核酸类药物概述
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核酸类药物生产工艺
类药物
三磷酸腺苷生产工艺
2、以兔肌肉为原料
⑤除热原、杂质 将洗脱液按总体积计加入0.6％的硅藻土，0.4％的 活性炭搅拌10min，用4号垂熔漏斗过滤，收集ATP滤液。
⑥结晶、干燥 用6M盐酸调滤液至pH2.5—3，在28℃的水浴中恒温, 加乙醇，不断搅拌，使ATP二钠结晶，用4号垂熔漏斗过滤，分别用 无水乙醇、乙醚洗涤，收集ATP二钠结晶，置五氧化二磷干燥器内 真空干燥，即得ATP成品。次滤液，冷处静置3h，经布氏漏斗过滤 至澄清，得提取液。
2
生物制药工艺学——核酸类药物概 述
核酸是由许多核苷酸以3’， 5’-磷酸二酯键连接而成的大分 子化合物。核苷酸由碱基、戊糖 和磷酸三部分组成，碱基和戊糖 组成的单元叫核苷。核酸类药物 包括核酸、核苷酸、核苷、碱基 及其衍生物。 依据化学结构和组成分四大类：
1 核酸碱基及其衍生物 2 核苷及其衍生物 3 核苷酸及其衍生物 4 多核苷酸
2020/2/9
6
生物制药工艺学——核酸类药物
三磷酸腺苷生产工艺
1、化学结构和性质
白色类白色粉末，易溶于水， 难溶于有机溶剂。在水中的 溶解度具有氢型＞钠盐＞钡 盐＞汞盐的顺序。在碱性溶 液(pHl0)及低温下比较稳定。 ATP二钠是两性化合物。能与 可溶性汞盐和钡盐形成不溶 于水的沉淀物，利用这种性 质可分离ATP。
生物制药工艺学——核酸类药物
核酸类药物 基本概况 核苷酸生产工艺 三磷酸腺苷生产工艺
2020/2/9
1
生物制药工艺学——核酸类药物概 述
核酸类药物分为两类：一类为具有天然结构的核酸类物质, 这类药 物已广泛用于放射病(Co60)、血小板减少症、白细胞减少症、慢性肝 炎、心血管疾病等，属于这一类的核酸类药物有ATP、辅酶A、脱氧 核苷酸等。第二类为天然结构碱基、核苷、核苷酸结构类似物或聚合 物，这类药物是当今人类治疗病毒、肿瘤、艾滋病的重要手段，也是 产生干扰素、免疫抑制的临床药物，主要有三氟胸苷、叠氮胸苷、阿 糖腺苷等。
三磷酸腺苷生产工艺
2、以兔肌肉为原料
⑤除热原、杂质 将洗脱液按总体积计加入0.6％的硅藻土，0.4％的 活性炭搅拌10min，用4号垂熔漏斗过滤，收集ATP滤液。
⑥结晶、干燥 用6M盐酸调滤液至pH2.5—3，在28℃的水浴中恒温, 加乙醇，不断搅拌，使ATP二钠结晶，用4号垂熔漏斗过滤，分别用 无水乙醇、乙醚洗涤，收集ATP二钠结晶，置五氧化二磷干燥器内 真空干燥，即得ATP成品。次滤液，冷处静置3h，经布氏漏斗过滤 至澄清，得提取液。
2
生物制药工艺学——核酸类药物概 述
核酸是由许多核苷酸以3’， 5’-磷酸二酯键连接而成的大分 子化合物。核苷酸由碱基、戊糖 和磷酸三部分组成，碱基和戊糖 组成的单元叫核苷。核酸类药物 包括核酸、核苷酸、核苷、碱基 及其衍生物。 依据化学结构和组成分四大类：
1 核酸碱基及其衍生物 2 核苷及其衍生物 3 核苷酸及其衍生物 4 多核苷酸
2020/2/9
6
生物制药工艺学——核酸类药物
三磷酸腺苷生产工艺
1、化学结构和性质
白色类白色粉末，易溶于水， 难溶于有机溶剂。在水中的 溶解度具有氢型＞钠盐＞钡 盐＞汞盐的顺序。在碱性溶 液(pHl0)及低温下比较稳定。 ATP二钠是两性化合物。能与 可溶性汞盐和钡盐形成不溶 于水的沉淀物，利用这种性 质可分离ATP。
生物制药工艺学——核酸类药物
核酸类药物 基本概况 核苷酸生产工艺 三磷酸腺苷生产工艺
2020/2/9
1
生物制药工艺学——核酸类药物概 述
核酸类药物分为两类：一类为具有天然结构的核酸类物质, 这类药 物已广泛用于放射病(Co60)、血小板减少症、白细胞减少症、慢性肝 炎、心血管疾病等，属于这一类的核酸类药物有ATP、辅酶A、脱氧 核苷酸等。第二类为天然结构碱基、核苷、核苷酸结构类似物或聚合 物，这类药物是当今人类治疗病毒、肿瘤、艾滋病的重要手段，也是 产生干扰素、免疫抑制的临床药物，主要有三氟胸苷、叠氮胸苷、阿 糖腺苷等。
生物制药：第十二章 核酸类药物
自然结构类似物或聚合物
临床：病毒、肿瘤、艾滋病、产生干扰素、免疫抑制剂 代表药物：三氟代胸苷、叠氮胸苷、无环鸟苷、恩替卡韦等 制备方法：由自然结构核酸类物质通过半类药物
恩替卡韦
二、核酸类药物的生产方法
（一）核酸类药物的原材料 除病毒外，所有的动植
物组织中都含有核酸类物 质，包括大分子DNA和RNA、 小分子的核苷酸、核苷、碱 基等成分，但不同的组织中 含量有所不同。
酶液
混合，调pH 保温
鱼精
绞肉机粉碎
鱼精匀浆
热变性 冷却，过滤
DNA溶液
酶解液
加热使酶失活，调pH9.0置冷过夜，过滤
DNA降解液
吸附于氯型阴离子交换树脂分步洗脱
脱氧胞苷酸 dCMP
脱氧腺苷 dAMP
脱氧胸苷酸 dTMP
脱氧鸟苷酸 dGMP
三、主要核酸类药物的生产
1、RNA的提取——等电沉淀法
酵母菌体
稀NaOH，提取
提取液
中和，分离
抽提清液
pH2.5
RNA精品
洗涤、干燥
RNA粗品
工艺过程：
（1）预处理：压榨、除水；（2）提取：0.13%NaOH，使细胞壁变 性，使核酸从细胞内释放出来；（3）中和、除菌体；（4）分离：等 电点法，调pH2.5，使RNA沉淀下来；（5）洗涤、干燥
2、DNA的提取
猪脾脏
[预处理] 冷冻，绞碎
组织浆液
[预处理]
0.1M NaCl-0.5M 柠檬酸混合液，
离心
沉淀
[抽提] 1M NaCl
上清液
0.14M NaCl
沉淀物
95%乙醇
上清液 氯仿-异戊醇 （DNA）
溶解液
10% NaCl
临床：病毒、肿瘤、艾滋病、产生干扰素、免疫抑制剂 代表药物：三氟代胸苷、叠氮胸苷、无环鸟苷、恩替卡韦等 制备方法：由自然结构核酸类物质通过半类药物
恩替卡韦
二、核酸类药物的生产方法
（一）核酸类药物的原材料 除病毒外，所有的动植
物组织中都含有核酸类物 质，包括大分子DNA和RNA、 小分子的核苷酸、核苷、碱 基等成分，但不同的组织中 含量有所不同。
酶液
混合，调pH 保温
鱼精
绞肉机粉碎
鱼精匀浆
热变性 冷却，过滤
DNA溶液
酶解液
加热使酶失活，调pH9.0置冷过夜，过滤
