哺乳动物腔前卵泡体外培养研究进展

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哺乳动物卵母细胞体外成熟培养的研究

陕
西
农
业
科
学
哺乳动物卵母细胞体外成熟培养的研究
王俊全。守杰，李洪伟，魏恒，娟娟李
（南职业技术学院，西渭南７４０）渭陕１００
摘要：乳动物卵母细胞体外成熟培养一直因素又表现在哺而
细胞成熟发育能力对其后的受精率、胚胎卵裂率、囊胚形成率均具有直接的影响，制约体外生产是囊胚率和胚胎移植受胎率的关键。为了探索形成大量早期胚胎所需的成熟卵母细胞来源，内外国许多学者对哺乳动物卵母细胞体外培养特别是对
结构、卵母细胞的获取等几个方面详细分析了其对哺乳动物卵母细胞体外培养的影响，卵母细为
成物质逐级传向外层卵丘细胞和外层卵丘细胞合成物逐级传送给卵母细胞起重要作用。弓超通过
试验对牛卵母细胞不同形式的处理，论细胞问讨
帽状；仁内出现的纤维中心最多，尚未发生致核但
密化。到直径３５． —５ｍｍ卵泡，粒细胞突起开颗
ｔｎＩｉ，ＶＭ）指离体条件下的卵母细胞在模拟体ｏ是内的生长环境培养，其在体外达到成熟。卵母使
四个方面：是卵母细胞的超微结构中线粒体、仁、胞间隙、质颗粒等微结构的变化；二，母细胞获一核细皮第卵取时卵泡的直径、卵母细胞的采集时期、卵方法、采运输时间以及卵丘一一卵母细胞复合体的级别；三，第卵母

哺乳动物小腔卵泡卵母细胞体外成熟的研究进展

摘要：绍了哺乳动物小腔卵泡卵母细胞体外成熟的研究现状，小腔卵泡卵母细胞体外成熟的采集方法、养介对培时间、清、素等影响因素进行了分析，出了存在的问题及解决办法．血激指
起步相对较晚．２在０世纪７０年代，者们大多以学
啮齿动物为研究对象，ＰＩＥＰＧ和ＳＳＮ证明，鼠ＵＡ小和大鼠的腔前卵泡卵母细胞和小腔卵泡卵母细胞在体外可完成其生长过程，获得完成成熟分裂和正
４月
文章编号：００— ３０２０）２— ２７— ５】０２４（０７００３０
Ｎ？动物小腔卵泡卵母细胞体外成熟的研究进展Ｌ
郑培栋王新庄，，夏霞
（．南农业大学牧医工程学院，南郑州４００；．南省肉牛工程研究中心，南郑州４００）１河河５０２２河河５０３
哺乳动物个体卵巢内含有数以万计的卵泡，其数量因发育阶段不同而异．绝大多数卵泡于出生但前后退化，卵泡发育过程中的任何阶段均可发生在闭锁，因而在哺乳动物的一个生殖周期中能够发育成熟并排卵的卵泡只有一个或几个．如小鼠出生时约有１万个，和家畜约有几百万个，人到初情期时，小鼠约为４００个，羊，约为１０绵牛０万个，约４猪０万个．着胚胎工程技术研究的深入和胚胎移植商随

不同浓度褪黑素对体外培养猪腔前卵泡生长发育的影响

不同浓度褪黑素对体外培养猪腔前卵泡生长发育的影响毛梦菌，吴佳俊，高　倩（衢州市衢江区畜牧兽医站，浙江衢州３２４０２２）摘要：研究腔前卵泡的体外培养可以深入了解卵泡发育生长机理以及卵母细胞与周围颗粒细胞、膜细胞之间信息交流机制。

猪卵巢采用机械法分离卵泡，随机分为五组：基础培养组、ＭＴ１０－１１Ｍ组、ＭＴ１０－９Ｍ组、ＭＴ１０－７Ｍ组、ＤＭＳＯ组。

基础培养组以ＤＭＥＭ／Ｆ１２为基础培养基，添加１０ｍＵＦＳＨ、７．５％ＦＢＳ、１％ＩＴＳ、１００μｇ／ｍＬＬ－ＡＡ进行培养；ＭＴ１０－１１Ｍ组、ＭＴ１０－９Ｍ组、ＭＴ１０－７Ｍ组、ＤＭＳＯ组分别在上述培养基中加入１０－１１Ｍ、１０－９Ｍ、１０－７Ｍ浓度的ＭＴ及０．１‰浓度的ＤＭＳＯ后培养。

在３７℃、５％ＣＯ２培养箱中培养４ｄ，每４８ｈ更换半量培养液一次，每次５０μＬ。

培养结束后进行分组收样，进行ＲＮＡ表达水平的分析比较。

在本实验研究浓度范围内，褪黑素对于体外培养猪腔前卵泡的生长没有显著影响。

在体外培养体系中添加褪黑素具有抑制卵泡细胞凋亡的作用，其中１０－９Ｍ浓度的ＭＴ抗凋亡效果最明显。

关键词：褪黑素；猪；腔前卵泡；体外培养中图分类号：Ｓ８１４．８　文献标识码：Ａ　文章编号：１００５－７３０７（２０２１）０２－０００６－００４哺乳动物卵巢中含有大量的腔前卵泡，但是在发育到有腔卵泡前大约有９９．９％的卵泡都走向闭锁、退化，这无疑是动物繁殖领域内巨大的浪费。

卵母细胞是体外受精、胚胎移植、动物克隆和转基因等胚胎生物技术研究和开发不可或缺的材料，然而卵母细胞来源十分匮乏成为其发展的一个制约性因素，无疑腔前卵泡的体外培养技术为其提供了一个有效途径。

褪黑素（ＭＴ）在生殖调控中具有重要作用，在人排卵前卵泡液中发现了高水平的褪黑素，提示褪黑素有可能直接参与卵泡的生殖调控。

１　材料与方法１．１　试验材料　猪卵巢从北京市郊区屠宰场采集，经灭菌生理盐水洗涤后，在装有３７℃添有双抗的灭菌生理盐水的保温瓶中２ｈ内运回实验室。

绵羊和山羊卵母细胞体外成熟研究进展

绵羊和山羊卵母细胞体外成熟研究进展王中伟，岳顺利，周佳勃∗东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨（150030）E-mail:wzw006336@摘要：本文介绍当前在绵羊和山羊卵母细胞采集和体外成熟方面的研究进展。

卵巢经过促性腺激素处理后能够提高可采集卵泡的数量。

卵母细胞采集方法分为从死亡动物和活体采卵两大类。

死亡动物采卵主要有抽吸法和切割法。

缺点是得到的是不同发育阶段的卵母细胞，而且要牺牲供体的生命。

先进的活体采卵技术有两种分别是腹腔镜采卵和超声波引导阴道穿刺采卵。

它们优点是对母羊损伤小、利用率高。

卵母细胞冷冻保存有助于提高优质卵母细胞的利用率。

最后还阐述了影响卵母细胞质量和产量的因素，例如，激素、血清、卵泡液、生长因子等一些因素的作用。

关键词：绵羊，山羊，卵母细胞，采卵，体外成熟中图分类号：S8111 引言中国养羊业历史悠久，绵羊和山羊品种多样，羊产品也十分丰富。

绵羊和山羊不但具有经济价值，而且可以作为许多疾病研究的很好的实验动物模型。

近些年，国内外在家畜生殖技术研究，特别是在绵羊和山羊的生殖技术方面取得了很大进展，例如第一个体细胞核移植成功的动物就是绵羊。

此外，这些应用在绵羊和山羊上的生殖技术还可用于保护野生濒临灭绝的小型反刍动物[1]。

众所周知，卵母细胞体外成熟（IVM）是进行体外胚胎生产（IVP）、克隆以及辅助生殖（ART）的基础。

本文介绍了目前绵羊和山羊卵母细胞成熟技术的研究进展和影响因素。

2 卵母细胞的采集和保存2.1采集前的促性腺激素处理绵羊或者山羊卵巢经过促性腺激素处理后能够提高可采集卵泡的数量，性未成熟羔羊经促性腺激素处理后也可做为供体[2]。

