏纸片对该菌进行药敏试验ꎬ结果分离菌株对利福平㊁头孢氨苄㊁阿米卡星㊁环丙沙星㊁万古霉素敏感ꎬ对阿莫西林㊁林可霉素㊁链霉素㊁多西环素㊁红霉素㊁青霉素㊁庆大霉素耐药(见表２)ꎮ该猪场可选择利福平㊁头孢氨苄等５种敏感药物对病猪进行治疗ꎮ表２㊀副猪嗜血杆菌分离株药敏试验结果㊀药物名称抑菌环直径(ｍｍ)判定结果氟苯尼考１７Ｉ阿莫西林１３Ｒ利福平３４Ｓ林可霉素１１Ｒ链霉素０Ｒ头孢氨苄３２Ｓ多西环素１３Ｒ阿米卡星２２Ｓ红霉素０Ｒ青霉素０Ｒ环丙沙星２８Ｓ万古霉素２２Ｓ庆大霉素１２Ｒ㊀㊀注:药物敏感性按«抗菌药物药敏试验判断标准»进行判断ꎬ抑菌环直径ȡ２０ｍｍ为敏感(Ｓ)ꎬ抑菌环直径在１５~２０ｍｍ之间为不敏感(Ｉ)ꎬ抑菌环直径ɤ１５ｍｍ为耐药(Ｒ)３㊀结论与讨论３.１㊀根据对猪场送检病料进行细菌分离培养㊁染色镜检㊁生化试验㊁ＰＣＲ扩增及测序ꎬ综合鉴定分离菌为副猪嗜血杆菌(命名为:ＧＺ＿ＭＰ＿ＨＰＳ００１)ꎬ确诊该猪场发病原因为副猪嗜血杆菌感染所致ꎮ分离菌株与１~１５型参考菌株的核苷酸序列同源性为９７４％~１００％ꎬ其中与血清５型副猪嗜血杆菌序列同源性高达１００％ꎻ系统进化树分析显示ꎬ该菌株与血清５型副猪嗜血杆菌聚到１个分支上ꎬ说明该菌株与血清５型副猪嗜血杆菌的亲缘关系最近ꎬ表明从该场分离得到的菌株为血清５型副猪嗜血杆菌ꎮ这符合中国流行的副猪嗜血杆菌血清型为４型和５型的情况[７~９]ꎬ也说明副猪嗜血杆菌的血清型与基因型存在一致性ꎮ３.２㊀副猪嗜血杆菌５型属于目前国内流行的血清型之一ꎮ临床上感染该血清型的猪在４天内发病或者死亡ꎮ相关感染试验表明ꎬ气管或腹腔感染副猪嗜血杆菌的猪常因急性败血症在接种１~２ｄ后出现死亡[１０~１３]ꎮ该猪场出现的疫情与感染血清５型副猪嗜血杆菌发病急㊁影响大的特点相一致ꎮ３.３㊀药敏试验结果显示ꎬ分离菌株对利福平㊁头孢氨苄㊁阿米卡星㊁环丙沙星㊁万古霉素高度敏感ꎬ发病猪场用上述敏感药物进行治疗和预防都有很好的效果ꎮ副猪嗜血杆菌不同的血清型之间的药物敏感性存在差异ꎬ即使是同一血清型ꎬ来自不同地区的不同菌株对同一种药物的敏感性也有很大差异ꎬ故临床用药要根据分离菌株药敏试验结果采取针对性的防治措施ꎮ从预防的角度来讲ꎬ疫苗免疫是预防副猪嗜血杆菌的有效方法之一ꎬ该场可利用分离的副猪嗜血杆菌制备自家疫苗对猪进行免疫接种ꎮ参考文献:[１]㊀ＨｉｌｌＣＥꎬＭｅｔｃａｌｆＤＳꎬＭａｃＩｎｎｅｓＪＩ.ＡｓｅａｒｃｈｆｏｒｖｉｒｕｌｅｎｃｅｇｅｎｅｓｏｆＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓｕｓｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｄｉｓｐｌａｙＲＴ－ＰＣＲ[Ｊ].Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２００３ꎬ９６(２):１８９－２０２.[２]㊀张爱朝.规模猪场副猪嗜血杆菌的分离鉴定及药物试验[Ｊ].兽医导刊ꎬ２０１７(１２):１９５.[３]㊀李富祥ꎬ李华春ꎬ宋建领ꎬ等.副猪嗜血杆菌的分离鉴定及１６ＳｒＲＮＡ序列分析[Ｊ].中国畜牧兽医ꎬ２０１２ꎬ３９(８):６８－７２.[４]㊀ＫｉｅｌｓｔｅｉｎＰꎬＲａｐｐｇａｂｒｉｅｌｓｏｎＶＪ.Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎｏｆ１５ｓｅｒｏ￣ｖａｒｓｏｆＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓｏｎｔｈｅｂａｓｉｓｏｆｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕ￣ｓｉｏｎｕｓｉｎｇｈｅａｔ－ｓｔａｂｌｅａｎｔｉｇｅｎｅｘｔｒａｃｔｓ[Ｊ].Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｃｌｉｎｉｃａｌｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ１９９２ꎬ３０(４):８６２－８６５. [５]㊀ＯｌｖｅｒａＡꎬＣａｌｓａｍｉｇｌｉａＭꎬＡｒａｇｏｎＶ.ＧｅｎｏｔｙｐｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓｆｉｅｌｄｓｔｒａｉｎｓ[Ｊ].Ａｐｐｌｅｎｖｉｒｏｎｍｉ￣ｃｒｏｂｉｏｌꎬ２００６ꎬ７２(６):３９８４－３９９２.[６]㊀陆承平.兽医微生物学[Ｍ].北京:中国农业大学出版社ꎬ２００１:２５８－２６１.[７]㊀蔡旭旺.副猪嗜血杆菌的分离鉴定及诊断方法与灭活疫苗的研究[Ｄ].武汉:华中农业大学ꎬ２００６. [８]㊀常洪涛ꎬ刘慧敏ꎬ陈陆ꎬ等.不同猪源副猪嗜血杆菌河南分离株１６ＳｒＲＮＡ基因的遗传进化分析[Ｊ].中国兽医杂志ꎬ２０１５ꎬ５１(９):７－９.[９]㊀徐引弟ꎬ鲁杨超ꎬ王治方ꎬ等.４型副猪嗜血杆菌的分离鉴定与生物学特性研究[Ｊ].黑龙江畜牧兽医ꎬ２０１８(１３):１３１－１３４ꎬ２４６.[１０]㊀王大鹏ꎬ吴家强ꎬ于江ꎬ等.副猪嗜血杆菌血清５型分离株生长曲线与致病力研究[Ｊ].西南农业学报ꎬ２０１１ꎬ２４(５):１９７２－１９７６.[１１]㊀赵国振ꎬ李晓华ꎬ戴爱玲ꎬ等.血清５型副猪嗜血杆菌的仔猪致病性研究[Ｊ].龙岩学院学报ꎬ２０１５ꎬ３３(５):７９－８４.[１２]㊀Ａ.Ｊ.ＭａｒｔíｎｄｅｌａＦｕｅｎｔｅꎬＣ.Ｂ.ＧｕｔｉéｒｒｅｚＭａｒｔíｎꎬＣ.ＰéｒｅｚＭａｒｔíｎｅｚꎬｅｔａｌ.ＥｆｆｅｃｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｖａｃｃｉｎｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓｏｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｇｌäｓｓｅｒｓｄｉｓｅａｓｅｉｎｄｕｃｅｄｉｎｐｉｇｓｂｙｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ[Ｊ].Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ２００９ꎬ１４０(２－３):１６９－１７６. [１３]㊀ＢｌａｎｃｏＩꎬＧａｌｉｎａｐａｎｔｏｊａＬꎬＯｌｉｖｅｉｒａＳꎬｅｔａｌ.ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｂｅｔｗｅｅｎＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｃｏｌｏｓｔｒｕｍｓ－ｄｅｐｒｉｖｅｄａｎｄｓｏｗ－ｒｅａｒｅｄｐｉｇｌｅｔｓ[Ｊ].Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙｍｉｃｒｏｂｉ￣ｏｌｏｇｙꎬ２００４ꎬ１０３(１):２１－２７.。