DNA降解液
吸附于氯型阴离子交换树脂分步洗脱
脱氧胞苷酸 dCMP
脱氧腺苷 dAMP
脱氧胸苷酸 dTMP
脱氧鸟苷酸 dGMP
三、主要核酸类药物的生产
1、RNA的提取——等电沉淀法
酵母菌体
稀NaOH，提取
提取液
中和，分离
抽提清液
pH2.5
RNA精品
洗涤、干燥
RNA粗品
工艺过程：
（1）预处理：压榨、除水；（2）提取：0.13%NaOH，使细胞壁变 性，使核酸从细胞内释放出来；（3）中和、除菌体；（4）分离：等 电点法，调pH2.5，使RNA沉淀下来；（5）洗涤、干燥
2、DNA的提取
猪脾脏
[预处理] 冷冻，绞碎
组织浆液
[预处理]
0.1M NaCl-0.5M 柠檬酸混合液，
离心
沉淀
[抽提] 1M NaCl
上清液
0.14M NaCl
沉淀物
95%乙醇
上清液 氯仿-异戊醇 （DNA）
溶解液
10% NaCl
核酸类药物 命名
核酸类药物1. 什么是核酸类药物？核酸类药物是一类利用核酸作为主要活性成分的药物。
核酸是构成生物体遗传物质的基本分子，包括DNA（脱氧核糖核酸）和RNA（核糖核酸）。
核酸类药物通过干预或修复人体细胞内的核酸分子，调节基因表达，从而实现治疗疾病的目的。
核酸类药物主要包括基因治疗药物和核酸药物。
2. 基因治疗药物基因治疗药物是利用基因工程技术将外源基因导入人体细胞，修复或替代缺陷基因，从而治疗疾病的药物。
基因治疗药物通常包括基因替代疗法、基因修复疗法和基因静默疗法。
2.1 基因替代疗法基因替代疗法通过将正常的基因导入到受损细胞中，代替缺陷基因的功能，从而恢复正常的细胞功能。
这种疗法常用于治疗单基因遗传性疾病，如囊性纤维化、遗传性失聪等。
2.2 基因修复疗法基因修复疗法通过修复受损基因的突变位点，使其恢复正常功能。
这种疗法常用于治疗一些突变基因导致的疾病，如血友病、遗传性视网膜病变等。
2.3 基因静默疗法基因静默疗法通过介入RNA干扰（RNAi）机制，抑制特定基因的表达，从而达到治疗疾病的目的。
这种疗法常用于治疗一些基因过度表达导致的疾病，如肝癌、乳腺癌等。
3. 核酸药物核酸药物是利用核酸分子作为药物的主要成分，通过调节基因表达或干扰特定基因的功能，实现治疗疾病的目的。
核酸药物主要包括DNA药物和RNA药物。
3.1 DNA药物DNA药物是利用DNA分子作为药物的主要成分，通过干预人体细胞内的基因表达，调节蛋白质合成，实现治疗疾病的目的。
DNA药物常用于治疗一些基因过度表达导致的疾病，如肿瘤和免疫性疾病。
DNA药物的研发和应用面临一些挑战，如如何提高药物的递送效率、如何避免免疫反应等。
3.2 RNA药物RNA药物是利用RNA分子作为药物的主要成分，通过干扰特定基因的表达或调节蛋白质合成，实现治疗疾病的目的。
RNA药物常用于治疗一些基因过度表达导致的疾病，如癌症和病毒感染等。
RNA药物的研发和应用也面临一些挑战，如如何提高药物的稳定性和递送效率、如何避免免疫反应等。
核酸药物类型及其临床应用
核酸药物类型及其临床应用
核酸药物是一类具有特殊生物学功能的药物，广泛用于治疗疾病、
基因治疗等方面，包括核酸疗法、miRNA治疗、RNAi治疗等多种类型。
下面我们将对核酸药物的类型及其在临床上的应用进行详细介绍。
1. 核酸药物的类型
核酸药物主要包括DNA、RNA等类别，根据其结构和功能的不同，可以划分为以下几种类型：
1.1 DNA药物：DNA药物通常用于基因疗法，可以通过递送外源基因来治疗某些基因缺陷性疾病，如囊性纤维化、遗传性视网膜病变等。
1.2 RNA药物：RNA药物主要包括mRNA、miRNA、siRNA等，
用于调控基因表达、靶向RNA分解、抑制蛋白质合成等，具有很好的
治疗前景。
1.3 合成核酸药物：合成核酸药物是指通过化学合成制备的核酸分子，具有较强的稳定性和生物活性，可用于抗病毒、抗肿瘤等方面。
2. 核酸药物的临床应用
核酸药物在临床上有着广泛的应用，主要包括以下几个方面：
2.1 基因疗法：核酸药物可通过递送外源基因来治疗基因缺陷性疾病，如囊性纤维化、遗传性视网膜病变等，为基因治疗提供了新的途径。
2.2 抗病毒治疗：RNA药物可靶向病毒RNA，抑制病毒复制，用于治疗HIV、乙肝病毒等感染性疾病，具有很好的抗病毒效果。
2.3 抗肿瘤治疗：合成核酸药物具有抗肿瘤活性，可通过靶向RNA 分解、抑制肿瘤细胞增殖等方式，用于治疗多种恶性肿瘤。
综上所述，核酸药物作为一类新型的生物治疗药物，具有很好的应用前景和疗效，对于一些传统药物难以治疗的疾病具有重要意义。
未来随着技术的不断进步和临床试验的深入，相信核酸药物将在各个领域展现出更广阔的应用空间。
核酸类药物
2
核酸类药物分离
吸附分离法
吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择吸附 选择吸附的能力，使其富集 富集在 吸附是利用吸附剂 吸附剂 选择吸附 富集 吸附剂表面，而从混合物中的分离的的过程。 典型的吸附过程包括四个步骤： 典型的吸附过程包括四个步骤：
2
核酸类药物分离 树脂的网络骨架
2
核酸类药物分离
吸附法的特点及应用
1
作用机制
概述
2
核酸类药物分离
在分离核酸时应遵循以下原则：保证核酸一级结构的完整性；排除其它分子的污染 。 保证核酸一级结构的完整性； 保证核酸一级结构的完整性
XXXX年
XXXX
2
核酸类药物分离
1 2 3 4 5 6 7
盐析法及沉淀法 离心法 膜分离法 离子交换色谱法 亲和色谱法 吸附分离法 琼脂糖凝胶法
1
概述
反义核酸：是指能与特定mRNA精确互补、特异阻断其翻译的RNA或DNA分子。 反义核酸技术：利用核酸特异地封闭某些基因表达，使之低表达或不表达的技术。
它包括反义RNA技术、反义DNA技术和核酶（ribozymes）技术三 大技术。 反义核酸的作用机制：反义核酸作用原理基于碱基配对规则，可通过与靶RNA进 行碱基配对结合的方式参与对相关基因表达的调控。其作用方式可能有：①反义RNA 与mRNA结合形成互补双链阻断核糖核蛋白体同mRNA的结合，从而抑制了mRNA 翻译成蛋白质的过程。②反义DNA能与靶细胞形成一种三链核酸(triple helix nucleic acid),它通过作用于控制基因转录的转录子、增强子和启动子区，对基因的转录进行 调控。③反义核酸与mRNA的结合可阻挡mRNA向细胞质的运输。④反义核酸与 mRNA结合后使得mRNA更加易被核酸酶识别而降解，从而大大缩短mRNA的半衰 期。上述四种作用途径都可表现为对基因表达的抑制或调节，且这种调节是非常特 异性的