研究表明，促性腺激素处理羔羊得到的卵母细胞数量高于同样处理的成年山羊，但是二者卵母细胞的体外发育的情况却相似[3]。

绵羊经FSH处理两天得到的卵母细胞的回收率和卵裂率大于处理三天。

在绵羊同步发情实验中发现，恒定剂量处理比递减剂量FSH处理获得的卵母细胞质量更好而且对冷冻保存的耐受能力更强[4]。

哺乳动物腔前卵泡的分离

【图分类号１８８中号１６２２７（０）３０１ — ０１７ — ０８０７ — ０９３２０
随着胚胎移植、外受精、别鉴定、物克下发育良好的卵巢，来分离腔前卵泡。前卵泡体性动用腔隆、因转移等技术的发展，基卵母细胞来源匮乏成的生长发育及数量受激素水平的调节，处于黄体功为制约这些技术研究进展的主要因素：辟胚胎移能期的卵巢，酮分泌水平较高，制垂体ＦＨ的开孕抑Ｓ植等所需的大量优质卵母细胞的来源，来越受到释放，论上，体较大的卵巢腔前卵泡较少，是越理黄但重视。目前来看，前卵泡（ｒａｔｌｏｌｌ）腔ｐｅｎｒｆｌｃ的分离黄建明等研究表明：体为火山口型、菇型及圆ａｉｅ黄蘑和培养技术的发展有望解决卵母细胞短缺的问题。锥型的卵巢，上拥有的腔前卵泡数量多于黄体为其哺乳动物卵巢皮质部有大量处于不同发育阶扁平状和表面无黄体的卵巢；这可能是因为较大黄段的卵泡卵母细胞，多数以腔前卵泡形式存在，体能使组织结构变松，于腔前卵泡的释放，大易此外，包括原始卵泡（ｒｒｉｌｃ）初级卵泡（ｒｒ黄体多时次级卵泡和初级卵泡较多；Ｈｌｏ等报ｐｉｄａｆｌｌ、ｍｏｌｏｉｅｐｉｙｍａｕｓｆｈｆｌｃ）次级卵泡（ｅｏｄｙｆｌｃｅ，发育到成道：牛卵巢中存在６０ｏｌｌ和ｉｅｓｃｎｒｌｌ）能ｏｉ胎８００± ２０腔前卵泡，１０个０熟并排卵的不足１其余都在发育过程中闭锁退但是实际仅能采集到３００左右。由此可见，％，０个实化。腔前卵泡的研究起步较晚，７代以前已有际采集量与理论值相差很大，择恰当的卵巢有利０年选过分离卵巢卵泡的尝试，到了原始卵泡、级卵于腔前卵泡的分离。得初泡和排卵前卵泡；随后，ｃｓＮｉｉ（９５使用胶原ｏａ等１７）２腔前卵泡的分离方法酶建立起一套分离家兔各级卵泡的技术，是真正但腔前卵泡的分离目的是为了用于体外培养，要取得突破性进展是Ｅｐｇ（９９首次对小鼠腔前ｐｉ等１８）分卵泡卵母细胞发育能力的研究，明在适宜的体外求有足够的数量和较高的指质量，离时应尽量保证护腔前卵泡中卵母细胞的结构完整性，离方法因分培养条件中腔前卵泡能发育并行成成熟卵子，标志大类着开发和利用腔前卵泡的可能性；国内，涌等研究者及目的不同而有些差异，体上可分为３：在张酶机于１９９５首次对小鼠腔前卵泡进行了培养并获得了机械分离、消化分离和酶消化．械分离法。成熟卵子。目前，前卵泡分离的研究已见于多种２１机械分离法腔．动物，ｉｕｉｄ．Ｒ等用机械和酶处理法对牛腔前ＦｇｅｅｏＪｒ．２１剪碎法（ｕｉｍｅｏ）该方法是最早用于．１．ｃＲｎｔｄｇｈ卵泡进行了分离，潘红等用“ 梳法” 刮对水牛腔前卵腔前卵泡的分离方法，具体做法是： ①用含青霉素泡进行了分离。腔前卵泡的分离虽然有了很大的和链霉素的生理盐水将卵巢清洗２～３次，去卵剪发展，是由于多种因素的影响，离方法一直制但分巢周围的脂肪组织以及系膜韧带等结缔组织。② 约着有关研究工作的开展，此，文就卵巢的选为本沿卵巢门将卵巢切开，去掉髓质及黄体组织，用再择、前卵泡的分离方法和卵泡的评价等方面作一腔３７～３ ℃ 的ＰＳ清洗２～３次，吸去组织表面液９Ｂ综述，望能为今后的研究有一定的指导意义。希体。将余下的卵巢皮质部放入６ｍｌ含５Ｌ洗 ⑨ ０ｉｌｍ

牛腔前卵泡在体外无血清培养中发育为有腔卵泡

前卵泡的生长未表现促进作用。
关键词：；前卵泡；外培养牛腔体
中图分类号：８３３Ｓ２．文献标识码：Ａ文章编号：０５４４（０２０ — ５８Ｏ１０５５２０）５０１２
培养成熟、外受精，下后代，样在一定程度上增加了对体产这
母牛优良遗传资源的利用。然而。目前的体外受精技术，限只
于从卵巢上获取有腔卵泡内的卵母细胞。如何扩大优质卵母
周虚ＲｏｅｔＷｅｂ（．，ｂｒｂ。１解放军军需大学动物科技系，吉林长春１０６；．国诺丁汉大学生命科学学院）０２２英３
摘要：无血清培养系统研究了牛腔前卵泡的体外培养。直径为１０２０ｍ的牛腔前卵泡在添加Ｌ谷氨酰胺、用Ｏ～０ＢＡ、酮、铁蛋白和硒的Ｍｃｏａ培养液中培养，泡保持正常的形态结构并持续生长，养１左右形成卵Ｓ睾转ＣｙＳ５卵培０ｄ泡腔．腔率约５。培养液中添加胰岛素对卵泡直径的增长和卵泡腔的形成有明显的促进作用．添加ＦＨ对腔成Ｏ但Ｓ
卵泡库很少的比例，大部分卵母细胞均未被利用，成遗传绝造资源的极大浪费。年来。外受精等生物技术的发展提高了近体卵母细胞的利用效率，体内未排卵的卵泡卵母细胞经体外即

小鼠腔前卵泡体外培养成熟-染色体分析技术的建立

小鼠腔前卵泡体外培养成熟-染色体分析技术的建立梅树江;林晓潭;王晓梅;林苏霞;许锦贝;程锦泉;马汉武;谢旭【期刊名称】《癌变·畸变·突变》【年(卷),期】2009(021)006【摘要】背景与目的:初级卵母细胞生长过程中对理化因子反应敏感,拟建立小鼠腔前卵泡体外培养成熟(IVG)-染色体分析技术,为生殖毒理学提供有效的检测模型.材料与方法:采用机械分离法从12～14日龄昆明小鼠的卵巢中分离出直径为140～160 μm的腔前卵泡,单个卵泡放入微液滴培养体系中,隔天半量换液,连续培养10 d,对成活卵泡体外诱导超排,于16～24 h后,检测卵母细胞成熟情况,分别计数停滞在生发泡期(GV)、生发泡期破裂(GVBD)和排出第一极体(PB)的卵母细胞数,对卵母细胞进行染色体数目与结构分析,并与体内发育体外成熟卵母细胞(IVM)及体内超排成熟卵母细胞(IVC)进行比较分析. 结果:从4只小鼠卵巢中分离得到332个腔前卵泡,培养早期卵泡直径增长显著,随后呈"摊鸡蛋"样生长,部分形成假腔.培养10 d后存活率为95.78%(318/332).激素诱导排卵后,卵丘.卵母细胞复合体排出率72.01%(229/318),其中11.80%(27/229)停滞在GV期,39.30%(90/229)发生GVBD,47.16%(108/229)发育成熟,排出第一极体(PB),1.74%(4/229)发生孤雌活化.IVG与IVM、IVC两种方法获得的卵母细胞染色体对比分析,未见明显的染色体数目与结构异常. 结论:小鼠腔前卵泡体外培养成熟,可获得与体内生长相同的成熟卵母细胞,染色体分析未见异常,可成为一种良好的生殖毒理学体外检测与卵泡发育机制研究模型.【总页数】4页(P463-466)【作者】梅树江;林晓潭;王晓梅;林苏霞;许锦贝;程锦泉;马汉武;谢旭【作者单位】深圳市疾病预防控制中心,广东深圳518020;深圳大学医学院生物医学重点实验室,生理学,教研室,广东深圳518060;深圳大学医学院生物医学重点实验室,生理学,教研室,广东深圳518060;深圳大学医学院生物医学重点实验室,生理学,教研室,广东深圳518060;深圳大学医学院生物医学重点实验室,生理学,教研室,广东深圳518060;深圳市疾病预防控制中心,广东深圳518020;深圳市疾病预防控制中心,广东深圳518020;深圳市疾病预防控制中心,广东深圳518020【正文语种】中文【中图分类】Q25【相关文献】1.小鼠腔前卵泡三维培养成熟后受精体系的建立及优化 [J], 曾荔苹;王晓梅;侯震晖;林桂淼;李慧;林苏霞;林晓潭;朱玥荃;蔡志明2.小鼠腔前卵泡无血清体外培养的研究 [J], 张耀君3.小鼠腔前卵泡体外培养中BMP-6和GDF-9的表达 [J], 王喜艳;姚健;徐邦生4.小鼠腔前卵泡卵母细胞的体外培养、体外成熟和体外受精研究 [J], 李朝军;王斌;范必勤;刘智慧;阮金度5.Rho/ROCK抑制剂Y27632对小鼠腔前卵泡体外培养的影响 [J], 俞晓丽;蒲静;罗晓强;刘心蕊;邱意开;张樱馨;裴秀英因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