副猪嗜血杆菌的药敏试验

山东畜牧兽医2018年第39卷副猪嗜血杆菌的药敏试验王圣花（山东省阳谷县畜牧局 252300）摘要本试验根据某养猪场发生的感染病情，疑似副猪嗜血杆菌感染猪出现厌食、呼吸困难、体温升高、振颤及共济失调，属于典型的副猪嗜血杆菌病临床症状。

从疑似副猪嗜血杆菌感染猪的脾、肺等处取样，对致病菌进行分离、保存，一共获得10株疑似副猪嗜血杆菌，编号HPS-0~HPS-9。

通过试验鉴定，这10株细菌均为副猪嗜血杆菌。

选取其中三株副猪嗜血杆菌，编号为HPS-0，HPS-1和HPS-2，分别对18种抗感染药物进行药物敏感性试验，然后测定抑菌圈的直径判断药物对副猪嗜血杆菌的敏感度。

试验结果显示，副猪嗜血杆菌对头孢菌素类抗生素最为敏感，其他大部分抗生素耐药现象比头孢菌素类严重。

关键词副猪嗜血杆菌抗生素药敏试验中图分类号：S855.1+2 文献标识码：A 文章编号：1007-1733(2018)01-0004-02副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HP)，属革兰氏阴性短小杆菌，形态多种多样，副猪嗜血杆菌易感染断奶后和保育阶段的5~8周的幼猪，发病率一般在10%~ 15%，严重时死亡率可达50%[1]。

由于当今科技飞速发展以及社会不断进步，大规模养猪业得到了空前的发展，副猪嗜血杆菌感染也随之成为影响养猪业的严重性疾病。

该细菌在环境中普遍存在，流行于我国各地，使养猪业损失严重，因此该病菌感染成为危害养猪业发展的呼吸系统性疾病之一[2]。

加之规模化饲养技术的不成熟和饲养密度过高，以及呼吸道病并发等因素的存在，使得该病日趋流行，危害日渐严重。

本实验通过对该病原体进行鉴定以及多种药物的敏感试验，结果表明，治疗猪副嗜血杆菌病最有效的药物是头孢类抗生素，说明药敏测试在指导临床治疗中具有重要的意义。

猪副嗜血杆菌病是猪场内常见的由副猪嗜血杆菌引起的一种严重的接触性传染性疾病之一，近几年，在我国多个地区此病大肆流行，因此有必要对该细菌进行药物敏感性研究，该实验在指导临床治疗选择抗感染药物时具有重要的意义。