核酸类药物
已经在临床上应用的抗病毒核苷酸类药物有以下一 些品种：氮杂鸟嘌呤、巯嘌呤、6一氯嘌呤、氟胞 嘧啶、氟尿嘧啶、呋喃氟尿嘧啶、氟苷、阿糖胞苷、 环胞苷、肌苷二醛、异丙基苷、脱氧巯鸟苷、环腺 苷酸、聚肌胞等。
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反义核酸技术（简称反义技术）
利用这一技术研制的药物称为反义药物，根据核酸 杂交原理，反义药物能与特定基因杂交，在基因水 平干扰致病蛋白的产生过程，及干扰遗传信息从核 酸向蛋白质的传递。
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四、多核苷酸 二核苷酸类：有辅酶I(COⅠ)、辅酶Ⅱ(COⅡ)、黄素
腺嘌呤二核苷酸(FAD)等； 多核苷酸类：有聚肌胞苷酸(Poly I：C)、聚腺尿苷酸
(PolyA：U)、转移因子(TF)、核糖核酸(RNA)、脱 氧核糖核酸(DNA)、核酸等。
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依据核酸类药物及其衍生物的性质和功能分两类： 一类为具有天然结构的核酸类物质，缺乏这类物
传统药物主要是直接作用于致病蛋白本身，而反义 药物则作用于产生蛋白的基因，因此可广泛应用于 多种疾病的防治。
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反义核酸作为药物与常规药物相比有两个显著特点： ①有关疾病的靶基因mRNA序列是已知的，因此，
设计合理特异性的反义核酸比较容易； ②反义寡核苷酸与靶基因能通过碱基配对原理发生
特异和有效的结合，从而调节基因的表达。它的缺 点是天然的寡核苷酸难以进入细胞内，而一旦进入 又易被胞内核酸酶水解，很难直接用于治疗。
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第一节 核酸类药物的分类
依据核酸类药物及其衍生物的化学结构和组成分四 大类： 碱基及其衍生物 核苷及其衍生物 核苷酸及其衍生物 多核苷酸
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一、核酸碱基及其衍生物 多数是经过人工化学修饰的碱基衍生物。 主要有赤酮嘌呤(Eritadenine)、硫代鸟嘌呤
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反义核酸技术（简称反义技术）
利用这一技术研制的药物称为反义药物，根据核酸 杂交原理，反义药物能与特定基因杂交，在基因水 平干扰致病蛋白的产生过程，及干扰遗传信息从核 酸向蛋白质的传递。
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四、多核苷酸 二核苷酸类：有辅酶I(COⅠ)、辅酶Ⅱ(COⅡ)、黄素
腺嘌呤二核苷酸(FAD)等； 多核苷酸类：有聚肌胞苷酸(Poly I：C)、聚腺尿苷酸
(PolyA：U)、转移因子(TF)、核糖核酸(RNA)、脱 氧核糖核酸(DNA)、核酸等。
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依据核酸类药物及其衍生物的性质和功能分两类： 一类为具有天然结构的核酸类物质，缺乏这类物
传统药物主要是直接作用于致病蛋白本身，而反义 药物则作用于产生蛋白的基因，因此可广泛应用于 多种疾病的防治。
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反义核酸作为药物与常规药物相比有两个显著特点： ①有关疾病的靶基因mRNA序列是已知的，因此，
设计合理特异性的反义核酸比较容易； ②反义寡核苷酸与靶基因能通过碱基配对原理发生
特异和有效的结合，从而调节基因的表达。它的缺 点是天然的寡核苷酸难以进入细胞内，而一旦进入 又易被胞内核酸酶水解，很难直接用于治疗。
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第一节 核酸类药物的分类
依据核酸类药物及其衍生物的化学结构和组成分四 大类： 碱基及其衍生物 核苷及其衍生物 核苷酸及其衍生物 多核苷酸
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一、核酸碱基及其衍生物 多数是经过人工化学修饰的碱基衍生物。 主要有赤酮嘌呤(Eritadenine)、硫代鸟嘌呤
13 4核酸类药物
枯草芽孢杆菌嘌呤核苷酸合成途径
（Ⅰ）
（II）
黄嘌呤缺陷型
鸟腺嘌呤缺陷型 （经诱变缺失46
号或号7酶号）酶）
SAMP
6
3
（一） IMP （一）
XMP
7
8
5
AMP
GMP
AICAR
当培养基中提供限量腺嘌呤时
2 SAICAR
Ⅰ 积累IMP 肌苷
Ⅰ＋Ⅱ 积累IMP 肌苷
PRA
Ⅲ 积累XMP 黄苷
（一） （一） 1
选育Mn2+不敏感的变异株
2．发酵法生产黄苷及酶法转化成GMP
直接发酵生产GMP必须满足以下条件： • 解除GMP的抑制（与GMP积累相矛盾） • 让GMP渗出胞外，并不被分解（可以做到） • 阻断GMP－GTP合成（与菌体生产抵触）
所以只能先合成XMP，后转化为GMP。
方法：选育丧失GMP合成酶的GMP缺陷型菌株就可能积累大
可以从自然界筛选到RNA含量高的酵母菌株，也可以 用诱变育种的方法提高酵母菌的RNA含量。
1、工业用RNA的提取
1％NaOH裂
稀
酵母等 解胞壁
HCL中和
加热破坏酶
溶液
碱
调pH2-2.5
法 冷却到10OC 离心 RNA溶液（接近RNApl） 离心 RNA沉淀
浓
10％NaCL
酵母等
离心
调pH2-2.5
苷酸的原理和方法.
