【医学超级全核医学】第六章

免疫活性，即质同。
他们的化学结构和化学性质要相同，对特异性抗体
的亲和力要相同。并且，标准抗原与待测抗原所处
的介质条件要相同。
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2、定量要准确：
整个RIA分析系统的定量基础就是标准抗原的量， 因此标准抗原的定量一定要准确，即与国家规定的 标准品相比有良好的可比性。 只有保证标准抗原的准确定量，才能保证RIA分析 系统的准确度和精确度。
2. 非特异结合管（NSB）：标记抗原除了要和特异性抗体 结合以外，还要和一些杂质蛋白或容器的管壁等结合， 对我们的分析结果产生影响。NSB管是用蒸馏水代替特 异性抗体，在相同条件下反应后测得的放射性。
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3. 总放射性管（T）：反应后不分离就直接测得的放射性就是 总放射性。表示标记抗原抗体复合物和游离的标记抗原的总 放射性。
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3、标记抗原要有足够高的放射化学纯度，一般要大
于95%。
放射化学纯度不高，可能使一些放射性的杂质对RIA的免
疫反应和动力学参数产生影响。
由于存在放射性核素的衰变，因此在长期储存后的标记抗 原一般要经过重新提纯后才能再次使用。
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4、标记抗原的稳定性要好：
和标准抗原相比，标记抗原由于有了放射性核素 射线的影响，更容易发生分解。 在标记抗原的储存上，应遵循标记化合物的保存 原则即低温、降低比放射性、清除自由基等。
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B1% B2% B3% B4% B5% B6%
Ab
*Ag
分离B、F
B%=B/(B+F)
F%=F/(B+F) R=B/F
Ag
浓度
1
2
3
4
5
6
17
25
50 100 200 400 800
B%
标准曲线
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未知样品的测量
在同等条件下，用待测抗原与一定量的标记抗原与 限量特异性抗体发生反应，并用同样的方法分离待 测抗原的B和F，测量其放射性，计算出B/F，在剂 量反应曲线上就可以查出对应的抗原浓度。
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（三）特异性抗体
包括多克隆抗体和单克隆抗体。
抗体的质量之间关系到RIA分析方法的灵敏度
和特异性。
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抗体的要求（三高）
高亲和力
高特异性
高滴度
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抗体的检测指标
1、亲和常数K（affinity constant）：
亲和常数反应了抗体与抗原的亲和力。 K值越大，形成抗体抗原复合物速度快，解离少，灵敏 度高，准确度和精确度都好。
4. 标准管（B1~Bn）：放有不同浓度的标准抗原，再加入相同 量的标记抗原和特异抗体。一般在反应后分离出沉淀，测定 沉淀的放射性作为B。 5. 样品管（Bx）：用同剂量的样品代替标准管中的标准抗原， 在相同条件下反应和分离，同样取沉淀测得其放射性，就可 以在绘制的标准曲线上找到样品的浓度。
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选用不同的反应变量作纵坐标，标准曲线的形状也
在溶液中，大分子的标记抗原抗体复合物由一层水分子膜 所包被，使其能够溶解在溶液里。
在溶液中加入一定量的沉淀剂如聚乙二醇，乙醇等可以破 坏大分子的水包膜，使大分子互相靠拢，形成更大的分子 而沉淀下来。
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（三）特异性分离方法
1、双抗体法： 用待测抗原的抗体（第一抗体，Ab1）作为抗原去免疫
另一种属的动物而产生新的抗体（第二抗体，Ab2），Ab2
② 特异性分离方法：利用免疫反应的特异性来进行分离 的方法如双抗体法等。
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（一）分离方法的要求
分离完全、快速。 不影响免疫反应的平衡，即是要求在分离过程中 不使抗原-抗体复合物解离或形成新的复合物。 受环境因素（温度、PH值等）的影响小。 操作简便，分离剂来源丰富、价廉。
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（二）非特异性分离方法
3、磁性微粒分离技术
是一种新兴的分离技术。
磁性微粒是用高分子材料和金属离子如Fe3O4为原料，聚合 而成的一种以金属离子为核心，外层则均匀地包裹高分子 聚合体的固相微粒。
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使用时磁性微粒经过特异性抗体包被制成的免疫磁性微粒 以悬浮液状态存在于反应溶液中，在反应中与抗原结合形
成复合体后，当受外加磁场吸引的作用磁性微粒可快速沉
放射性非竞 争结合分析
免疫放射分析
(immunoradiometric assay, IRMA)
酶免疫分析 (EIA)
体外非放射分析
化学发光免疫分析 (CLIA) 荧光免疫分析 (FIA)
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放射免疫分析
radioimmunoassay, RIA
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放射免疫分析法是Yalow和Berson
于1959年在研究胰岛素的时候创
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基本原理