一株副猪嗜血杆菌的分离鉴定及药物敏感性分析

１试验材料．１
挑取经纯化的可疑菌的单个菌落，水平划线于新的ＴＡ培养基上，７℃培养１。挑取菌落接种于脲Ｓ３２ｈ酶、化酶、氧接触酶、硝酸盐还原、吲哚、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、糖和麦芽糖等微量生化鉴定管核中，并同时加入２ｔ．％ＮＤ及８Ｌ０５Ａｘ０Ｌ新生小牛血清，察和记录２观４ｈ及４８ｈ的结果，并按厂家说明书判定结果。１＿Ｃ＿３２ＰＲ鉴定ＰＲ引物参照ＳｍｎｌｅａＣｉｏｅｉｉ等报Ｏｖｒ道的文献设计，游引物为５一ＴＡＧＧＡ上ＧＧＴＡＧ
２１００第４期
养猪ＳＮＲＵＴＯＷＩＥＰＯＤＣＩＮ
５５
一
株副猪嗜血杆菌的分离鉴定及药物敏感性分析
宋德平黎家祥金冲，，（．１江西农业大学动物科技学院，江西南昌３０４；．昌珠安生物技术有限公司，３０５２南江西南昌３０１）３０３
１ｘＣＢｆｒＬｄＴｓ１０ＰＲｕｅＩ，ＮＰ（０ｍｍｏ／）ｘ，游引５ｘｌ１ｔ上ＬＬ
２ｍ］Ｌ０，／５２ｍｌＤ０Ｌ／ｘ５１．病料剖检猪心包积液及发生纤维素性浆膜物（０ｐｏ￣）．Ｌ下游引物（０ｐｏＩ．，．１１ＤＡ模板５ＬＥＴｑＤＡ聚合酶（Ｕ０５ＬＮ，ｘａＮ５）．，炎的肺脏若干份。１．标准菌株Ｈｓ．２１Ｄ血清４型标准菌株，由华中ｄＨ０３．ｔ。反应条件：４℃预变性５ｍｎ９ｄ２７Ｌ５ｘ９ｉ；４℃ １ｍｎ５ｉ，２℃ １ｍｎ３ｉ，５ｏ１ｍｎ７Ｃｉ，０个循环；２℃延７农业大学蔡旭旺博士惠赠。０ｍｉ。扩增产物进行１％琼脂糖凝胶电泳，．５置１．培养基胰蛋白大豆琼脂（Ｓ）．３１ＴＡ和胰蛋白大伸１ｎ

致病性副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验

（Ｇｌａｓｓｅｒｓ ’Ｄｉｓｅａｓｅ）的致病菌，近年来随着我国养猪业的规模只小鼠注射灭菌生理盐水作为对照。分别隔离饲养，观察７为进一步确诊，本研究进行了细菌分离与鉴定等实验室诊断，并对时取５分离菌株进行了药敏试验，筛选出了对该致病菌比较敏感的几种药ｄ。物，为发病猪场防控措施的制定提供了参考依据，现报告如下。１．８药敏试验按常规方法分别测定分离菌株对常见１０种药物的敏感性。１材料与方法
中国畜牧兽医文摘
２０１５年
３ｌ卷
第７期
基础研究
致病性副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验
周海勇 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
（山东省滨州市滨城区杨柳雪镇兽医站，山东滨州
副猪嗜血杆菌（ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓ，Ｈｐｓ）是引起猪格氏病
２５６６００）
１．５卫星现象观察取纯化菌落水平划线于血平板，再取葡萄球菌垂直于水平线化、集约化发展，猪格氏病感染有明显增加趋势，给我国养猪业划线，３７℃培养至４８ｈ，观察血平板上是否具有溶血和卫星生长带来了巨大的经济损失］。目前，我国兽医临床中常使用抗菌药现象。物进行细菌性疫病的预防控制，但抗菌药物的大量滥用，导致了１．６生化鉴定耐药菌株的不断出现，对如何正确使用药物防控该病提出了更高取分离菌株按常规方法分别进行葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果的要求。２０１４年春，山东省滨州某规模化猪场断奶仔猪突然发糖、木糖、半乳糖、甘露醇、阿拉伯糖、尿素酶、吲哚试验、氧病，发病率高达２０％，死亡率达４０％，病猪精神沉郁、食欲减退化酶试验、接触酶试验等生化鉴定试验。直至禁食、体温升高、咳嗽、呼吸困难，站立困难甚至瘫痪，剖１．７致病性试验检病死猪可见胸膜炎、腹膜炎、脑膜炎、心包炎、关节炎等典型取分离菌株增殖培养后，通过活菌计数调整菌液浓度使其成Ｏ。～１０ ” ＣＦＵ／ｍｌ悬浮液，分别经腹腔注射５只小鼠，同病理变化。根据临床症状和剖检诊断为疑似副猪嗜血杆菌感染，含菌量为１