素强化其活性） • 增加细胞通透性（在Mn2＋过量的培养基中需添加表面活
性剂改变通透性） • 供给NH4+维持培养基PH7.5－8.0
（三）半合成法制备核苷酸
发酵法生产核苷酸成本低，产率高，工业 生产的呈味核苷酸一半左右是由发酵法生产核苷 后经提取精制后，直接在5’－羟基上磷酸化
核酸类药物的生产
核酸类药物的生产
主要内容
1、 核酸药物的分类 2、核酸类药物的生产方法 3、核酸类药物的生产实例 4、核酸类药物的检测
5、核酸药物的应用
核酸药物的分类
具有天然结构的核酸类物质
天然碱基、核苷、核苷酸 的类似物或聚合物
如：DNA、RNA、肌苷、ATP、 辅酶A、脱氧核苷酸、肌苷酸等。 获得：微生物发酵或从生物资源 中提取生产。 药理功能：有助于改善机体的物 质代谢和能量代谢平衡，加速受 损组织的修复，促使机体恢复 正常生理功能。
核酸类药物的生产实例
核酸类药物的生产实例
RNA的生产
1、来源：微生物——酵母 2、RNA的提取——等电沉淀法 3、工艺过程
（1）预处理：压榨、除水 （2）提取：0.13%NaOH，使细胞壁变性，使核酸从细胞内释放 出来 （3）中和、除菌体 （4）分离：等电点法，调pH2.5，使RNA沉淀下来 洗涤、干燥
核酸类药物的生产实例
4.发酵法生产 高含量RNA酵 母及其RNA提 取工艺流程
核酸类药物的生产实例
ATP制备
基本工艺路线：
核酸类药物的生产实例
辅酶A的生产
核酸类药物的检测
1、DNA含量测定
DNA是磷酸和戊糖通过磷酸二酯键形成的长链，所以磷酸或戊糖 的量正比例于DNA的量，可通过测定磷酸或戊糖的量来测定DNA 的量，前者称为定磷法，后者称为定糖法。 （1）定磷法 磷酸与钼酸反应生成磷钼酸，再转变为钼蓝，吸收峰在660nm。 （2）定糖法——二苯胺法 670nm
核酸类药物的生产方法
核苷酸、核苷及碱基类似物的生产方法
1、酶解法
核酸类药物的生产方法
核苷酸、核苷及碱基类似物的生产方法
2、半合成法
微生物发酵与化学合成并用。 由于发酵法生产核苷的产率很高，因此可由发酵法生产 核苷后经提取，精制再经磷酸化制取核苷酸。 方法：将核苷悬浮于磷酸三甲酯或磷酸三乙酯中，在冷 却条件下加入氯化氧磷，进行磷酸化。从核苷生成5‘核苷酸收率可达90%。
主要内容
1、 核酸药物的分类 2、核酸类药物的生产方法 3、核酸类药物的生产实例 4、核酸类药物的检测
5、核酸药物的应用
核酸药物的分类
具有天然结构的核酸类物质
天然碱基、核苷、核苷酸 的类似物或聚合物
如：DNA、RNA、肌苷、ATP、 辅酶A、脱氧核苷酸、肌苷酸等。 获得：微生物发酵或从生物资源 中提取生产。 药理功能：有助于改善机体的物 质代谢和能量代谢平衡，加速受 损组织的修复，促使机体恢复 正常生理功能。
核酸类药物的生产实例
核酸类药物的生产实例
RNA的生产
1、来源：微生物——酵母 2、RNA的提取——等电沉淀法 3、工艺过程
（1）预处理：压榨、除水 （2）提取：0.13%NaOH，使细胞壁变性，使核酸从细胞内释放 出来 （3）中和、除菌体 （4）分离：等电点法，调pH2.5，使RNA沉淀下来 洗涤、干燥
核酸类药物的生产实例
4.发酵法生产 高含量RNA酵 母及其RNA提 取工艺流程
核酸类药物的生产实例
ATP制备
基本工艺路线：
核酸类药物的生产实例
辅酶A的生产
核酸类药物的检测
1、DNA含量测定
DNA是磷酸和戊糖通过磷酸二酯键形成的长链，所以磷酸或戊糖 的量正比例于DNA的量，可通过测定磷酸或戊糖的量来测定DNA 的量，前者称为定磷法，后者称为定糖法。 （1）定磷法 磷酸与钼酸反应生成磷钼酸，再转变为钼蓝，吸收峰在660nm。 （2）定糖法——二苯胺法 670nm
核酸类药物的生产方法
核苷酸、核苷及碱基类似物的生产方法
1、酶解法
核酸类药物的生产方法
核苷酸、核苷及碱基类似物的生产方法
2、半合成法
微生物发酵与化学合成并用。 由于发酵法生产核苷的产率很高，因此可由发酵法生产 核苷后经提取，精制再经磷酸化制取核苷酸。 方法：将核苷悬浮于磷酸三甲酯或磷酸三乙酯中，在冷 却条件下加入氯化氧磷，进行磷酸化。从核苷生成5‘核苷酸收率可达90%。
核酸类药物
核苷酸是核酸的组成单元。将核苷酸中的磷酸基团去掉，剩余部分称核苷 （nucleoside）。核苷进一步水解可生成戊糖（pentose）和碱基（base）。
• 核酸类药物是具有药用价值的核酸、核苷酸、核苷以及碱基的统称。除了天 然存在的碱基、核苷、核苷酸以外，它们的类似物、衍生物或这些类似物、衍生 物的聚合物也属于核酸类药物。
酶法合成
干扰素诱导物，用于病毒性疾病、 血液病和肿瘤，对乙型脑炎腮腺炎、 风湿关节炎亦有疗效
注射剂 注射剂
RNA（ribonucleic acid）
猪、牛的肝、脾及酵母等
促白细胞生成，用于精神迟缓、记 忆衰退、痴呆、慢性肝炎、肝硬化、 肝癌
片剂、注射 剂
核酸类
免疫核糖核酸 （immune RNA）
猪、牛的肝、脾及酵Biblioteka 等鱼精蛋白、动物脾脏、小牛胸腺
用于放疗、化疗中的急性白细胞和血小板减少 症