哺乳动物卵母细胞体外成熟的研究进展

成熟分裂的核网期、ＡＩＴＩＭＩ、、和第２次成熟分们将处于这一时期的卵母细胞称为前期停滞的卵母
裂的间期而达到ＭⅡ。着卵母细胞的发育，随生发泡细胞（ｒｐａｅｂｏｋｄｏｃｔｓ，ｐｏｈｓ— ｌｅｏｙｅ）自卵巢表面卵泡中ｃ
增大，由中央移向质膜，紧靠脂膜下。核膜打褶而抽取的卵母细胞就处于这个时期（发泡期，Ｖ并生Ｇ
达９％以上。０然而，体外成熟卵母细胞的质量和发育空泡，线粒体由小嵴、圆形或椭圆形转变为带帽线粒潜能与体内成熟的卵母细胞相比仍有较大差距，这体，是卵母细胞成熟的另一重要标志。粒体先移这线
到完全成熟。此后，卵母细胞的体外成熟培养得到了中皮质颗粒排列到质膜下被认为是哺乳动物卵母细迅速发展。目前，卵母细胞的体外成熟技术己被广泛胞成熟的一个重要标志｝１ｊ。随着卵母细胞的退化，皮应用于科学研究、畜牧生产和医学生殖工程中，、质颗粒则成堆分布，牛并有许多排到卵周隙中。电镜在羊未成熟卵母细胞经体外培养，排出第１体率可下，极线粒体由近核区移向皮质膜下区，一端出现大在
不完全成熟是造成体外受精胚胎生产效率低的主要断定的。卵丘细胞扩展常用作判断卵母细胞体外成
原因。
熟的特征。
２卵母细胞的成熟过程卵母细胞成熟是指充分生长卵母细胞向成熟卵

家畜类腔前卵泡体外分离方法及其影响因素研究进展

四川动物２００９年第２８卷第６期ＳｉｃｈｕａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＺｏｏｌｏｇｙＶ０１．２８Ｎｏ．６２００９家畜类腔前卵泡体外分离方法及其影响因素研究进展张耀君，王昭晖，文瑞丽，师红，吴民耀’（药用资源与天然药物化学教育部重点实验室。

西北濒危药材资源开发国家工程实验室，陕西师范大学生命科学学院，西安７１００６２）摘要：回顾腔前卵泡体外分离方法的研究历史，着重论述牛、羊、猪等家畜的腔前卵泡体外分离方法及其影响因素，以期为建立一种更为有效的分离方法提供理论基础。

・关键词：家畜；腔前卵泡；体外分离；影响因素中图分类号：￥８１４．８文献标识码：Ａ文章编号：１０００—７０８３（２００９）０６—０９４９—０３ＡｄｖａｎｃｅｓｏｆｔｈｅＲｅｓｅａｒｃｈｏｎＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＩｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇＦａｃｔｏｒｓｏｆｔｈｅＤｏｍｅｓｔｉｃＰｒｅａｎｔｒａｌＦｏｌｌｉｃｌｅｓ／ｎｖｉｔｒｏＺＨＡＮＧＹａｏ－ｊｕｎ，ＷＡＮＧＺｈａｏ－ｈｕｉ，ＷＥＮＲｕｉ－ｌｉ，ＳＨＩＨｏｎｇ，ＷＵＭｉｎｇ・ｙａｏ＋（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆｔｈｅＭｉｎｉｓｔｒ）ｒｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎｆｏｒＭｅｄｉｃｉｎａｌＲｅｓｏｕｒｃｅｓａｎｄＮａｔｕｒａｌＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＮａｔｉｏｎａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＲｅｓｏｕｒｃｅＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＥｎｄａｎｇｅｒｅｄＣｒｕｄｅＤｒｕｇｓｉｎＮｏｒｔｈｗｅｓｔｏｆＣｈｉｎａ，Ｃｏｌｌｅｇｅｏｆ“ｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＳｈａａｎｘｉＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ’ａｎ７１００６２，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｔｈｅｍａｍｍａｌｉａｎｏｖａｒｙ，ａｂｏｕｔ９９％ｏｆｔｈｅｆｏｌｌｉｃｌｅｓｐｒｅｓｅｎｔｉｎｔｈｅｃｏｒｔｅｘａｒｅｉｎｔｈｅｆｏｒｍｏｆａｎｏｎ—ｃａｖｉｔｙ．Ｉｔｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｎｇｐｒｅａｎｔｒａｌｆｏｌｌｉｃｌｅｓｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｆｏｌｌｉｃｌｅｓｉｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｉｎｒｏｄｅｎｔｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｉｓｒｅ—ｍａｉｎｓａｃｈａｌｌｅｎｇｅｉｎｌｉｖｅｓｔｏｃｋｗｈｉｃｈｈａｓｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｔｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｌｉｖｅｓｔｏｃｋａｎｉｍａｌｓｐｒｅａｎｔｒａｌｆｏｌｌｉ—ｄｅｓｃａｎｂｅｌａｒｇｅｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｔｈｒｅｅｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ：ｅｎｚｙｍａｔｉｃｄｉｇｅｓｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ，ｍｅｃｈａｎｉｃａｌｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｃｏｍｂｉｎｅｄｅｎｚｙｍｅ—ｍｅ－ｃｈａｎｉｃａｌｓｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｏｏｌｓｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓｕｓｅ，ｍｅｃｈａｎｉｃａｌｓｅｐａｒａｔｉｏｎｉｓｇｅｎｅｒａｌｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｔｈｅｆｏｌ・ｌｏｗｉｎｇｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ：ｃｕｔｔｉｎｇｍｅｔｈｏｄ，ｃｏｍｂ—ｓｃｒａｐｅｍｅｔｈｏｄ，ｍｉｃｒｏｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄｇｒｉｎｄｉｎｇ．Ｔｈｉｓａｒｔｉｃｌｅｒｅｖｉｅｗｓｔｈｅｍｅｔｈｏｄ—ｏｌｏｇｉｃａｌｈｉｓｔｏｒｙｏｆｉｓｏｌａｔｉｎｇｐｒｅａｎｔｒａｌｆｏｌｌｉｃｌｅｓ／ｎｖｉｔｒｏ，ｆｏｃｕｓｅｓｏｎｔｈｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｐｒｅａｎｔｒａｌｆｏｌｌｉｃｌｅｓｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎ－ｆｌｕｅｎｃｉｎｇｆａｃｔｏｒｓ，ｓｕｃｈ８．８ａｎｉｍａｌｓｐｅｃｉｅｓ，ａｇｅ，ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｔｉｍｅ，ａｎｄｏｖａｒｉａｎｓｉｚｅａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｔｈｕｓｌａｙｉｎｇａｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇａｍｏｒｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｉｓｏｌａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｄｏｍｅｓｔｉｃａｎｉｍａｌｓ；ｐｒｅａｎｔｒａｌｆｏｌｌｉｃｌｅｓ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎｉｎｖｉｔｒｏ；ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇｆａｃｔｏｒｓ哺乳动物卵巢皮质中含有大量的腔前卵泡，但是绝大部分在发育过程中会不断闭锁退化。

分离方法和卵巢发育状况对猪腔前卵泡分离及体外培养的影响

中图分类号：Ｓ１．８４４文献标识码：Ａ
目前，胚胎工程技术相关研究中获取卵母细胞的主要方法是采集有腔卵泡卵母细胞，而卵巢中然有腔卵泡的数量极其有限。哺乳动物卵巢中具有数量非常丰富的腔前卵泡，因而开发和利用这一重要
将卵巢倒入普通钢筛上，生理盐水冲洗，用用７％的酒精喷淋后再用生理盐水冲洗２次，眼科５用剪除去韧带和结缔组织，卵巢沿卵巢门剪开一分将
为二，除去髓质、再脂肪组织、黄体和系膜，随后转入
摘要：以直径在２０～３０ｔ的腔前卵泡为研究对象，００／＿ｎｉ研究了不同分离方法及卵巢不同发育状况对猪腔前卵泡分离
及体外培养的影响。结果表明，显微分离法每个卵巢可采集的卵泡数极显著高于剪碎过滤法（４７２．５±２９ｓ．０．９ｖ６２ ±０３，．５Ｐ＜００）显微分离法分离每个腔前卵泡所用的时间极显著低于剪碎过滤法（．０±０４ｓ１．２±１１，．１，５４．４ｖ５５．８Ｐ＜．１；００）有黄体和无黄体的卵巢对卵泡分离的影响差异不显著（６１２．０±２０ｓ４３．２ｖ．５±２３，２．２Ｐ＜００）但有黄．５，体的卵巢分离的卵泡数稍多于无黄体的卵巢。此外，对两种分离方法分离出的腔前卵泡进行培养研究表明，两种分离方法对卵泡体外生长和存活，以及正常卵母细胞比率均没有显著影响（００）Ｐ＞．５。关键词：猪；腔前卵泡；分离；卵巢；体外培养