副猪嗜血杆菌的分离鉴定及药敏分析

副猪嗜血杆菌的分离鉴定及药敏分析陈希文;尹苗;赖守勋;汪谦;李莲;韦剑锋;叶兆美【摘要】采用常规细菌分离鉴定方法和分子生物学技术对四川某规模化猪场疑似副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)感染的病猪关节液、心包液、肺脏等病料进行了致病菌的分离与鉴定.经细菌分离培养特性、生化试验以及16S rDNA 序列PCR扩增,确定分离菌株为HPS.动物致病性试验结果表明,分离菌株具有较强致病性.药敏试验表明,该HPS菌株对青霉素、链霉素、磺胺甲唑、林可霉素、苄唑西林等多数抗生素耐受,而对新霉素、头孢噻肟等较敏感.【期刊名称】《绵阳师范学院学报》【年(卷),期】2016(035)008【总页数】5页(P1-5)【关键词】副猪嗜血杆菌;分离鉴定;药敏试验【作者】陈希文;尹苗;赖守勋;汪谦;李莲;韦剑锋;叶兆美【作者单位】绵阳师范学院动物应用技术研究所,四川绵阳62100;四川铁骑力士集团冯光德实验室,四川绵阳621006;四川省彭州市畜牧局,四川彭州611930;四川铁骑力士集团冯光德实验室,四川绵阳621006;绵阳师范学院动物应用技术研究所,四川绵阳62100;绵阳师范学院动物应用技术研究所,四川绵阳62100;四川铁骑力士集团冯光德实验室,四川绵阳621006;四川铁骑力士集团冯光德实验室,四川绵阳621006【正文语种】中文【中图分类】S852.612副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)是巴斯德菌科、嗜血杆菌属的一种革兰氏阴性细小杆菌[1]，也是猪群上呼吸道的一种常见菌，目前已知15个血清型，但各地流行的血清型不尽相同.该菌在特定的条件下可以侵入猪机体，引发一种以脑膜炎、关节炎、多发性浆膜炎等为主要特征的传染病，又称为猪革拉斯氏病(Glasser’s Disease)[2]，严重危害着养猪业的发展.该菌主要影响2周龄到4月龄的猪，以3-10周龄保育猪尤为明显，通常发病率在15%左右，但严重时该病可造成50%以上的猪死亡[3-4].该病的主要临床症状表现为呼吸困难、消瘦、咳嗽、被毛粗乱、全身发红、尖叫、卧行、体温高达40-41 ℃、败血症、急性肺炎等[5]，主要剖检变化为关节炎、脑膜炎、淋巴结肿大、心包炎、纤维素性胸膜炎等[6].随着养猪设备的升级和劳动力成本的提高，养猪业逐步走向高度的密集化和规模化，从而导致猪群呼吸道问题更加突出，诱发副猪嗜血杆菌病发生的几率也越来越大，对整个养猪业的经济损失也日趋严重.近年来，各地已相继报道多起由副猪嗜血杆菌引起的断奶仔猪关节炎、脑膜炎和多发性浆膜炎等疫情，特别是在集约化程度高、而蓝耳病和圆环病毒病又不稳定的猪场，一旦继发副猪嗜血杆菌病，造成的经济损失非常严重[6-7].当前，由副猪嗜血杆菌引起的疾病已逐渐成为危害世界养猪业的重要疾病，已引起了业界的广泛关注.由于副猪嗜血杆菌血清型多、产生耐药性快，致使临床疫苗免疫和用药效果不理想，给该病的预防和治疗带来很大的困难[8].本研究对四川某规模化猪场出现疑似HPS感染症状的保育猪病料进行了病原分离鉴定和药敏试验，为副猪嗜血杆菌病临床选择敏感有效的药物提供科学依据.1.1 材料1.1.1 试验样品无菌采集于四川某规模化猪场发生纤维素性心包炎、浆膜炎、关节炎及脑膜炎症状的保育猪肺脏、心包积液、关节液及脑组织等.1.1.2 试验动物10只昆明小白鼠，18-22 g/只(四川实验动物中心提供).1.1.3 试验引物根据Genbank提供的副猪嗜血杆菌16S rRNA基因序列设计引物(P1:5’-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3’，P2:5’-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3’)，扩增822b bp特异性片段，由大连宝生物公司合成.1.1.4 主要试剂及培养基新生小牛血清、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、PCR 反应试剂盒，胰蛋白大豆琼脂(TSA)、胰蛋白大豆肉汤(TSB)；微量生化发酵管、药敏纸片(购自杭州微生物试剂有限公司).1.1.5 主要仪器电子天平(JT12001)，高压灭菌锅(SANYO)，无菌操作台(SP-DJ)，光学显微镜(SA3000)，恒温培养箱(PYX-DHS)，恒温摇床(HZ-9311K). 1.2 方法1.2.1 采样无菌采集最近3 d内未使用抗生素治疗并且在采样4 h内的病猪肺脏、心包积液、关节液及脑组织等病料.1.2.2 HPS的分离纯化将采集的样品立即接种到含NAD和10%新生小牛血清的TSA固体培养基和液体培养基，置含有5% CO2的培养箱，37 ℃恒温培养12 h，从培养基上挑取大小约1 mm的半透明或灰白色菌落涂抹于载玻片，用革兰氏染色技术进行初步判断，并将疑似HPS菌落接种于另一新鲜含NAD和10%新生小牛血清的TSA培养基进行纯化，反复多次上述操作，直到获得纯HPS菌落，具体方法参见文献[9].1.2.3 HPS的生化鉴定挑取经上一步纯化的疑似单菌落，接种于新鲜含NAD 和10%新生小牛血清的TSA培养基，经37 ℃培养12 h后，再接种于含尿酶、接触酶、氧化酶、硝酸盐还原、葡萄糖、吲哚、蔗糖、半乳糖、果糖、麦芽糖和核糖等微型生化鉴定管，分别加入8μL新生小牛血清和2μL 0.05% NAD，置37 ℃培养48 h，并按试剂盒说明书进行结果判断.1.2.4 HPS的PCR鉴定用接种环挑取3-5个纯培养菌落，溶于100 μL无菌蒸馏水中，煮沸10 min后置-20 ℃冷冻保存40 min再室温融化，经8 000 r/min 离心6 min后，取上清液作为分离菌株PCR鉴定模板.