乳酸乳球菌AL2基因文库的构建及乳链菌肽生物合成基因簇的筛选

!国家自然科学基金资助项目（!"#$%%&），国家“九五”科技攻关项目（"’()%!(%*(%#）!!通讯联系人本文作者还有吴晓勇、张成康（北京大学生命科学学院细胞生物学及遗传学系*""+级本科生）作者简介：陈秀珠（*",,-），女，浙江宁波人，副研究员，主要从事乳酸菌分子遗传学研究乳酸乳球菌./+基因文库的构建及乳链菌肽生物合成基因簇的筛选!陈秀珠胡海菁贾士芳陈美玲还连栋!!（中国科学院微生物研究所微生物资源前期开发国家重点实验室北京*%%%&%）摘要：用本实验室获得的乳链菌肽高产菌株乳酸乳球菌./+总01.为供体，以!234/!为载体，构建了该菌株的基因文库，共获得!"%%多个噬斑。

通过56789:;<杂交、=)>扩增及01.序列测定，证实从该文库中筛选到一个含有完整乳链菌肽生物合成基因簇的重组噬菌体!?@(!。

关键词：乳酸乳球菌，基因文库，乳链菌肽，生物合成基因簇中图分类号：A $&#文献标识码：.文章编号：%%%*-’+%"（+%%%）%#(%,’#(’"乳链菌肽（1B C B <）是由某些乳酸乳球菌（!"#$%#%##&’("#$)’）产生的小肽，对许多革兰氏阳性菌有强烈抑制作用，是一种广泛应用的高效、无毒的天然食品防腐剂。

成熟的乳链菌肽分子含有!,个氨基酸残基，分子量约!#*%0D 。

在生物合成过程中，它首先以前体的形式在核糖体上合成，随后通过翻译后酶修饰作用在特定的位点脱水、形成硫醚桥，产生羊毛硫氨酸和"(甲基羊毛硫氨酸等稀有氨基酸，并切除前导肽，赋于乳链菌肽分子以杀菌活性和热稳定性。

由于乳链菌肽的生物学功能及其独特的结构，加之它是一个含!,个氨基酸残基的小肽，因此，对乳链菌肽生物合成有关基因的克隆与表达不仅对研究乳链菌肽的分子结构和功能，而且对进一步研究乳链菌肽的翻译后修饰及建立蛋白质工程研究的模式系统都有重要意义。

本工作构建了乳链菌肽高产菌株!*("#$)’./+的基因文库，从中筛选到含有完整乳链菌肽生物合成基因的基因簇。

为研究乳链菌肽的生物合成及乳链菌肽的分子结构与功能奠定了基础。

!材料和方法!"!菌株与质粒!"#$%#%##&’("#$)’./+、+’#,-.)#,)"#%()@3*%"、E3F #%!由本实验室保存。

+*#%()/2!"+购自=;6G :HD 公司。

E 3I 54J 7:K (L :M 86;购自.G :;C 9D <公司。

!"#工具酶与试剂限制性内切酶、K ,01.连接酶、234/!/"0?N.;G C)J 6<B <H 5OC 8:G=J 7C=D M P D (,%卷#期+%%%年*%月微生物学报!"#$%&"’()&(*(+&"$,&-&"$Q 6J R ,%16R #""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""I M 86S :;+%%%!"#"$%&’"(购自)*+("!,公司。

-./-012,3"45#!,#6-"’"7’5+#85’购自9+":*5#!"*;,##:"5(公司。

<,=酶购自华美公司。

!"#$%&的提取!"#"!乳酸乳球菌总-01的提取按文献［>］。

!"#"’质粒-01及!噬菌体-01的提取按文献［?］。

!"(!"#$基因的)*+扩增!"("!引物设计：根据已发表的!"#$-01序列［@］设计如下两条引物：A ’端引物（)@）：A ’B<///11<<C C 1<1/<</<11C /B @’，并引入%&’D .酶切位点，@’端引物（)E ）：A’B1<<11/C <<1/1/<11/11C </B @’，并引入("!6"酶切位点。

!"("’)C D 扩增：用)*+,&-"#12?总-01为模板。

)C D 反应条件：F E G 变性>(5#，E A G 退火>(5#，H ?G 延伸>(5#，反应进行@I 个循环。

!",基因文库的构建用)*+,&-"#12?总-01为供体，!J ;92@为载体，%*&’+"2J @F ?为转染受体菌。

具体操作按)*+("!,公司/"#+(57C 4+#5#!;,#K ,4进行。

!"-噬斑原位杂交、点杂交和./012345杂交按文献［?］和9+":*5#!"*;,##:"5(公司的说明书进行。

!"6$%&序列测定)C D 扩增产物连接到L ;M $94K "<N O "7’+*上，转化%*&’+"P ;>I F ，依据$,#!"*双脱氧终止法测定-01序列。

使用19.公司@H @1自动序列分析仪，测序反应试剂盒购自19.公司，测序全过程按19.公司操作说明书进行。

’结果和讨论’"!基因文库的构建以!J ;92@为载体，$,K @1>部分酶切本实验室得到的乳链菌肽高产菌株乳酸乳球菌12?总-01［E ］，回收>A #?@Q 3大小的-01片段，与J ;92@双臂连接，用!包装抽提物（L ,7Q ,!"#"）体外包装，转染%*&’+"2J @F ?，构建)*+,&-"#12?基因文库，共获得@F I I 多个噬斑。