牛体外受精技术研究进展_黄志坚

%卵母细胞的体外成熟%)%卵母细胞的获取自卵巢获取卵母细胞的方法主要有*种。

机械分离法，系自屠宰场废弃的卵巢表面获取卵母细胞的常用方法，主要有抽吸法、切割法和剥离法。

抽吸法操作迅速，但易损伤卵丘细胞，取卵数量较少；切割法在最短时间内获卵数量较多，但易出现裸卵和损伤卵丘细胞；剥离法操作繁琐，但对卵丘细胞损伤较小。

机械分离和酶消化结合法，系自屠宰场废弃的卵巢内获取卵母细胞的常用方法，可克服机械分离时间长的特点，又减轻了酶消化过程中对细胞细微结构的破坏。

腹腔镜和超声扫描活体取卵法，系自活体卵巢内获取卵母细胞的常用方法，取卵数量多，母畜可持续利用，但操作方法复杂，且受条件限制。

哺乳动物卵巢中有腔卵泡细胞所占比例很少，绝大多数是属于腔前卵泡。

随着胚胎体外生产技术的发展，对卵母细胞需求量日益增多，如何建立腔前卵泡的培养体系，最大限度获取大量的具有成熟和受精能力的卵母细胞，将极大地促进体外受精等胚胎工程技术的应用和发展。

腔前卵泡的分离方法有：机械分离法、胶原酶消化直接分离法、酶消化振荡分离法和酶消化,机械分离法，后者以回收腔前卵泡最多，故常用于啮齿动物、猪和牛等动物的卵巢中腔前卵泡的分离。

%)#卵母细胞的体外成熟培养系统卵母细胞体外成熟培养系统的建立是按照母体要求模拟的，如依照输卵管液和子宫液成分而定，这样可为卵母细胞创造一个与母体相似的体外营养环境，以利细胞生长发育。

%)#)%基础培养体系：以合成培养液如-./%00应用最多，牛、猪等卵母细胞应用这种培养液的体外成熟率均达到1$2以上。

它的缓冲体系以34546或碳酸氢盐缓冲系789:(4;6<9(=6>为好，而磷酸盐缓冲系739?@;6>较差。

培养条件是!2.A#、0!2空气和饱和湿度，多采用微滴法7%$$!%，%$B%!个卵母细胞>培养。

在基础培养液中添加其它成分可提高卵母细胞的体外成熟率。

不同研究者目前常添加成分也不同。

在基础培养液中添加犊牛血清、发情牛血清、胎牛血清、发情山羊血清或牛血清白蛋白7C<D>等，血清中可能含某种促进卵母细胞成熟和在体外受精的成分，可阻止透明带硬化和促进受精发生。

猪腔前卵泡的体外培养

行了广泛的研究＿］在猪ＩｍＬ霉素＋１０Ｆ／羊１，Ｕ／青０ｇｍＬ链霉素＋０５ＩｍＬ．Ｕ／
上的研究也取得了较大的进展。ＨＩＲＡＯ等ｔ能把ＦＨ；础培养液ＮＣＵ２：０．３ｍｍｏ／］Ｓ基Ｓ３１８７ｌＬ氯化
种基础培养液及９孔培养板法、６凹窝培养法和颗粒细胞铺层培养法对猪腔前卵泡进行体外培养。结果表明：培养在Ｍ１９的腔前卵泡生长显著快于培养在ＮＣＵ２９Ｓ３的腔前卵泡，培养在该２组的猪腔前卵泡前５ｄ的生长速度都极显著地高于后５ｄ的生长速度，而腔前卵泡的成腔率和存活率没有明显差异；培养在凹窝培养体系的腔
．ｌＬ亚牛磺酸＋１发情牛血清０／９６核成熟，实现了体外受精，而且受精卵能发育到囊胚牛磺酸＋５０ｍｍｏ／期，许多学者重复该试验没有成功。笔者拟通过（Ｃ自制）＋１但ＯＳ，０ｍｍｏ／ｐｓ＋５ｇｍＬｌＬＨｅｅ０Ｆ／探讨不同的基础培养液和不同培养方法对猪腔前卵Ｖｃ１０ＩｍＩ青霉素＋１０／／＋０Ｕ／０￣ｍＬ链霉素＋０５ｇ．
Ａ）其ｉｍａ在卵泡发生过程中，卵巢上尽管有大量的原始ＵＳ；它未说明者均为Ｓｇ公司产品。卵泡存在，真正能发育到排卵前的卵泡很少，成但造
２液体配制。基础培养液Ｍ１９Ｍ１９．３）９：９＋０２
泡体外培养的影响，旨在建立一套适合猪腔前卵泡ＩｍＬＦＨ。Ｕ／Ｓ

哺乳动物卵母细胞体外成熟技术应用与研究

贵
达拉特旗０４０）１３０
摘要：综述了近年来国内外在哺乳动物卵母细胞采集方法、卵母细胞体外成熟培养技术的研究
进展。对影响卵母细胞成熟的因素以及哺乳动物卵母细胞体外成熟在家畜育种中的应用进行了总结和分析。
卵泡腔，卯丘—— 卵母细胞的复合体（Ｏｓ冲出，将ＣＣ）于实体显微镜下检卵］。将切剖后的卵巢，除黄体及多余的脂肪，门部去从纵切卵为半，然后置于盛ＰＳ１ｇｍＢ＋０Ｉ／Ｌ肝素的表面或ｘ者置于１０ｍｌ的培养皿中，用镊子固定卵巢，０ｍｘ５ｍｍ然后用单面刀或一组特制刀片（３５个单面刀片或双有～
用含有０３／Ｌ硫酸庆大霉素的生理盐水洗净，．ｍｇｍ２然
后进行采卵［。６３
科研工作者在卵母细胞的体外成熟上做了大量的
工作．以通过体外培养使小鼠、可绵羊、、、、、猴猪牛人山
用废弃卵巢采集卵母细胞一般采用机械分离法，郭宪等研究认为主要有以下几种方法：吸法、抽切剖法、剥离法。１１１１抽吸法：用５ｍＬ或１．．．０ｍＬ的一次性注射器从
羊 …、犬、［、熊猫等哺乳动物的卵母细胞在体外马３大］获得成熟。随着卯母细胞体外成熟技术的不断提高，体外成熟的卵母细胞将广泛应用于体外受精、显微受精、