反应体系(50 μL体系):10×PCR Buffer 5 μL，dNTPs(10 mmol/L)1 μL，上游引物(20pmol/μL)0．5 μL，下游引物(20 pmol/μL)0.5 μL，DNA模板5μL，ddH2O 37.5 μL.反应条件:95 ℃预变性5 min;94 ℃ 1 min，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1.5 min，32个循环;再72 ℃ 10 min.反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后，送宝生物公司测序.1.2.5 HPS的致病性试验将已纯化的菌株接种于TSA平板，置37 ℃培养18-24 h，用灭菌生理盐水洗下，制成9×108个/mL的菌悬液备用.将10只昆明小白鼠随机分成2组，取制备的菌悬液腹腔注射5只小白鼠0.2 mL/只，另外5只作为对照组注射生理盐水0.2 mL/只.各组小白鼠分开饲养，每天观察和记录小白鼠的发病情况，对死亡的小白鼠，立即剖解，并无菌取其心血、脾脏、肝脏等病料接种于NAD和10%新生小牛血清的TSA培养基进行细菌分离.1.2.6 HPS的药敏试验采用美国临床实验室标准(National Committee for Clinical Standards NCCLS)方法进行药敏试验，具体方法参考文献[10].2.1 菌株分离分离纯化后的菌在含有NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的TSA平板上37 ℃培养24-48 h，可见边缘整齐、光滑、湿润、无色、透明约针头大小的菌落(图1).分离菌在不含NAD的TSA平板上不生长.经革兰氏染色镜检，可见G-短杆菌、无芽孢和鞭毛，菌体的形态多样，其中以短杆状居多，但也有长丝状、球状、弯曲丝状等形态.(图2)2.2 HPS的鉴定生化鉴定结果表明，获得的HPS疑似菌株能发酵乳糖、蔗糖、葡萄糖；不发酵甘露醇、山梨醇；氧化酶、明胶、V-P、尿素酶阴性；吲哚、甲基红阳性，详细结果见表1.PCR及测序结果表明，分离菌株能扩增出约822bp的特异性目的片段，大小与预期相符，对照样品无任何条带，详细结果见图3、图4.综合分离菌的培养特性、菌落形态、生理生化反应以及PCR鉴定结果，可确定此分离菌为副猪嗜血杆菌.2.3 致病性试验致病性试验结果表明，接种菌液的试验组小白鼠喜卧、精神萎靡、食欲降低、反应迟钝，并在48 h内先后发病或死亡.解剖结果表明，病变主要集中在肺脏，有出血和水肿现象.其中3只在接种后24 h内死亡，2只在48 h内死亡，而对照组小鼠均健康存活，无明显症状.对死亡小白鼠剖解采集心血进行种菌回收试验表明，都能分离到形态特征及生化特性与副猪嗜血杆菌相符合的菌，且均能扩出大小为821的副猪嗜血杆菌16S rRNA基因特异性片段.以上结果表明，该分离菌株确为HPS，且是致病性较强的菌株.2.4 药敏试验HPS药敏试验结果表明，该分离菌株对新霉素、头孢噻肟、头孢三嗪、氧氟沙星、头孢拉啶等较敏感，对青霉素、链霉素、磺胺甲唑、林可霉素、苄唑西林等多数抗生素耐受.详细结果见表2.随着规模化、集约化养猪的发展，副猪嗜血杆菌病在我国各大猪场的带菌率、发病率和死亡率均呈上升趋势，给我国的养猪业造成了巨大的经济损失[11].当前，由于我国养殖环境的恶化，猪病复杂多样，病原错综复杂，很难从临床症状确定病原菌.对于副猪嗜血杆菌病的鉴定，依然主要依靠细菌的分离鉴定，但由于副猪嗜血杆菌的培养较其它细菌营养要求高，因而在临床实践中较难分离到菌株，需在培养基中添加特殊的营养因子如NAD和小牛血清等，才能提高分离的成功率[12].此外，由于目前各养猪场在实际养殖过程中广泛使用抗生素，这也是造成副猪嗜血杆菌分离率比较低的原因之一[13].本研究在分离病原菌时，先对病猪临床症状进行初步诊断后，要求养猪场主对患病猪停用抗生素3 d后，再采集患病猪的关节液、心包液等作为病料样品.同时，在患病猪采样后4 h内接种培养基进行病原菌的分离.通过以上几种措施，大大提高了副猪嗜血杆菌的分离率.通过对分离菌的培养特性、菌落形态、生理生化反应以及PCR鉴定结果的综合分析，可确定该分离菌为即为副猪嗜血杆菌，为该病的临床防治和进一步的实验研究提供了科学依据.目前，副猪嗜血杆菌存在多个血清型，已确定的有15个[14].在已鉴定的血清型中，强毒株有1、5、10、12、13和14型，中等毒株有2、4、15型，无毒力菌株有6、7、8、9和11型，另有20%以上的菌株不能定型[15-16].由于副猪嗜血杆菌血清型众多，交叉免疫保护性很弱，各地流行菌株差异大，因此养殖场很难使用到与本场对型的疫苗，从而造成副猪嗜血杆菌病的疫苗免疫效果普遍不理想.因此,在副猪嗜血杆菌病的防控方面，采用对本场流行菌株进行分离鉴定并进行药敏试验筛选敏感药物进行保健和治疗成为防控该病的关键.同时，由于HPS不仅血清型多，而且耐药性产生也快，因而应定期采集样品分离菌株并做药敏试验，以便指导生产科学合理有效用药.本研究结果表明，该发病猪场流行菌株为副猪嗜血杆菌强毒株，该菌株对磺胺甲唑、林可霉素、苄唑西林、青霉素、链霉素等多数抗生素耐受，而对新霉素、头孢噻肟、头孢三嗪、氧氟沙星、头孢拉啶等较敏感.因此，在临床用药时，应该根据药敏实验结果，选择新霉素、头孢噻肟等敏感药物对该病进行治疗.。