*Ag + Ab + Ag
*Ag与Ag 免疫活性相同 *Ag＋Ag > Ab
*Ag-Ab + *Ag (F) (B) Ag-Ab + Ag
Ag= * Ag , AgAb=*AgAb Ag > *Ag , *AgAb (B) *Ag(F) Ag < *Ag , *AgAb (B) *Ag (F)
立的一种体外放射分析技术。 结合了放射性核素的高灵敏度和 抗原抗体反应的高特异性。
Dr. Yalow
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一、RIA的基本原理
（一）竞争抑制结合反应：
放射免疫分析是在体外条件下，由足量的非标 记抗原（Ag）与定量的标记抗原（*Ag）对限量的
特异性抗体（Ab）的竞争抑制结合反应。
Ag和*Ag Ab间呈负相关函数关系
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方法学基础：结合反应动力学规律
遵守可逆反应的质量作用定律： k1, v1
[L]+[R]
k2, v2
[RL]
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定量手段
(标记配体作为示踪剂)
放射性测量技术 酶定量技术
化学发光定量技术
荧光定量技术
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分类:
体 外 分 析 技 术
体外放射分析
放射性竞争 结合分析
放射免疫分析 (radioimmunoassay, RIA)
不同。
常用的有B%，B/F，B/Bo，F/B，Bo/B等。
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标准曲线 左：横座标为等份刻度；右：横座标为对数刻度
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二、RIA基本试剂
（一）标准抗原
是厂家给出已知剂量的非标记抗原。 一般每一个RIA试剂盒里都有浓度由小到大 的多瓶标准抗原。
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标准抗原的要求：
1、标准抗原与待测抗原、标记抗原具有基本相同的
其它生物活性物质和药物浓度等。
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体外放射分析技术是结合了放射性核素的高灵敏度和特
异性结合反应的高特异性的一种超微量分析技术，具有
灵敏度高、特异性强、精密度好、样品用量少、放射线
不引入人体内、应用面广、方法简便等优点。是对多种
疾病诊治和研究的重要方法之一。 1959年由美国 Berson & Yalow建立了本方法， Yalow 为此在1977年获得诺贝尔医学与生理学奖
第六章
体外分析
皖南医学院 弋矶山医院 陶绍能
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定义
体外分析以放射性核素或其他非放射性物质 标记的配体(Ligand)为示踪剂，以配体和结 合体的结合反应为基础，在试管内进行的微 量生物活性物质的检测技术。
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放射分析方法或其派生的相关技术 在体外进行机体内物质种类和含量的分析测定。 测定对象是患者血清或其他体液样品内的激素、
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B1% B2% B3% B4% B5% B6% B%
Ab
*Ag
分离B、F
Ag
1
2
3
4
5
6
？
20
25
50 100 200 400 800
B%
F%
60
Calibration Curve
B/F
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在实际的操作中，一般要设立：
1. 最大结合管（Bo）：标准抗原的量为0，只有标记抗原和 特异性抗体时，标记抗原与抗体充分反应后分离B和F， 所测得的B的放射性为Bo。这是没有标准抗原与之竞争 时，标记抗原和抗体的结合达最大值。
K=结合常数k1 / 解离常数k2 。
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2、交叉反应率： 指抗体识别相应抗原类似物的能力，反应了抗体的特异性。 在生物体内的复杂环境中，许多生物活性物质都有很多相似 的类似物，例如甲状腺素中就有T3、T4、rT3等，雌激素里 又有雌二醇、雌三醇等。 交叉反应率越低，则说明抗体与抗原类似物的交叉反应就越 小，其识别抗原类似物的能力就越强，特异性就越强。
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Ag + *Ag
+ Ab
+ + +
*AgAb + AgAb + *Ag + Ag
+ + +
+ +
+ +
+
+
+
+
+
+
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（二）剂量反应曲线：标准曲线
标记物与被测物之间的函数关系可以用剂量反应 曲线来表示。剂量反应曲线是用一系列标准抗原 反应而绘制出来的，所以又叫标准曲线。
标准抗原(标准品)是厂家在试剂盒中提供的已知剂 量的非标记抗原。
1、吸附法：
利用表面活性物质将反应液中的中小分子，即游 离部分F吸附，离心后将大分子B留在上清夜中达 到分离的目的。
常用的表面活性物质是葡聚糖凝胶和活性碳颗粒。
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2、过滤法： 用一定规格孔径的滤膜过滤，大分子不能通过而 留在滤膜上，达到分离的目的。
常用0.22µ m的醋酸纤维薄膜。
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3、沉淀法：
活性的标记抗原占总放
射性的百分数。 >90%