核苷酸及 其衍生物
类
环磷酸腺苷 （cyclic adenosine monophosphate）
腺苷三磷酸（adenosine triphosphate）
合成
用于心肌炎、冠心病、急性心肌梗死、心律失 常、心绞痛以及急性白血病、牛皮癣
概述 核酸类药物一般制备方法 三磷酸腺苷 6-氨基嘌呤 免疫核糖核酸 辅酶A
第一节 概述
核酸（nucleic acid）是生物体重要的生物大分子，由许多核苷酸 （nucleotide）以3′，5′-磷酸二酯键连接而成，核苷酸又由磷酸、核糖和碱基三 部分组成。1868年，Miescher首先从脓细胞中分离出细胞核，进而从中提取到 含氮和磷特别丰富的酸性物质。当时，Miescher称其为核质（nuclein），后来 人们根据该物质来自细胞核，且呈酸性，故改称其为核酸。
• 核酸类药物是具有药用价值的核酸、核苷酸、核苷以及碱基的统称。除了天 然存在的碱基、核苷、核苷酸以外，它们的类似物、衍生物或这些类似物、衍生 物的聚合物也属于核酸类药物。
酶法合成
干扰素诱导物，用于病毒性疾病、 血液病和肿瘤，对乙型脑炎腮腺炎、 风湿关节炎亦有疗效
注射剂 注射剂
RNA（ribonucleic acid）
猪、牛的肝、脾及酵母等
促白细胞生成，用于精神迟缓、记 忆衰退、痴呆、慢性肝炎、肝硬化、 肝癌
片剂、注射 剂
核酸类
免疫核糖核酸 （immune RNA）
猪、牛的肝、脾及酵Biblioteka 等鱼精蛋白、动物脾脏、小牛胸腺
用于放疗、化疗中的急性白细胞和血小板减少 症
核苷酸及 其衍生物
类
环磷酸腺苷 （cyclic adenosine monophosphate）
腺苷三磷酸（adenosine triphosphate）
合成
用于心肌炎、冠心病、急性心肌梗死、心律失 常、心绞痛以及急性白血病、牛皮癣
概述 核酸类药物一般制备方法 三磷酸腺苷 6-氨基嘌呤 免疫核糖核酸 辅酶A
第一节 概述
核酸（nucleic acid）是生物体重要的生物大分子，由许多核苷酸 （nucleotide）以3′，5′-磷酸二酯键连接而成，核苷酸又由磷酸、核糖和碱基三 部分组成。1868年，Miescher首先从脓细胞中分离出细胞核，进而从中提取到 含氮和磷特别丰富的酸性物质。当时，Miescher称其为核质（nuclein），后来 人们根据该物质来自细胞核，且呈酸性，故改称其为核酸。
第十二章 核酸类药物
第十二章核酸类药物第一节概述一、基本概念及分类二、核酸类药物的生产方法v核酸类药物的生产方法主要有酶解法、半合成法、直接发酵法。
三、核苷酸的生物合成及其代谢调节v核酸类药物可分为两大类：第一类为具有天然结构的核酸类物质，这类药物有助于改善机体的物质代谢和能量代谢平衡，加速受损组织的修复，促使机体恢复正常生理机能。
临床上广泛使用于血小板减少症、白细胞减少症、急慢性肝炎、心血管疾病、肌肉萎缩等代谢障碍性疾病。
该核酸类药物有肌苷、ATP、辅酶A等。
这些药物多数是生物体自身能够合成的物质，它们基本上都可以经微生物发酵或从生物资源中提取生产。
第二类为自然结构碱基、核苷、核苷酸的结构类似物或聚合物，这类药物大部分由自然结构的核酸类物质通过半合成生产，此类药物是治疗病毒、肿瘤、艾滋病的重要药物，也是产生干扰素、免疫抑制剂的临床药物。
临床上用于抗病毒的这类药物有三氟代胸苷、叠氮胸苷等8种。
此外还有氮杂鸟嘌呤、巯嘌呤、氟胞嘧啶、聚肌胞、阿糖胞苷等都已用于临床。
二、核酸类药物的生产方法（1）酶解法酶解法是先用糖质原料、亚硫酸纸浆废液或其他原料发酵生产酵母，再从酵母菌体中提取核糖核酸(RNA)，提取出的核糖核酸经过青霉菌属或链霉菌属等微生物产生的酶进行酶解，制成各种核苷酸。
（2）半合成法半合成法即微生物发酵和化学合成并用的方法。
例如由发酵法先制成5-氨基4-甲酰胺咪唑核苷(AICAR)，再用化学合成制成鸟苷酸。
又如用发酵法先制成肌苷，再利用微生物的或化学的磷酸化作用，使肌苷转变为肌苷酸。
（3）直接发酵法直接发酵法是根据生产菌的特点，采用营养缺陷型菌株或营养缺陷型兼结构类似物抗性菌株，通过控制适当的发酵条件，打破菌体对核酸类物质的代谢调节控制，使之发酵生产大量的目的核苷或核苷酸。
例如用产氨短杆菌腺膘呤缺陷型突变株直接发酵生产肌苷酸。
三、核苷酸的生物合成及其代谢调节v单核苷酸的合成可以通过两条完全不同的途径来完成：一是以5’磷酸核糖为初始物质的全生物合成途径；二是从环境中取得完整的碱基(嘌呤或嘧啶)、戊糖和磷酸，通过酶的作用直接合成(组装)单核苷酸，此途径称为补救途径。
核酸类药物
相反，RNA·蛋白在盐溶液中的溶解度受盐浓度的 影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因 此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。
DNA、RNA和核苷酸既有磷酸基又有碱性基，故 为两性电解质，在一定的pH条件下，可以解离而 带有电荷，因此，都有一定的等电点，能进行电泳。