副猪嗜血杆菌的分离鉴定和药敏试验研究

ｄｉｎｇｃｕｒｏｍｐｏｓｉｇｏｓｒｗｍａｅａｓｕｄｉｄｕｓｎｇｔｎｆｔａｔｒｌｉｔｅｉ
【］史玉英，沈其荣，娄无忌等．纤维素分解菌群的分离和１
ｐｏｐｏｉｉｆｔａｉａａｙｉ［］ＦｍｓＭｉｒｂｏｏｙｈｓｈｌｄａｒｐｙｃｄｎｌｓｓＪ．ｅｃｏｉｌｇＥｏｏｙ１９，７１：－０ｃｌｇ，９８２（）９２．
ａｐｏｃ［．ｕｏｅｎＪｕｎｌｆＳｉＢｏｏｙ２０，９３：ｐｒａｈＪＥｒｐａｏｒａｏｏｉｌｇ，０３３（）］ｌ
１．４．４１１８
［］ＫＬＡＭＥＭ，Ｂａｔｅ６Ｒａｈ．Ｍｉｒｂａｃｍｍｕｉｄｎｍｉｓｃｏｉｌｏｎｔｙａｃｙ
维普资讯
山东畜牧兽医
２Ｏ年第２卷Ｏ８９
副猪嗜血杆菌的分离鉴定和药敏试验研究
宋风香①② 闰振贵① 姜世金
（山东农业大学动物科技学院泰安 ① ２１１ ②德州市畜牧局）７０８摘要从山东某繁育猪场送检的疑似病例中分离到４株革兰氏阴性细小杆菌，通过培养特性试验和生化试验初步诊断为副猪嗜血杆菌，根据副猪嗜血杆菌１ＳｒＮＡ序列设计引物，进行ＰＲ鉴定，结果６ＲＣ表明４株分离菌株为副猪嗜血杆菌。对４株分离菌株进行小白鼠毒力试验和药敏试验，结果表明，４株分离菌能致死小白鼠，对头孢他啶、头孢噻呋、氧氟沙星、多西环素、环丙沙星敏感，对土霉素、链霉素、林可霉素抵抗。关键词副猪嗜血杆菌分离鉴定药敏试验

副猪嗜血杆菌安徽株分离鉴定与药敏试验

副猪嗜血杆菌（ｅｏｈｕａａｕＰ是猪ＨａｍｐｉｓＰｒｉＨ）ｌｓｓＧａｓ，病的病原菌，于巴斯德菌科嗜血杆菌属【１ｓｒｅｓ属ｌ】。Ｈ是一种多形态、溶血性、Ｐ非不运动、Ａ烟酰胺ＮＤ（腺嘌呤二核苷酸）依赖型、兼性厌氧、芽孢的革兰无氏阴性短小杆菌［２１对营养要求严格。它生长时需要血液中存在生长因子，人工培养时必须供给含有Ｖ因子（Ａ或ＮＤ）ＮＤＡＰ的新鲜血液才能生长１Ｐ３１。Ｈ是猪上呼吸道条件性常在菌。引起猪以纤维素性浆膜炎、多发性关节炎和脑膜炎为特征的传染病ＤＩ。副猪嗜血杆菌可以影响２周龄到４月龄的青年猪，主要在断奶后和保育阶段发病。通常见于５８～周龄的猪，发病率一般在１％～５严重时死亡率可达５％。Ｈ有０１％．０Ｐ１个以上血清型．５其中血清型５４１最为常见【、、３ ¨ 。随着世界养猪业的发展该病已成为全球范围内影响养猪业的典型细菌性疾病。近年来．由副猪嗜血杆菌所引起的猪群多发性浆膜炎和关节炎在我国各地屡有发生。蔡旭旺等Ｉ５Ｊ研究表明，副猪嗜血杆菌病在我国普遍流行。０６年３月安徽蚌埠某养猪２０场断奶仔猪群突然发病，临床症状主要表现为精神沉郁、呼吸困难、气喘、被毛粗乱、消瘦、跛行和关节肿大等；剖检病变主要表现为纤维素性胸膜炎、腹膜炎、心包炎、关节炎和脑膜炎等。根据以上情况，笔者怀疑为副猪嗜血杆菌病．随机采集病料进行实验室病原分离鉴定及药敏试验。现报告如下。
１材料与方法

副猪嗜血杆菌河南分离株的分离鉴定及药敏试验

73 2014年第11期 SWINE INDUSTRY SCIENCE 猪业科学可以安排在30～35日龄左右接种，3周后再加强免疫1次。

由猪蓝耳病抗体检测结果可知妊娠80 d 母猪、哺乳母猪和哺乳仔猪阳性率均为100%，60日龄仔猪阳性率70%，80日龄仔猪阳性率60%。

母猪抗体水平很高，根据该场的疾病史推测，可能母猪群还有排毒的母猪。

根据伪狂犬gE 抗体的检测结果推测，该场伪狂犬野毒感染率极低，70份血液中只有1份为阳性，接近阴性场的表5 猪免疫背景 mL水平。

但伪狂犬gB 抗体的结果不理想。

母猪曾经在5月份普免过伪狂犬病疫苗，但抗体水平整齐度很差，特别是妊娠母猪阳性率为50%，哺乳母猪虽然都为阳性，但数值差异较大，应检查该场的疫苗接种流程及注射疫苗的执行力度。