随机选取@个噬斑提取-01，证实插入片段在>R #?@Q 3之间。

乳酸乳球菌染色体基因组大小为?@I I #?R I I Q 3，乳链菌肽生物合成基因簇共有>>个基因，全长约>E Q 3，J ;92@载体包装外源片段大小为F #?@Q 3，按照C 4,*Q "N C ,*3+#公式./4#（>01）4#（>02），要使基因文库中所含乳链菌肽生物合成基因簇的概率（)）达到F F S ，则需重组噬菌体数（0）F I I 个，而本实验获得的重组噬菌体数远远超过F F S 的理论值要求，使乳链菌肽生物合成基因簇在该文库中出现的概率大于F F T F F S 。

’"’乳链菌肽生物合成基因簇的筛选’"’"!!"#3、!"#$-01探针的制备：根据文献报道，乳链菌肽生物合成基因簇的两端分别为编码乳链菌肽前体蛋白的!"#3／!"#4及与乳链菌肽免疫有关的!"#$基因［@，A ］。

我们以这个基因簇两端的-01片段作为探针与已得到的噬斑进行杂交，筛选含有完整乳链RR E 微生物学报E I 卷本实验室构建的质粒!"#$%&含有来自乳链菌肽产生菌!"#$%&’(’())**+$+的)’(*［,］。

将)’(*基因用+%,-.、-’)/!双酶切取下后，以非放射性同位素地高辛标记制备探针。

同时，按本文材料和方法所述另外设计一对引物（0&，0+），用!"#$%&’(’12总34’为模板，0)-扩增)’(.基因片段。

将0)-产物连接到!"56789:(;<:=>?@上，经+%,-.、-’)/!酶切取下外源片段，地高辛标记制备探针，用于筛选含有完整乳链菌肽生物合成基因簇的重组噬菌体。

!"!"!乳链菌肽生物合成基因簇的筛选：首先以部分)’(.34’片段为探针，用噬斑原位杂交方法对构建的基因文库进行筛选，得到2*个阳性噬斑（图*）。

再以)’(*34’片段为探针，对这2*个噬菌体34’进行点杂交，最后得到一个对两个探针杂交都呈阳性的重组噬菌体"A B ;&（图2）。

图噬斑的原位杂交图点杂交结果基因文库的构建及乳链菌肽生物合成基因簇的筛选卷参考文献［!］"#$%&’()&*，+,##&-$-./0，/1%22-&#3*4!"##$%%&’()*)+()&，!567，!：8!!894［:］/-;<,))=*，>,%(?@AB>，C -&(%-(%?D 4C )2#@E 2-,F 2)&%&’：G"-<),-(),.C -&E -24:&H #H 4I #$J ),=：F )2H /1,%&’K -,<),"-<),-(),.L ,#??，!5654［9］/%#’#,?M ，B &(%-&M N 04$%%&,-.(*)-’(/*)+()&，!558，"#：!O 6:!!O 654［P ］还连栋，陶勇，何松，等Q 微生物学报，!558，$!：9R P !9R 7Q［8］0)H HK C ，K ),&I ，F A -&S F ，"#0&1’(/*)+()&)23，!55R ，#%&：:968!:95:4［R ］还连栋，陶勇，田宇清，等Q 生物工程学报，!558，##：965!95!Q［7］M E %1#,?TL ，3##,(A E .U #&C C ，/%#U #&V*，"#0&1,4*56()/7"8，!559，&#"：:6!!:5!4’()*+,-’+.()(/01)(2.’3.4,5,6/,(2!"#$%&’(53:5)7.*(+5+.()(/1)+.,1).*.)4.(*6)+81*.*01)1’3-*+1,!F A #&W %E U A E K EK -%X %&’*%-/A %Y -&’F A #&C #%2%&’K E -&"%-&H )&’!!（9#0#":"3&0+)*0#)*3);’(/*)+(0&<"=)4*/"=，>-=#(#4#");’(/*)+()&)23，?7(-"="$/0@"83);9/("-/"=，6"(A (-2!O O O 6O ）59:;<=>;：G ()(-20I G 2%<,-,.)Y !0/#)/)//4=&0/#(=G ":$%(AA %’A .%#2H )Y &%?%&$-??E @@#??Y E 22.@)&?(,E @(#H E ?%&’2-;<H -B C 3"9-?Z #@(),495O O 12-[E #?$#,#)<(-%&#H ，$A %@A %?;E @A;),#(A -&(A #,#[E %,#H &E ;<#,)Y ,#@);<%&-&(?(A -(,#1,#?#&(?-&#&(%,#!1&0/#(=’#&);#-@@),H %&’()F 2-,=#-&HF -,<)&Y ),;E 2-4/)E (A #,&A .<,%H %U -(%)&，L F V-;12%Y %@-(%)&-&H0I G?#[E #&@%&’,#Z #-2#H (A -((A ##&(%,#&%?%&<%)?.&(A #?%?’#&#@2E ?(#,$-?%?)2-(#H Y ,);(A #@)&?(,E @(#H 2%<,-,.4?@A BC <D :：!1&0/#(=，+#&);%@2%<,-,.，I %?%&，3%)?.&(A #?%?’#&#@2E ?(#,!L ,)X #@(?E 11),(#H <.(A #I -(%)&-2I -(E ,-2/@%#&@#>)E &H -(%)&)YF A %&-（9587O O O 6）-&H F A %&#?#I -(%)&-2L ,)’,-;?Y ),/@%#&@#-&HD #@A &)2)’.0#Z #2)1;#&(（5R N F O 9N O !N O 8）4!!F ),,#?1)&H %&’"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""##-E (A #,《微生物学报》第七届编辑委员会名单主编李季伦副主编陆德如朱关福李阜棣王敖全谭华荣编委王修垣邓子新田波刘志恒朱庆裴孙志浩李焕娄陈世平陈永青杨苏声周培瑾范云六范孝用钱新民钱世钧诸葛健徐怀恕翟中和顾问张树政5R P 8期陈秀珠等：乳酸乳球菌G ":基因文库的构建及乳链菌肽生物合成基因簇的筛选。