哺乳动物小卵泡卵母细胞体外成熟的研究进展

中国畜牧兽医 2024,51(3):1171-1182C h i n aA n i m a lH u s b a n dr y &V e t e r i n a r y Me d i c i n e 哺乳动物小卵泡卵母细胞体外成熟的研究进展李有为1,程亚倬2,商继勇2,张廷龙1,孙铭菊2(1.青岛农业大学海都学院,莱阳265200;2.青岛农业大学动物医学院,青岛266109)摘要:体外成熟是哺乳动物胚胎工程获得成熟卵母细胞的主要途径,卵母细胞质量直接影响早期胚胎发育,妊娠的建立及维持,胎儿的发育等㊂哺乳动物卵巢表面数量众多的小卵泡可以作为胚胎工程卵母细胞的来源,但从哺乳动物卵巢获取的卵母细胞成熟差异较大,存在处于发育各个时期的卵母细胞,小卵泡卵母细胞体外成熟质量差,发育能力不足㊂如何提高小卵泡卵母细胞体外成熟的发育能力以充分挖掘优良母畜的遗传资源,提高胚胎工程效率成为研究热点㊂基于此,文章概述哺乳动物小卵泡卵母细胞体外成熟的研究进展,比较大㊁小卵泡卵母细胞物质积累差异㊁卵泡的卵泡液成分及含量差异以及卵泡颗粒细胞和卵丘细胞的差异,分析哺乳动物小卵泡卵母细胞体外成熟质量差的原因,分析总结提高哺乳动物小卵泡体外成熟卵母细胞发育能力的措施,包括抑制核成熟㊁成熟前培养㊁颗粒细胞及卵丘细胞与卵母细胞共培养,期望能够为小卵泡卵母细胞发育调控机制的研究及发育能力的提高提供理论指导㊂关键词:哺乳动物;小卵泡;卵母细胞;体外成熟中图分类号:S 814.6文献标识码:AD o i :10.16431/j .c n k i .1671-7236.2024.03.029 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2023-08-12基金项目:山东省自然科学基金项目(Z R 2020Q C 193);重庆市妇幼保健院开放课题(2020K F K T 005);青岛农业大学高层次人才科研基金(663/1120012)联系方式:李有为,E -m a i l :l i yo u w e i 008@163.c o m ㊂通信作者孙铭菊,E -m a i l :s u n 8911@163.c o m R e s e a r c hP r o gr e s s o n i n v i t r o M a t u r a t i o no f S m a l l F o l l i c l e -d e r i v e dO o c yt e s i n M a m m a l i a n L IY o u w e i 1,C H E N G Y a z h u o2,S H A N GJ i y o n g 2,Z H A N G T i n g l o n g 1,S U N M i n g ju 2(1.H a i d uC o l l e g e ,Q i n g d a oA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,L a i y a n g 265200,C h i n a ;2.C o l l e g e o fV e t e r i n a r y M e d i c i n e ,Q i n g d a oA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,Q i n g d a o 266109,C h i n a )A b s t r a c t :I nv i t r o m a t u r a t i o ni st h e m a i n w a y f o r m a m m a l i a ne m b r y oe n g i n e e r i n g too b t a i n m a t u r e o o c y t e s .T h e q u a l i t y o f o o c y t e s d i r e c t l y a f f e c t s e a r l y e m b r y o n i c d e v e l o pm e n t ,e s t a b l i s h m e n t a n dm a i n t e n a n c eo f p r e g n a n c y ,a n df e t a ld e v e l o p m e n t .T h e l a r gen u m b e ro f s m a l l f o l l i c l e so n t h e s u r f a c e o f m a m m a l i a n o v a r i e s c a n p r o v i d e o o c y t e s t h a t a p p l y t o e m b r y o e n g i n e e r i n g ,b u t t h eo o c y t e so b t a i nf r o mt h eo v a r y a r ea td i f f e r e n ts t a g e st h a ts h o w sd i f f e r e n t m a t u r e c a p a c i t y ,a n d t h e q u a l i t y o f i n v i t r o m a t u r a t i o n o f o o c yt e s f r o ms m a l l f o l l i c l e s a r e p o o r a n d d e f i c i e n t i nd e v e l o p m e n t a l a b i l i t y .H o wt o i m p r o v e t h e i n v i t r o m a t u r a t i o n a b i l i t y o f s m a l l f o l l i c l e o o c y t e s t of u l l y t a p i n t ot h e g e n e t i cr e s o u r c e so fe x c e l l e n tf e m a l ea n i m a l sa n di m pr o v et h e e f f i c i e n c y o fe m b r y o e n g i n e e r i n g h a s b e c o m e ar e s e a r c h h o t s p o t .B a s e d o n t h i s ,t h er e v i e w s u m m a r i z e s t h e r e s e a r c h p r o g r e s so f i n v i t r o m a t u r a t i o no f s m a l l f o l l i c l eo o c yt e s i n m a m m a l i a n ,c o m p a r e s t h e d i f f e r e n c e s i n a c c u m u l a t i o n o f o o c y t em a t e r i a l ,t h e d i f f e r e n c e s i n t h e c o m po s i t i o n a n d c o n t e n t o f f o l l i c u l a r f l u i d ,a n d t h e d i f f e r e n c e s b e t w e e n f o l l i c u l a r g r a n u l o s a c e l l s a n d c u m u l u s c e l l si n l a r g e a n d s m a l l f o l l i c l e s ,a n a l y z e s t h e r e a s o n s f o r t h e p o o r q u a l i t y ofm a m m a l i a ns m a l l f o l l i c l e中国畜牧兽医51卷o o c y t e s i n v i t r o m a t u r a t i o n,a n a l y z e s a n d s u m m a r i z e s t h em e a s u r e s t o i m p r o v e t h ed e v e l o p m e n t a l a b i l i t y o f m a m m a l i a ns m a l l f o l l i c l eo o c y t e s i nv i t r o m a t u r a t i o n,i n c l u d i n g i n h i b i t i o no fn u c l e a r m a t u r a t i o n,p r e-m a t u r a t i o n c u l t u r e o f o o c y t e a n d c o-c u l t u r e o f o o c y t e s w i t h g r a n u l o s a a n d c u m u l u s c e l l s,w h i c ha i m e s a t p r o v i d i n g t h e o r e t i c a l g u i d a n c e f o r t h e r e s e a r c ho f t h ed e v e l o p m e n t r e g u l a t i o nm e c h a n i s mo f s m a l l f o l l i c l e o o c y t e s a n d t h e i m p r o v e m e n t o f d e v e l o p m e n t a l c a p a c i t y. K e y w o r d s:m a m m a l s;s m a l l f o l l i c l e s;o o c y t e s;i n v i t r o m a t u r a t i o n家畜卵母细胞随着卵泡长大而生长成熟,获得发育能力,卵母细胞良好的生长成熟是决定雌性生产及繁殖能力的重要指征㊂卵母细胞体外成熟培养(I