60及80日龄猪群的抗体水平也不理想，可能与接种伪狂犬病疫苗的时间过早（45日龄）有关，通常情况下伪狂犬病母源抗体的免疫期可持续到70日龄，多数厂家建议的接种伪狂犬病疫苗的时间也是70日龄左右。

伪狂犬病作为一个旧病复燃的疾病应引起高度重视，去年在其他省份的伪狂犬病发病率和死亡率都很高，今年在四川也发现较多伪狂犬病病例。

建议加强伪狂犬病的免疫接种，5月普免至今也接近4个月，应该抓紧时间再普免一次。

商品猪的伪狂犬病免疫可采取3日龄滴鼻，二免接种日龄可适当延后。

参考文献[1] 陈溥言.兽医传染病学[M].5版.北京：中国农业出版社，2006： 23-24.[2] 朱建国，曹福顺.疫区猪群猪瘟免疫力水平评价标准的研究[J].中国预防兽医学报，2000,22（2）：154-155.[3] 母安雄，谷根林，蒋建一，等.规模猪场主要疫病抗体水平监测及免疫效果分析[J]. 畜牧与兽医，2002，34（3）：29-31.[4] 蓝寿康，黄引贤.猪伪狂犬病病毒主要特性的初步研究[C]//中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第4届全国会员代表大会暨第7次学术研讨会论文集．上海：1997：196-204． [5] 卢洪芬．猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）概述[C]//中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第8次学术研讨会论文集.襄樊：1999：238-239．(收稿日期：2014-09-15)副猪嗜血杆菌河南分离株的分离鉴定及药敏试验董永军1，2，王丽荣1，2，赵俊江1（1.河南科技学院动物科学学院，河南新乡 453003；2.河南科技学院抗体工程重点实验室，河南新乡 453003）副猪嗜血杆菌(HPS) 是一种多形态、非溶血性、不运动、NAD 依赖型、革兰氏阴性细小杆菌，属于巴斯德杆菌科嗜血杆菌属。

副猪嗜血杆菌病病原的分离鉴定与药敏试验

血杆菌。经药敏试验显示，副猪嗜血杆菌对氨苄青霉素、那霉素、大霉素等药物敏感。卡庆
关键词：副猪嗜血杆菌；离；鉴定；药敏试验分中图分类号：￥５．１８２６２文献标识码：Ａ文章编号：０４２８２０）０１４— ３１０ —３６（０６ｌ一Ｏ００
发展，规模化养殖和饲养的高度密集化，以及呼吸道
综合征等因素，得该病日趋流行，使同时危害也日渐
严重。近２年来，国由副猪嗜血杆菌引起猪多发我性浆膜炎和关节炎的报道屡见不鲜，别是在集约特
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２００６年第１０期
副猪嗜血杆菌病病原的分离鉴定与药敏试验
王金合王居强陈益朱鸿昌。，，，
（．州牧业Ｔ程高等专科学校，南郑州４０１；１郑河５０１
（．ｅｚｕＣｏｌｇｅｏ１ＺｈｎｇｈｏｌｅｆＡｎｉｌＨｕｂｎｙａｇｎｅｒｎｇ，Ｚｎｚｕ４０１，ｍａｓａｄｒｎｄＥｎｉｅｉｈｅｇｈｏ５０１Ｃｈｉａ；２ｎ．Ｈｅａ（ｅｔｒｏｇｎｅｒｎｇｎｎ；ｎｅｆＥｎｉｅｉａｄＴｅｈｉａｎｅｔｌｎｃｎｃｌｉＢｅｆＣａｔｅ，Ｚｈｅｇｚｏｕ４００３，Ｃｈｉａ；３．ｃａｇＡｎｉｌＩｐｒｖｎｔｔｏＸｕｈｎ１００，ｉ）ｎｈ５０ｎＸｕｈｎｍａｍｏｉｇＳａｉｎ，ｃａｇ４６０Ｃｈｎａ

仔猪副猪嗜血杆菌的分离鉴定及耐药性检测

DOI：10.16174/j.issn.1673-4645.2023.06.032收稿日期：2022-12-07作者简介：陈新湖（1967-），男，汉族，湖南祁东人，大专，中级兽医师，主要从事兽医方面的研究推广工作仔猪副猪嗜血杆菌的分离鉴定及耐药性检测陈新湖(湖南省衡阳市祁东县金桥镇农业综合服务中心,湖南衡阳421600)摘要:为了了解湖南省衡阳市祁东县不同规模化养猪场及散养户中仔猪副猪嗜血杆菌的流行情况和耐药性。

采集衡阳祁东地区不同规模化养猪场及散养户中患呼吸道病死仔猪的口鼻拭子、胸腔积液、肺脏等病料组织187份,采用细菌分离培养、形态学观察、卫星试验和PCR 方法进行副猪嗜血杆菌鉴定,并采用人工感染小鼠试验和K-B 药敏纸片法分别检测副猪嗜血杆菌的致病性和耐药性。

结果显示,从采集的187份病料样品中分离到78株副猪嗜血杆菌,分离率为41.7%,其中分离的50株副猪嗜血杆菌可以引起小白鼠死亡,为致病性菌株;此50株致病性副猪嗜血杆菌对青霉素、阿莫西林、氨苄西林等8种药物的耐药率在44.0%~50.0%之间,对其他药物的耐药率为4.0%~44.0%。