核酸由于酸性较强，能与Na+、K+、Mg2+等金属离 子结合成盐，也易与碱性化合物结合成复合物，如 能与甲苯胺蓝、派罗红、甲基绿等碱性染料结合， 其中甲基胺蓝能使RNA和DNA均染上蓝色，派罗 红专染RNA成红色，甲基绿专染DNA成绿色。
核苷二磷酸类：有尿二磷葡萄糖(UDPG)、胞二磷胆碱 (CDP-Choline)等；
核苷三磷酸类：有腺三磷(ATP)、胞三磷(CTP)、尿三 磷(UTP)、鸟三磷(GTP)等；
核苷酸类混合物：有5’-核苷酸、2’，3’-核苷酸、脱氧 核苷酸、核酪等。
四、多核苷酸
二核苷酸类：有辅酶I(COⅠ)、辅酶Ⅱ(COⅡ)、黄素 腺嘌呤二核苷酸(FAD)等；
第五章 核酸类药物
1868年瑞士青年生化学家米歇尔(Miescher)，在用 胃蛋白酶分解细胞蛋白质的时候，发现酶不能分 解细胞核。经过化学分析，细胞核主要是由含磷 的物质构成的，它的性质又不同于蛋白质，起名 叫核素，20年以后，人们发现这种物质是强酸， 改称为核酸。
德国生化学家科赛尔(Kossel)第一个系统地研究了 核酸的分子结构，从核酸的水解物中，分离出一 些含氮的化合物，命名为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧 啶、胸腺嘧啶，科赛尔因此获得了1910年的诺贝 尔医学与生理学奖。
脱氧核糖用二苯胺法测定。DNA在酸性条件下与 二苯胺一起水浴加热5min，产生蓝色，这是脱氧 核糖遇酸生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，再与二苯胺作 用而显现的蓝色反应。
DNA、RNA和核苷酸既有磷酸基又有碱性基，故 为两性电解质，在一定的pH条件下，可以解离而 带有电荷，因此，都有一定的等电点，能进行电泳。
核酸由于酸性较强，能与Na+、K+、Mg2+等金属离 子结合成盐，也易与碱性化合物结合成复合物，如 能与甲苯胺蓝、派罗红、甲基绿等碱性染料结合， 其中甲基胺蓝能使RNA和DNA均染上蓝色，派罗 红专染RNA成红色，甲基绿专染DNA成绿色。
核苷二磷酸类：有尿二磷葡萄糖(UDPG)、胞二磷胆碱 (CDP-Choline)等；
核苷三磷酸类：有腺三磷(ATP)、胞三磷(CTP)、尿三 磷(UTP)、鸟三磷(GTP)等；
核苷酸类混合物：有5’-核苷酸、2’，3’-核苷酸、脱氧 核苷酸、核酪等。
四、多核苷酸
二核苷酸类：有辅酶I(COⅠ)、辅酶Ⅱ(COⅡ)、黄素 腺嘌呤二核苷酸(FAD)等；
第五章 核酸类药物
1868年瑞士青年生化学家米歇尔(Miescher)，在用 胃蛋白酶分解细胞蛋白质的时候，发现酶不能分 解细胞核。经过化学分析，细胞核主要是由含磷 的物质构成的，它的性质又不同于蛋白质，起名 叫核素，20年以后，人们发现这种物质是强酸， 改称为核酸。
德国生化学家科赛尔(Kossel)第一个系统地研究了 核酸的分子结构，从核酸的水解物中，分离出一 些含氮的化合物，命名为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧 啶、胸腺嘧啶，科赛尔因此获得了1910年的诺贝 尔医学与生理学奖。
脱氧核糖用二苯胺法测定。DNA在酸性条件下与 二苯胺一起水浴加热5min，产生蓝色，这是脱氧 核糖遇酸生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，再与二苯胺作 用而显现的蓝色反应。
核酸类药物ppt精选课件
肌苷类：有肌苷、肌苷二醛(IDA)、异丙肌苷(Inosiplex) 脱氧核苷类：有氮杂脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine)、
脱氧硫鸟苷、三氟胸苷
.
三、核苷酸及其衍生物 单核苷酸类：有腺苷酸(AMP)、尿苷酸(UMP)、肌苷
酸(IMP)、环腺苷酸(cAMP)、双丁酰环腺苷酸(DBC)、 辅酶A(CoA)等； 核苷二磷酸类：有尿二磷葡萄糖(UDPG)、胞二磷胆碱 (CDP-Choline)等； 核苷三磷酸类：有腺三磷(ATP)、胞三磷(CTP)、尿三 磷(UTP)、鸟三磷(GTP)等； 核苷酸类混合物：有5’-核苷酸、2’，3’-核苷酸、脱氧 核苷酸、核酪等。
质会使机体代谢失调，发生病态，提供这类物质， 有助于改善机体的物质代谢和能量平衡，加速受 损组织的修复. 临床上已广泛应用于放射病、血小板减少症、白 细胞减少症、慢性肝炎、心血管疾病等。 属于这一类的核酸药物有ATP、辅酶A、脱氧核 苷酸、CTP、UTP、腺苷、混合核苷酸、辅酶I等。
.
第二类为天然碱基、核苷、核苷酸结构类似物或聚 合物，这一类核酸类药物是当今人类治疗病毒、肿 瘤、艾滋病等的重要手段，也是产生干扰素、免疫 抑制的临床药物。
已经在临床上应用的抗病毒核苷酸类药物有以下一 些品种：氮杂鸟嘌呤、巯嘌呤、6一氯嘌呤、氟胞 嘧啶、氟尿嘧啶、呋喃氟尿嘧啶、氟苷、阿糖胞苷、 环胞苷、肌苷二醛、异丙基苷、脱氧巯鸟苷、环腺 苷酸、聚肌胞等。
.