VM)是利用体外培养体系模拟体内卵母细胞成熟环境,将未成熟的卵母细胞培养至第二次减数分裂中期(MⅡ)的过程㊂卵母细胞体外成熟是研究哺乳动物卵母细胞成熟和胚胎发育的基础,是辅助生殖的关键,是保护和扩繁优良家畜的重要前提㊂进行体外成熟培养的卵母细胞取自卵巢表面卵泡,但卵巢表面大腔卵泡数量非常有限,不能满足科研和临床需求,数量众多的小卵泡作为卵母细胞来源受到更多学者关注㊂但小卵泡卵母细胞的体外成熟质量差,发育能力显著低于大卵泡卵母细胞[1-3]㊂研究者们试图探究小卵泡卵母细胞体外成熟质量差的原因及提高小卵泡卵母细胞体外成熟质量的措施,但这些问题仍未被完全阐明,也未见系统的论述㊂因此,作者系统论述哺乳动物小卵泡卵母细胞的利用现状及研究意义,从卵母细胞生长的卵泡微环境方面分析小卵泡卵母细胞体外成熟质量及发育能力差的原因,概述提高小卵泡卵母细胞体外成熟质量的措施,为改善哺乳动物小卵泡卵母细胞体外成熟培养系统提供新思路,继而提升优良家畜繁殖利用效率,促进胚胎工程技术的发展和应用㊂1哺乳动物小卵泡卵母细胞的利用现状及研究意义哺乳动物小卵泡卵母细胞体外成熟质量及发育能力显著低于大卵泡卵母细胞㊂研究表明,直径2.5~4.0m m的猪卵泡卵母细胞体外成熟质量及发育能力低于4.5~6.0m m卵泡卵母细胞[1];山羊卵巢上直径<3m m卵泡卵母细胞体外成熟质量及发育能力低于直径>3m m卵泡卵母细胞[2],且只有来自直径1.5m m以上山羊卵泡的卵母细胞才具有完成减数分裂的能力[4];在牛的研究中发现卵巢上直径<3m m卵泡卵母细胞体外成熟质量及发育能力低于直径>8m m卵泡卵母细胞[3,5]㊂人小卵泡(直径<10m m)卵母细胞体外成熟和发育能力显著低于大卵泡卵母细胞[6]㊂因此,哺乳动物胚胎工程利用的卵母细胞大都取自大卵泡进行体外成熟培养,如在猪上选取卵巢表面卵泡直径3~6m m的卵母细胞[7]㊂哺乳动物卵泡的生长经历原始卵泡㊁初级卵泡㊁次级卵泡㊁三级卵泡和成熟卵泡阶段,随着卵泡生长,卵母细胞生长成熟㊂胎儿期哺乳动物卵巢中存在数百万卵泡,但仅有少数卵泡能够发育成熟并排出成熟卵母细胞,其余大部分小卵泡在不同生长时期发生闭锁或退化㊂胚胎工程技术的研究和推广应用需要大量廉价和高质量的卵母细胞,卵巢表面大卵泡数量有限,因此需要高效利用数量众多的小卵泡㊂探究小卵泡卵母细胞体外成熟质量差的原因,提高小卵泡卵母细胞体外成熟的发育能力和利用率,能够充分挖掘优良母畜的繁殖潜能,为动物繁育技术的发展提供理论指导,促进畜牧业健康㊁稳定㊁持续发展;改良卵母细胞体外成熟培养体系,为相关科学研究提供大量廉价的试验材料,促进胚胎工程技术的发展;同时在指导人类辅助生殖小卵泡的利用,减少激素刺激的副作用,提高辅助生殖成功率方面有重要意义㊂2小卵泡卵母细胞体外成熟质量差的原因哺乳动物卵母细胞生长成熟依赖卵泡形成的微环境,卵泡外包卵泡膜,生长至有腔卵泡阶段,卵泡内形成卵泡腔,卵泡腔内含卵泡液,卵母细胞外包卵丘细胞位于卵泡腔中,卵丘细胞连接卵泡腔周围的颗粒细胞,卵泡内的卵泡液㊁卵丘细胞和颗粒细胞维持卵母细胞的生长成熟㊂因此,下文从卵母细胞自身生长程度㊁卵泡液成分和含量㊁卵丘及颗粒细胞功能三方面比较大小卵泡的差异,探究小卵泡卵母细胞体外成熟质量差的原因㊂2.1大、小卵泡的卵母细胞物质积累差异卵母细胞随着卵泡长大而生长,染色质逐渐凝集,转录活性逐渐减低,完成胞质物质的积累以获得成熟和发育能力,小鼠染色质凝集型卵母细胞无转录活性[8],直径>3m m猪卵泡中的卵母细胞转录27113期李有为等:哺乳动物小卵泡卵母细胞体外成熟的研究进展逐渐沉默[9-10]㊂转录逐渐沉默过程中,卵母细胞完成转录物的积累,支持后期的成熟和胚胎发育,这是大㊁小卵泡卵母细胞体外发育能力差异的重要因素㊂高通量测序技术为卵母细胞生长成熟机制的研究提供技术支持,利用转录组测序分析不同大小卵泡的牛卵母细胞,发现在卵泡发生过程中重要差异表达基因,如调节转录的转录因子2(T A F2)㊁染色质重塑相关的蛋白磷酸酶1的催化亚基-β同工酶(P P P1C B)㊁能量代谢相关的溶质载体家族25-腺嘌呤核苷酸转运子成员31(S L C25A31),细胞内分子运输相关的N-乙酰葡糖胺-1-磷酸二酯酶(N A G P A)㊁半胱氨酸/组氨酸富含1(C Y H R1)和溶质载体家族39-锌转运子成员12(S L C3A12)[3]㊂来自人类原始卵泡和初级卵泡的卵母细胞在参与调节卵母细胞休眠和激活途径的基因表达上存在差异[11]㊂在小鼠中,染色质凝集的卵母细胞与弥散性染色质构型卵母细胞相比有380个差异表达基因,且大多数基因下调[12]㊂猪卵母细胞转录组数据分析差异表达基因显示,与小卵泡组相比,大卵泡卵母细胞中有60个基因上调,262个基因下调[13]㊂因此,大小卵泡卵母细胞基因表达的差异与卵母细胞成熟和发育能力的获得密切相关,但具体关系及起决定性作用的因子仍需要进一步探究㊂卵母细胞内成熟及发育相关因子的研究尚不充分,仅局限于特定因子的比较和分析㊂卵母细胞成熟促进因子(M P F)介导多种信号调控卵母细胞成熟㊂在猪小卵泡中M P F活性以及参与卵母细胞成熟的细胞周期依赖性激酶1(C D K1)㊁增殖细胞核抗原(P C N A)㊁细胞外信号调节激酶2(E R K2)的表达量显著低于大卵泡卵母细胞[14]㊂卵母细胞中原癌基因丝氨酸/苏氨酸激酶(c-MO S)参与维持减数分裂阻滞并具有调节M P F活性的作用[15-16],猪小卵泡生发泡(G V)期卵母细胞中c-M O S基因转录水平低[17]㊂猪小卵泡卵母细胞中调控卵丘扩展的基因(如骨形态发生蛋白(B M P15)㊁生长分化因子9 (G D F9)㊁透明质酸合成酶2(H A S2)㊁肿瘤坏死因子α诱导蛋白6(T N F I P6)等)表达量低,使卵丘扩展能力不足,同时引起表皮生长因子受体(E G F R)信号通路下调,卵母细胞发育能力低[18]㊂环磷酸腺苷(c AM P)是哺乳动物中保守且普遍存在的第二信使,在卵泡发育及卵母细胞成熟过程中发挥重要作用,卵母细胞减数分裂的阻滞和恢复依赖于c AM P㊂小卵泡卵母细胞c AM P含量低于大卵泡卵母细胞[19],小卵泡卵母细胞对c AM P的感应不如大卵泡,在体外成熟培养过程中添加c AM P 的类似物d i b u t y r y l c AM P(d b-c AM P),培养11h 时大卵泡c AM P含量是小卵泡卵母细胞的3倍[20]㊂卵母细胞旁分泌因子G D F9和B M P15具有调控卵泡生长[21],促进卵丘细胞和颗粒细胞的生长㊁分化,阻止卵丘细胞凋亡,促进卵母细胞成熟㊁排卵㊁受精和胚胎发育的作用[22-23]㊂G D F9和B M P15的表达模式在不同物种之间存在差异,绵羊㊁牛㊁负鼠和仓鼠在原始卵泡卵母细胞中开始表达,而大鼠㊁小鼠和人类在初级卵泡开始表达,发育至次级卵泡开始激增[24-25]㊂猪小卵泡卵母细胞中G D F9水平低于大卵泡卵母细胞,在经过体外成熟培养后大卵泡卵母细胞G D F9表达量仍显著高于小卵泡卵母细胞[26]㊂G D F9基因敲除后,卵泡生长阻滞在初级卵泡阶段,小鼠雌性不育[27],B MP15基因敲除(B MP15-/-)的小鼠生殖能力降低,排卵减少, G D F9+/-和B MP15-/-的小鼠卵泡发生㊁卵丘细胞和受精能力均出现异常[28-29]㊂另外,细胞内谷胱甘肽(G S H)是预测猪卵母细胞细胞质成熟的分子标志物,猪大卵泡卵母细胞内G S H含量显著高于小卵泡卵母细胞[30]㊂卵母细胞内脂滴等代谢物含量㊁表观遗传修饰的差异等都是导致大㊁小卵泡卵母细胞体外成熟发育能力差异的可能原因,需要更为系统的研究和阐述㊂以上研究揭示了大㊁小卵泡卵母细胞转录物㊁活性因子及调控成熟信号等的差异,表明卵母细胞内物质积累对卵泡卵母细胞生长㊁卵母细胞成熟及发育能力的获得㊁生殖的重要性,小卵泡卵母细胞物质积累不足是导致发育能力低的重要原因㊂2.2大、小卵泡的卵泡液成分及含量差异卵泡液是血清的超滤液,是穿过血滤泡屏障的血浆成分转移以及颗粒和卵母细胞分泌活动的产物,卵泡液成分包括激素㊁生长因子㊁活性氧㊁蛋白质㊁肽和氨基酸等㊂卵泡液中含有多种激素,在卵泡及卵母细胞的生长发育过程中起着关键调控作用,大㊁小卵泡内激素含量不同,卵泡对激素水平的感应不同是导致卵母细胞发育能力不同的重要因素之一㊂研究比较不同物种发现小卵泡内促卵泡激素(F S H)含量高[8,19,31],同时小卵泡颗粒细胞高表达促卵泡激素受体(F S H R),促进小卵泡进一步生长[32]㊂F S H能够激活磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/叉头转录因子O亚族1(P I3K/A k t/F O X O1)信号通路,引起固醇元件结合转录因子2(S R E B P2)上调,促进3-羟3711中国畜牧兽医51卷基-3甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMG C R)表达调控卵泡内颗粒细胞合成胆固醇[33-35],F S H还具有增强表皮生长因子(E G F)诱导E G F R酪氨酸磷酸化的作用[36],F S H-E G F R能激活S MA D2/3信号通路,调控卵丘扩展和类固醇生成[37]㊂因此,F S H 在小卵泡中含量高,可促进小卵泡的进一步生长,在大卵泡内F S H主要是促进卵母细胞核成熟㊂抗缪勒氏激素(AMH)的表达仅局限于腔前和小腔卵泡颗粒细胞,通常在小腔前卵泡中出现表达高峰,伴随着腔前卵泡直径的增加,颗粒细胞和卵泡液中AMH水平降低,优势卵泡不再产生AMH[38-39]㊂AMH在调控卵母细胞发育中的作用是增加腔前卵泡中雄烯二酮的含量,抑制颗粒细胞增殖[40-41],另外通过抑制F S H诱导的芳香酶活性共同抑制雌二醇(E2)合成[42],表明AMH对优势卵泡的选择是必需的㊂大卵泡孕酮(P4)和E2含量均高于小卵泡,促黄体生成素受体(L H R)和雌激素,及类固醇合成酶,主要是细胞色素P450酶(芳香化酶和17α羟化酶)表达量高,其作用是为激素应答做准备[30,43]㊂E2可与卵母细胞分泌因子共同作用,通过调控钠肽通路促进卵丘细胞环磷酸鸟苷(c GM P)产生[44-45],高水平c GM P维持减数分裂的阻滞,促进卵母细胞胞质充分成熟㊂卵泡液中重要成分还包括卵母细胞及颗粒细胞分泌的重要生物活性因子,B i j t t e b i e r等[46]利用蛋白组学鉴定猪卵泡液和血清中与卵丘细胞扩展相关的蛋白因子,但因技术的限制仅鉴定了13种差异表达蛋白,精确度也较低㊂因此,仍需利用转录组及蛋白组学等技术系统研究猪卵泡液关键因子及相互作用,揭示卵泡因子之间的互作以及揭示卵母细胞成熟分子调控机制㊂2.3大、小卵泡颗粒细胞和卵丘细胞的差异卵泡生长过程的重要变化包括颗粒细胞数量的增加以及颗粒细胞和卵丘细胞的分化,猪小腔卵母细胞周围的卵丘细胞数量显著低于中等卵泡卵母细胞[47],小卵泡内颗粒细胞和卵丘细胞数量不足,发挥功能受限,必定会影响卵母细胞发育能力㊂卵丘细胞分泌因子包括过氧化氢酶㊁超氧化物歧化酶㊁血管内皮生长因子㊁G S H㊁特异性转录因子和环核苷酸(c AM P㊁c GM