本研究为仔猪副猪嗜血杆菌病的合理用药及防控提供参考。

关键词:仔猪;副猪嗜血杆菌;分离鉴定;致病性;药敏试验中图分类号:S828;S852.61文献标识码:A文章编号:1673-4645(2023)06-0142-04开放科学(资源服务)标识码(OSID ),扫一扫,了解文章更多内容副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,Hps ）为临床中常见的条件性致病菌之一，该菌广泛存在于自然界的养殖环境中，还存在于猪的上呼吸道中，尤其是在养猪过程中，如果饲养管理不当、应激（如天气骤变、转群、运输）等导致猪的免疫力下降，容易引发副猪嗜血杆菌病[1-3]。

副猪嗜血杆菌具有多种血清型，可以感染不同阶段的猪只，尤其是对4～8周龄的仔猪最易感，其感染率和死亡率均较高，临床中以呼吸困难、纤维素性胸膜炎、肺炎及关节炎等多种症状最常见，经常与免疫抑制性疾病如猪圆环病毒病、猪瘟、猪蓝耳病等混合感染，可以导致猪的高感染率和高死亡率[4-7]。

副猪嗜血杆菌的分离鉴定和药敏试验

（．ｌ业大学动物医学院，ｌｌ１１ｌ￣Ｊ农￣Ｊ雅安６５１；．物疫病与人类健康ＩＪ省重点实验室，ｌ２０４２动￣ｆｌｌ四川雅安６５１）２０４
摘
要：用细茵学检测方法和ＰＲ技术对来自四川省遂宁市某规模化养猪场疑似副猪嗜血杆茵采Ｃ
要的猪的病原菌。在我国很多地区也时常存在该病
ＡＡＧＣＣＣＴＴ．由上海生工生物工程技术ＣＣＣＴＣ３，服务有限公司合成。按说明书稀释后一２Ｏ℃保存
备用。
的流行和发生［ｓ，００年６月～９月四川省遂宁市ｚ］２１－
ＨＰ，报告如下。Ｓ现
１２１细菌分离培养．．
１１３培养基的制备．．
ＴＢ培养液、Ｓ平板参ＳＴＡ
照文献［］６的方法制备，ＮＡＤ和血清平板分别按照
２．／０／ｍＬ和５的浓度加入。Ｌｇ
１２方法．
和药敏试验，采集发病的猪肺脏等病料进行了细对菌学检测，果分离出１株具有较强致病性的结
吸困难、消瘦、关节肿胀、跛行和被毛粗乱；检可见剖
胰蛋白胨，酵母提取物，量生化试管和药敏纸片，微
购自杭州微生物试剂有限公司；生牛血清，ＡＤ，新Ｎ

一例副猪嗜血杆菌的分离鉴定及防治措施

副猪嗜血杆菌是严重威胁养猪业的重大细菌性病原体之一，是猪呼吸道疾病综合征的一种主要原发性病。

副猪嗜血杆菌是需氧或兼性厌氧的巴斯德氏杆菌科的革兰氏阴性菌，血清型众多，目前已确定的有15种，尚有一些未定血清型即不可分型（NT ），且不同地区的副猪嗜血杆菌血清型有所差异，4、12和14型等是我国主要流行血清型。

副猪嗜血杆菌易感1～4月龄的仔猪和保育猪，主要存在于猪的上呼吸道。

该病原菌为条件性致病菌，当猪群免疫力低下时易于感染，单独感染时可导致多发性浆膜炎、多发性关节炎以及脑膜炎，其中以格拉瑟氏病为典型特征。

该菌可经直接接触、空气和污染物进行传播。

当前该病流行正呈上升趋势，常与其他猪病如猪圆环、猪繁殖与呼吸综合征等混合感染而导致发病率和死亡率均较高。

临床患猪多表现呼吸困难、关节肿大、发热、共济失调等症状，给猪场造成严重的经济损失。

本试验对山东省滨州市某猪场疑似副猪嗜血杆菌感染的发病猪进行了病原菌的分离鉴定、血清型鉴定、药敏试验等，为其他类似疾病的诊治提供参考依据。

1发病情况自2020年4月开始，山东滨州某猪场内17日龄仔猪陆续出现精神委顿，体温升高，畏寒扎堆，呼吸急促，被毛粗乱，食欲不振，逐渐消瘦。

有的仔猪腿关节肿胀，卧躺在地，发病1周左右死亡，病死猪多皮肤及黏膜发绀。

初步统计产房哺乳仔猪死亡率可高达34%。

养殖场内兽医初步怀疑为副猪嗜血杆菌病，采用氟苯尼考、氨苄西林进行试探性治疗，但效果不理想。

2病理剖检随机选择三只病死猪进行临床剖检，可见胸、腹腔积液增多，有少量的纤维素，各脏器普遍有纤维素性渗出物，胸腔内纤维素性浆膜炎、纤维素性胸膜肺炎、关节炎等病变明显，病变的关节周围肿大，且有波动感，剖开后有大量清亮积液流出。

3细菌分离3.1病料采集无菌条件下收集腹腔和关节处积液，进行实验室诊断。

3.2细菌分离取适量采集的积液接种在含10%新生牛血清、0.02%氧化型辅酶I 的TSA 培养基上，用无菌接种环涂抹均匀，放置于5%CO 237℃恒温箱内培养24～48h ，观察平板。