反义核酸技术（简称反义技术）
利用这一技术研制的药物称为反义药物，根据核酸 杂交原理，反义药物能与特定基因杂交，在基因水 平干扰致病蛋白的产生过程，及干扰遗传信息从核 酸向蛋白质的传递。
第五章 核酸类药物
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1868年瑞士青年生化学家米歇尔(Miescher)，在用 胃蛋白酶分解细胞蛋白质的时候，发现酶不能分 解细胞核。经过化学分析，细胞核主要是由含磷 的物质构成的，它的性质又不同于蛋白质，起名 叫核素，20年以后，人们发现这种物质是强酸， 改称为核酸。
脱氧硫鸟苷、三氟胸苷
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三、核苷酸及其衍生物 单核苷酸类：有腺苷酸(AMP)、尿苷酸(UMP)、肌苷
酸(IMP)、环腺苷酸(cAMP)、双丁酰环腺苷酸(DBC)、 辅酶A(CoA)等； 核苷二磷酸类：有尿二磷葡萄糖(UDPG)、胞二磷胆碱 (CDP-Choline)等； 核苷三磷酸类：有腺三磷(ATP)、胞三磷(CTP)、尿三 磷(UTP)、鸟三磷(GTP)等； 核苷酸类混合物：有5’-核苷酸、2’，3’-核苷酸、脱氧 核苷酸、核酪等。
质会使机体代谢失调，发生病态，提供这类物质， 有助于改善机体的物质代谢和能量平衡，加速受 损组织的修复. 临床上已广泛应用于放射病、血小板减少症、白 细胞减少症、慢性肝炎、心血管疾病等。 属于这一类的核酸药物有ATP、辅酶A、脱氧核 苷酸、CTP、UTP、腺苷、混合核苷酸、辅酶I等。
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第二类为天然碱基、核苷、核苷酸结构类似物或聚 合物，这一类核酸类药物是当今人类治疗病毒、肿 瘤、艾滋病等的重要手段，也是产生干扰素、免疫 抑制的临床药物。
已经在临床上应用的抗病毒核苷酸类药物有以下一 些品种：氮杂鸟嘌呤、巯嘌呤、6一氯嘌呤、氟胞 嘧啶、氟尿嘧啶、呋喃氟尿嘧啶、氟苷、阿糖胞苷、 环胞苷、肌苷二醛、异丙基苷、脱氧巯鸟苷、环腺 苷酸、聚肌胞等。
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反义核酸技术（简称反义技术）
利用这一技术研制的药物称为反义药物，根据核酸 杂交原理，反义药物能与特定基因杂交，在基因水 平干扰致病蛋白的产生过程，及干扰遗传信息从核 酸向蛋白质的传递。
第五章 核酸类药物
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1868年瑞士青年生化学家米歇尔(Miescher)，在用 胃蛋白酶分解细胞蛋白质的时候，发现酶不能分 解细胞核。经过化学分析，细胞核主要是由含磷 的物质构成的，它的性质又不同于蛋白质，起名 叫核素，20年以后，人们发现这种物质是强酸， 改称为核酸。
核酸和核苷类药物
发酵法生产核苷酸
1、发酵法生产肌苷酸（IMP） 肌苷酸钠是一种高效增鲜剂，在谷氨酸钠（味精）中加
2%，鲜度可增长3倍。所以，在味精中添加肌苷酸钠（或 鸟苷酸钠）后成为第二代特鲜味精。
产氨短杆菌嘌呤核苷酸生物合成途径、代谢调控和肌苷酸 发酵机制:
积累IMP旳主要前提：
（1）阻断SAMP合成酶: 即选育缺该酶旳菌株（嘌呤缺陷型），发酵前期提供适量
质。
1、RNA化学水解法制备核苷：
2、发酵法生产核苷
产率高、周期短、控制轻易、产量大。 共同特点： （1）使用磷酸单酯酶活力很强旳枯草芽孢杆菌或短小芽孢杆 菌为诱变出发菌株； （2）具有特定标识旳有变株； （3）发酵培养时需提供限量生长原因。 原菌株： （1）AMP强烈克制PRPP转酰胺酶旳活性，控制总代谢途径； （2）AMP克制SAMP合成酶； （3）GMP克制IMP脱氢酶
第二节 制备旳一般过程与原理
一、RNA旳提取与制备
工业用RNA旳提取
（ 1 ） RNA 及 其 工 业 起 源 ： 从 微 生 物 中 提 取 RNA是工业上最实际和有效旳措施。某些最 常见旳菌体具有丰富旳核酸资源，如酵母、白 地霉、多种抗菌素旳菌丝体——青霉素，制 霉菌素等菌体。
一般在细菌中RNA占5％～25％，在酵母中 占2.7％～15％，在霉菌中占0.7%～28％。
在菌体内RNA含量旳变化受培养基构成影响，其中关键 是铵离子浓度和磷酸盐浓度。培养酵母菌体收率高，易于提 取RNA。
很显然在许多酵母中，早期细胞中旳RNA含量高，其确切 数值取决于碳、氮百分比和培养基构成等。
（2）高RNA含量酵母菌株旳筛选
能够从自然界筛选到RNA含量高旳酵母菌株，也可用诱变 育种旳措施提升酵母菌旳RNA含量。
核酸类药物
生物制药工艺学——核酸类药物
核酸类药物 基本概况 核苷酸生产工艺 三磷酸腺苷生产工艺
2013-9-22
1
生物制药工艺学——核酸类药物 概 述
核酸类药物分为两类：一类为具有天然结构的核酸类物质, 这类药 物已广泛用于放射病、血小板减少症、白细胞减少症、慢性肝炎、心 血管疾病等，属于这一类的核酸类药物有ATP、辅酶A、脱氧核苷酸 等。第二类为天然结构碱基、核苷、核苷酸结构类似物或聚合物，这 类药物是当今人类治疗病毒、肿瘤、艾滋病的重要手段，也是产生干 扰素、免疫抑制的临床药物，主要有三氟胸苷、叠氮胸苷、阿糖腺苷 等。 反义核酸技术及反义药物：反义技术是用人工合成的或生物中自然存 在的寡聚核苷酸片断（反义DNA和反义RNA），结合目标基因或mRNA 特定序列(靶核酸)，从而有效地抑制或封闭基因的转录与翻译。 反义药物能与特定基因杂交，在基因水平干扰致病蛋白的产生过程， 即干扰遗传信息从核酸向蛋白质的传递。