P)等,分泌因子在维持氧化稳态,抑制凋亡,调控细胞增殖和凋亡,以及卵母细胞减数分裂恢复中发挥关键作用,能够促进卵母细胞成熟发育[48]㊂常见的颗粒细胞分泌因子包括利钠肽(N P s)㊁类表皮生长因子(E G F-l i k ef a c t o r s)㊁前列腺素(P G E)等[49]㊂其中利钠肽家族成员C-型利钠肽(C N P)由卵泡壁粒细胞分泌,结合卵丘细胞表面的利钠肽受体2(N P R2)[50],诱导c GM P的表达,具有维持卵母细胞减数分裂阻滞的作用[51],利钠肽受体系统对卵巢生长和卵母细胞减数分裂的有序发生起重要作用,决定雌性生殖能力[52-53]㊂直径1~2m m 猪卵泡卵丘细胞内N p r2m R N A水平显著低于直径3~6m m卵泡卵丘细胞[19]㊂促黄体生成素(L H)和F S H作用的重要通路是通过转活化E G F信号通路在调控卵丘细胞增殖分化中发挥作用㊂已经在啮齿类动物[54-56]㊁人[57]㊁灵长类[58]㊁牛[59]和猪[60]颗粒细胞中证实类表皮生长因子的表达,如双调蛋白(A R E G)㊁上皮调节蛋白(E R E G)和β-细胞素(B T C)㊂这些类E G F生长因子以自分泌或旁分泌形式通过E G F R作用于壁颗粒细胞和卵丘颗粒细胞[55-56,60-61],在卵母细胞减数分裂恢复中发挥关键作用㊂E G F及类表皮生长因子能够提高体外成熟卵母细胞成熟率㊁受精和早期胚胎发育能力[8,62]㊂直径<3m m的山羊卵泡卵丘卵母细胞复合体(C O C s)中E G Fm R N A水平低于直径>3m m的卵泡[63],而缺少E G F类生长因子C O C s不会发生扩展[64-65],猪小腔卵泡卵母细胞对E G F类生长因子的反应能力及结合能力低[18,65]㊂P G E2水平的升高是调控卵丘扩展和卵母细胞成熟及排卵的关键㊂抑制P G E2的合成,卵丘细胞扩展㊁卵母细胞成熟和排卵率降低,缺少P G E2或P G E2受体表达的小鼠不能排卵[66-68]㊂利用前列腺素合成抑制剂也能阻断兔㊁奶牛和灵长类动物的排卵,将前列腺素合成抑制剂直接注射到猕猴的优势卵泡中,卵泡则不能应答L H的刺激进而不能排卵,注射抑制剂的同时注射P G E2会恢复排卵[69]㊂综上,大㊁小卵泡卵母细胞㊁卵泡液㊁颗粒与卵丘细胞存在显著差异(图1):①小卵泡内卵母细胞转录活性强;基因表达与大卵泡卵母细胞有差异;c AM P含量低;c-MO S㊁M P F活性低;旁分泌因子G D F9/B M P15少;G S H含量少;②小卵泡卵泡腔内卵泡液含量及成分与大卵泡卵泡液差异显著;F S H㊁AMH含量高;P4㊁E2含量低;③小卵泡内颗粒细胞和卵丘细胞数量少;N P㊁PG E2㊁E G F家族生长因子少;N P R2表达少㊂此外,大㊁小卵泡颗粒细胞㊁卵丘细胞㊁卵泡液以及卵母细胞之间的信息交流,促进支持卵泡和卵母细胞的生长成熟,它们之间47113期李有为等:哺乳动物小卵泡卵母细胞体外成熟的研究进展的相互联系及结合程度不同都可能造成卵母细胞发育能力差异㊂卵泡和卵母细胞生长成熟极其复杂,人们对其认识极其有限,卵泡内生命活动及其调控机制仍需要进一步阐明㊂与大卵泡相比,ʏ表示小卵泡内物质含量多;ˌ表示小卵泡内相应物质含量少C o m p a r e dw i t hl a r g ef o l l i c l e s ,ʏi n d i c a t e da h i gh e rc o n t e n to fs u b s t a n c e si ns m a l lf o l l i c l e s ;ˌi n d i c a t e dl o w c o n t e n to f c o r r e s p o n d i n g s u b s t a n c e s i n s m a l l f o l l i c l e s 图1 哺乳动物大、小卵泡内物质差异F i g .1 D i f f e r e n c e s i n s u b s t a n c e s b e t w e e n l a r ge a n d s m a l lf o l l i c l e s i nm a m m a l s 3 提高小卵泡卵母细胞体外成熟发育能力的措施在体内卵泡环境,卵母细胞长时间停滞在第一次减数分裂前期,一旦置于体外成熟培养环境,卵母细胞很快自发恢复减数分裂,完成核成熟㊂哺乳动物卵泡长至大腔卵泡时期卵母细胞才生长完全,胞质完全成熟,体外成熟培养导致小卵泡卵母细胞在胞质未成熟之前提前恢复减数分裂,使得卵母细胞发育能力低㊂基于上述小腔卵泡卵母细胞发育能力不足的原因分析,体外成熟培养过程中,提高小腔卵泡卵母细胞发育能力的举措主要是在支持生长的培养基中进行前培养或者抑制卵母细胞的核成熟,保证卵母细胞足够的胞质成熟时间,以及卵母细胞与卵丘细胞或颗粒细胞共培养,弥补小腔卵泡卵母细胞生长的不足,以提高小卵泡卵母细胞质量㊂3.1 抑制核成熟提高小卵泡卵母细胞体外成熟发育能力很多研究在卵母细胞体外成熟培养的早期阶段利用抑制剂抑制生发泡破裂(G V B D )的发生,以提高猪卵母细胞胞质的成熟,但对卵母细胞发育能力的提高非常有限㊂抑制核成熟研究最多的是卵母细胞内c AM P -蛋白激酶A (P K A )-M P F 通路的调控,在猪和小鼠卵母细胞成熟过程中使用d b -c AM P ㊁利用抑制剂3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(I B M X )㊁西洛酰胺抑制磷酸二酯酶(P D E )进而抑制c AM P 的降解,添加毛喉素(F S K )激活腺苷酸活化酶,这些都能够维持卵母细胞内高水平的c AM P ,抑制细胞核过早发生成熟,提高猪小卵泡(1~2m m )卵母细胞发育能力[70-71]㊂添加C D K 抑制剂r o s c o v i t i n e 抑制M P F 的活化,能显著提高猪[72]㊁山羊[73]㊁水牛[74]小卵泡卵母细胞体外成熟的发育能力㊂相似的,添加b u t yr o l a c t o n eⅠ抑制C D K 1也能够提高牛卵母细胞成熟[75]㊂颗粒细胞产生的C N P 被用作天然的卵母细胞核成熟抑制剂㊂在小鼠㊁山羊㊁猪和牛的研究中证实5711中国畜牧兽医51卷C N P能够抑制卵母细胞减数分裂的恢复,体外成熟培养过程添加C N P可提高小卵泡卵母细胞体外成熟的发育能力[76-78]㊂添加C N P能够维持卵丘细胞间的通讯;诱导卵母细胞染色质结构的改变;增加卵母细胞直径㊁线粒体D N A拷贝数㊁线粒体活性和活性氧水平;降低G S H水平;增加卵丘细胞功能[44,79]㊂另外,在体外延迟减数分裂自发恢复的安全有效方法是培养体系中加入卵泡液或添加卵泡液因子,利用卵泡液成分抑制核成熟,同时支持卵母细胞胞质成熟和核成熟,猪的体外成熟培养体系大都添加卵泡液㊂添加卵泡液因子也是提高卵母细胞体外成熟质量的重要方法,体外培养直径2~4m m猪卵泡卵母细胞添加c AM P㊁B M P15和G D F9的同时添加A R E G可提高卵母细胞体外成熟发育能力[18], B M P15㊁G D F9及E G F㊁胶质细胞衍生神经营养因子(G D N F)的组合均能提高卵母细胞发育能力[64,80-81]㊂除此,在培养恒河猴小卵泡(直径0.5㊁0.5~2.0m m)卵母细胞过程中发现添加人绒毛膜促性腺激素(h C G)[82]㊁A R E G[83]能够提高核成熟㊂3.2成熟前培养提高小卵泡卵母细胞发育能力成熟前培养是利用支持生长的培养基促进卵母细胞进一步生长,包括卵泡的培养和卵母细胞的前培养㊂卵泡培养能够实现早期初级卵泡甚至原始卵泡的生长,进一步完成体外卵母细胞的成熟培养,但成熟率不能达到要求㊁培养体系复杂㊁时间长㊁成本较高,并不适合于服务胚胎工程生产,在这里不做赘述㊂卵母细胞的成熟前培养常用的方法是低浓度的激素,如猪小卵泡卵母细胞在体外成熟的1/250浓度的F S H和L H的生长培养基中培养24h,随后在成熟培养基中培养20h可提高猪卵母细胞发育能力[84]㊂与抑制核成熟相似的是成熟前培养也是给予胞质充分的时间以促进其成熟,所以在前培养过程中一般在调控激素水平的基础上结合使用抑制核成熟因子㊂如在培养的前10h添加F S H㊁E2和I B M X,后10h添加P4㊁F S H㊁E2和I B M X,在随后的22h 培养过程中更换为L H㊁E G F和P4可提高猪小卵泡(3~5m m)卵母细胞发育能力[60]㊂前培养过程添加垂体腺苷酸环化酶激活多肽(P A C A P)刺激细胞产生c AM P,能够提高1~3m m猪卵泡卵母细胞发育能力[85]㊂绵羊小卵泡(2~4m m)卵母细胞添加C N P的培养基进行6h前培养,在添加A R E G和P G E2的培养基培养18h,能够提高卵裂率和囊胚率[49]㊂在临床上,将多囊卵巢综合征患者小卵泡(直径<6m m)添加C N P进行前培养,然后再利用体外成熟培养系统能够显著提高小卵泡卵母细胞成熟率和发育能力[77,86-87],同时避免了激素对患者的副作用㊂在此培养系统基础上添加A R E G则能够进一步提高多囊卵巢综合征患者小卵泡卵母细胞发育能力[88]㊂3.3颗粒细胞及卵丘细胞与卵母细胞共培养提高小卵泡卵母细胞发育能力为弥补小卵泡内颗粒及卵丘细胞数量及所分泌因子不足导致的卵母细胞发育能力降低㊂研究者通过共培养及添加相应分泌因子的方式或者改善培养方式来提高卵母细胞体外成熟的发育能力㊂用3~6m m卵泡卵母细胞颗粒细胞团与1~ 2m m卵泡卵母细胞共培养,能够提高猪小卵泡卵母细胞直径,同时促进卵母细胞的成熟[47]㊂在绵羊中研究发现,如果将来自小卵泡(0.5~1.0m m)的卵母细胞与直径3.0~4.0m m卵泡卵母细胞卵丘细胞共培养,则近48%的小卵泡卵母细胞能够恢复减数分裂并能够发育到MⅡ阶段[89]㊂山羊小卵泡(直径<3m m)卵母细胞与裸卵共培养也能够提高卵裂率和囊胚率[90]㊂这些研究表明,卵泡颗粒细胞㊁卵丘细胞以及卵母细胞自身对卵母细胞成熟和发育能力的获得都是有利的,同时,在共培养的基础上再添加其他因子也能提高卵母细胞体外成熟和发育能力㊂除上述措施外,提高小卵泡卵母细胞体外成熟的发育能力的措施还有很多,包括添加抗氧化㊁抗凋亡㊁增强线粒体功能㊁增强表观遗传修饰㊁促进卵丘扩展㊁自噬等作用的物质㊂褪黑素[91]㊁辅酶Q10[92]㊁血管内皮生长因子[93]能够提高卵母细胞体外成熟的发育能力,特别是质量差的小卵泡卵母细胞㊂亚麻酸能够提高山羊小卵泡(<2m m)卵母细胞减数分裂能力和发育至囊胚的能力[94]㊂培养猪小卵泡(1~3m m)卵母细胞时添加烟酸或烟酰胺,可改善卵母细胞体外成熟和发育能力[95]㊂促进胞质成熟,弥补小卵泡的不足能够部分提高小卵泡卵母细胞发育能力,但并不能达到大卵泡卵母细胞发育成熟的程度,还有很大的提升空间㊂4总结与展望卵母细胞生长成熟是一个异常复杂的生物过程,需要卵母细胞与邻近的颗粒细胞㊁卵丘细胞及卵6711。

哺乳动物卵母细胞体外培养研究进展(发育生物学论文)

哺乳动物卵母细胞体外成熟研究进展生科1202班张文娅201224140212摘要：卵母细胞体外成熟培养已经成为现代胚胎生物技术的重要内容之一，是性别控制、体外受精、核移植和转基因等技术成功前提和关键[1]。

关键字：哺乳动物；卵母细胞哺乳动物卵巢内含有大量的原始卵泡，其数量因物种和发育阶段而不同，如出生小鼠大约为一万个，人和家畜约为几百万个。

到初情期后，小鼠约四千个，牛羊约十万个，猪约四十多万个，但大部分卵泡中途闭锁退化，在一个生殖周期中发生排卵的卵泡只有一个或几个[2]。

所以说，哺乳动物卵巢的开发潜力很大。

1 卵母细胞的获取卵母细胞体外成熟（in vitro maturation,IVM）是指从卵巢中获取未成熟卵，经过适宜的体外培养条件，卵母细胞发育成熟并具有受精和胚胎发育能力。

哺乳动物卵母细胞体外成熟质量对卵母细胞的激活、受精及其后继的胚胎发育均有重要影响[3]。

获取大量的优质卵母细胞是实现卵母细胞体外成熟培养的先决条件，也是胚胎生物技术研究的基础。

1.1 活体采集活体卵母细胞的采集主要有盲采法、内窥镜法和超声波法。

20世纪80年代初，Sirard首次将内窥镜用于牛卵泡卵母细胞的采集，同年Copata也以同样的方法获得成功；荷兰Pieterse等首次利用超声波技术通过子宫壁从活牛卵巢采集到卵母细胞。

盲采法由熟悉操作的人一只手通过操控采卵器进行阴道弯隆穿刺，另一只手直肠内配合引导采卵器并把握卵巢吸取含有卵子的卵泡液进行取卵[4]。

盲采法回收率达65%以上。

内窥镜法是在腹腔镜探头的观察下，通过操作杆和采卵针收集卵母细胞的方法。

内窥镜法对卵母细胞的回收率达40%-80%，超声波法回收率达60%。

盲采法是使用最多的一种方法。

活体采集对操作人员的技术要求比较高。

1.2 离体采集离体采集卵母细胞最大的优势在于取材方便，相比活体采卵技术，显著降低了卵母细胞的获取成本和对操作人员的技术要求，能够满足实验对大批量卵母细胞的需求。

动物胚胎体外生产技术-PPT

六、胚胎冷冻保存
（一）常规的慢速冷冻法
冷冻液 1.5M甘油+0.25M蔗糖+PBSS液 +0.1mg/mlPVP和1.5M乙二醇+0.25蔗糖+P BSS液+0.1mg/mlPVP
冷冻步骤为：①在室温下，先将牛胚胎放入防冻液中平衡一段时间；②装管；③以每分钟0.3~0.5℃的速度降温至–35℃；④植冰； ⑤平衡10分钟后，投入液氮中保存。
（三）卵母细胞的体外成熟培养
1. 成熟培养液与培养条件
最常用的是碳酸氢钠或Hepe’s缓冲的 TCM-199;
5%CO2、饱和湿度、38.5--39度，24H。
2. 成熟培养中添加成分的影响
1)促性腺激素与E2的影响 2)EGF的影响 3)颗粒细胞的影响:低浓度能促进成熟分裂 4)血清的影响
三、牛精子的体外获能与体外受精
二、卵巢卵母细胞的获得与体外成熟培养
1. 活体卵巢上采集
母畜超排处理后，利用剖腹术或腹腔镜技术已能成功地采集卵泡卵母细胞。
2. 屠宰后卵巢上采集
(1)卵巢的采集与保存:宰后立即无菌采集, 30--37度灭菌生理盐水中6H内运回实验室。 (2)卵巢表面卵泡细胞的获得
1)抽取法:18号针头;最常用; 2)剥离法: 3)切开法:
3. 卵巢内卵泡卵母细胞的获得
数量多，用一组特制刀片对卵巢组织进行深部切割，采卵率约提高1倍。
大家有疑问的，可以询问和交流
可以互相讨论下，但要小声点
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（二）卵母细胞的筛选
只有周围包被着完整卵丘（A级）或部分卵丘脱落（B级）、胞浆均质并充满于透明带内的卵母细胞才能进行成熟与胚胎发育的培养。
哺乳动物胚胎体外生产技术

拓展阅读：哺乳动物胚胎工程及其进展简介

哺乳动物胚胎工程及其进展简介随着科学技术的高度发展，建立在生命科学理论基础上的生物技术在人类生产生活中的作用越来越大。

生物技术主要包括四个方面：基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程。

而动物胚胎工程就是细胞工程的重要组成部分，是动物育种、品种改良的有效途径，是细胞生物学和发育生物学研究生命本质的有效方式。

在这里，我想简单地介绍一下哺乳动物胚胎工程及其进展情况。

1.胚胎体外培养这是胚胎工程的基础。

体外培养要求获得较多的受精卵或胚胎作供体。

学者运用促性腺激素对卵巢发育作用的原理，在母畜发情周期的适当时期注入适量的促性腺激素，可以诱发母畜卵巢内较多的卵泡同时发育、成熟、排卵，这种技术称超数排卵技术，可使动物提供较多的胚胎以供实验。

日本花田章等以培养基加胎儿血浆的方法做出了体外培育卵子成熟的实验，扩大了超数排卵境界，使人们可以利用屠宰场母畜的卵巢，在体外培育得到成熟卵。

2.胚胎移植胚胎体外培养到一定发育阶段，必须移植到同步发情的母畜子宫内。

解决同步发情的方法有两种：一是利用自然同期发情的母畜，此法在实践上较难办到；二是诱发同期发情，就是掌握发情规律，通过注射某些药物（如孕激素、雌激素等）诱发同期发情，这样可减少母畜的数量又能保证每天有一定数量的同期发情母畜作宿主。

在我国、胚胎移植成功率达50％，国外可达70％。

3.胚胎保存一种方法是低温保存在37℃以下，0℃以上使胚胎细胞分裂暂停，新陈代谢降低，但并未停止，保存时不必加入抗冻剂及一系列冷冻和解冻处理，适于短期保存和近距离运输。

再一种方法是超低温保存，利用液氮（-196℃）、液氦（-269℃）保存，胚胎新陈代谢完全停止。

该方法较复杂，有一系列冷冻和解冻过程，而且抗冻剂处理不当就会造成胚胎损伤和死亡。

解冻后经检查鉴定正常的胚胎须立即放在37℃的磷酸盐缓冲液内等待移植。

该法可长期保存及做远距离运输。

对于保存的胚胎，可以鉴别死活，还可对其做出性别判断，准确度达60％4.胚胎分割胚胎发育到囊胚期以前没分化的细胞具有全能性。