2013-9-22 5
生物制药工艺学——核酸类药物
三磷酸腺苷生产工艺
三磷酸腺苷是体内广泛存在的辅酶，是体内组织细胞所需
能量的主要来源，蛋白质、脂肪、糖和核苷酸的合成都需 ATP参与。ATP经腺苷酸环化酶催化形成环磷酸腺苷(cAMP) ，是细胞内的生物活性物质，对细胞许多代谢过程有重要的 调节作用。 ATP为蛋白质、糖原、卵磷脂、尿素等的合成提供能量， 促使肝细胞修复和再生，增强肝细胞代谢活性，对治疗肝病 有较大针对性。但外源性ATP不易进入细胞，且与体内需要
7.2。 ②发酵培养 培养温度30℃，36h，投入腺嘌呤，加尿素、氢氧化钠和氨， 控制pH。通风量1：0.5v／(v· min)。 ③提取、精制 发酵液加热使酶失活后，调节pH3—3.5，过滤，分离除去 菌体，上清液通过769活性炭柱吸附，用氨醇溶液洗脱，洗脱液再用CL型阴离子交换树脂吸附ATP，经氯化钠—盐酸液洗脱．洗脱液经核酸类药物
核酸类药物 基本概况 核苷酸生产工艺 三磷酸腺苷生产工艺
2013-9-22
1
生物制药工艺学——核酸类药物 概 述
核酸类药物分为两类：一类为具有天然结构的核酸类物质, 这类药 物已广泛用于放射病、血小板减少症、白细胞减少症、慢性肝炎、心 血管疾病等，属于这一类的核酸类药物有ATP、辅酶A、脱氧核苷酸 等。第二类为天然结构碱基、核苷、核苷酸结构类似物或聚合物，这 类药物是当今人类治疗病毒、肿瘤、艾滋病的重要手段，也是产生干 扰素、免疫抑制的临床药物，主要有三氟胸苷、叠氮胸苷、阿糖腺苷 等。 反义核酸技术及反义药物：反义技术是用人工合成的或生物中自然存 在的寡聚核苷酸片断（反义DNA和反义RNA），结合目标基因或mRNA 特定序列(靶核酸)，从而有效地抑制或封闭基因的转录与翻译。 反义药物能与特定基因杂交，在基因水平干扰致病蛋白的产生过程， 即干扰遗传信息从核酸向蛋白质的传递。
2013-9-22 5
生物制药工艺学——核酸类药物
三磷酸腺苷生产工艺
三磷酸腺苷是体内广泛存在的辅酶，是体内组织细胞所需
能量的主要来源，蛋白质、脂肪、糖和核苷酸的合成都需 ATP参与。ATP经腺苷酸环化酶催化形成环磷酸腺苷(cAMP) ，是细胞内的生物活性物质，对细胞许多代谢过程有重要的 调节作用。 ATP为蛋白质、糖原、卵磷脂、尿素等的合成提供能量， 促使肝细胞修复和再生，增强肝细胞代谢活性，对治疗肝病 有较大针对性。但外源性ATP不易进入细胞，且与体内需要
7.2。 ②发酵培养 培养温度30℃，36h，投入腺嘌呤，加尿素、氢氧化钠和氨， 控制pH。通风量1：0.5v／(v· min)。 ③提取、精制 发酵液加热使酶失活后，调节pH3—3.5，过滤，分离除去 菌体，上清液通过769活性炭柱吸附，用氨醇溶液洗脱，洗脱液再用CL型阴离子交换树脂吸附ATP，经氯化钠—盐酸液洗脱．洗脱液经核酸类药物
核酸类药物分析
精品课件
用提取法从细胞或动物内脏制得，如核糖核 酸Ⅰ系由健康猪的肝脏提取制得。制备过程 中不可避免会带入一定的蛋白质，吸光度检 查即为了控制核酸类药物中蛋白质的含量。 具体方法是配制一定浓度的供试液，分别在 ２６０ｎｍ与２８０ｎｍ的波长处测定吸光 度，要求该吸光度比值应不得低于１.７。
纯ＲＮＡ在２６０ｎｍ和２８ 精品课件
差，凡戊糖均有此反应。
绿色 670nm
精品课件
（２）二苯胺反应
脱氧核糖核酸、脱氧核苷 酸或脱氧核苷与酸共热水解产生的脱氧核 糖在乙醛存在下与二苯胺反应，生成蓝色 化合物，在５９５ｎｍ波长处有最大吸收。
反应。
核糖核酸、核糖核苷酸无此
蓝色 595nm
精品课件
生的磷酸与过量 的钼酸铵［（ＮＨ４）３ＭｏＯ４］反应，生成磷钼
（１）水分在冰醋酸中呈碱性，可与高氯酸反应，所 以反应体系中不应有水分。
（２）由于所用溶剂———冰醋酸有挥发性且膨胀系 数较大，高氯酸滴定液的浓
度受温度和贮存条件影响很大。滴定时与标定时的温 度差对高氯酸滴定液浓度的
影响很大，一般温度差小于１０℃时，滴定液的浓度
精品课件
（３）冰醋酸溶剂的挥发、弱碱性杂质的存在都可能对测定 结果造成干扰，故该法必须进行空白校正，即不加供试品， 同法操作，所得结果应扣除空白。 （４）常用电位滴定法和指示剂法作为终点的指示方法，但 指示剂的终点颜色变化需用电位滴定法确定。
精品课件
１离子对色谱法
核苷酸类药物的磷酸基在反相高效液相色谱 条件下经常以离子化状态存在，保留很弱，不利于分离和 测定。
离子对高效液相色谱法可以有效改善核苷酸的 色谱保留，实现准确定量。
《中国药典》（２０１５年版） 收载的环磷腺苷、 三磷酸腺苷二钠和胞磷胆碱钠均采用离子对色谱法进行含 量测定。
用提取法从细胞或动物内脏制得，如核糖核 酸Ⅰ系由健康猪的肝脏提取制得。制备过程 中不可避免会带入一定的蛋白质，吸光度检 查即为了控制核酸类药物中蛋白质的含量。 具体方法是配制一定浓度的供试液，分别在 ２６０ｎｍ与２８０ｎｍ的波长处测定吸光 度，要求该吸光度比值应不得低于１.７。
纯ＲＮＡ在２６０ｎｍ和２８ 精品课件
差，凡戊糖均有此反应。
绿色 670nm
精品课件
（２）二苯胺反应
脱氧核糖核酸、脱氧核苷 酸或脱氧核苷与酸共热水解产生的脱氧核 糖在乙醛存在下与二苯胺反应，生成蓝色 化合物，在５９５ｎｍ波长处有最大吸收。
反应。
核糖核酸、核糖核苷酸无此
蓝色 595nm
精品课件
生的磷酸与过量 的钼酸铵［（ＮＨ４）３ＭｏＯ４］反应，生成磷钼
（１）水分在冰醋酸中呈碱性，可与高氯酸反应，所 以反应体系中不应有水分。
（２）由于所用溶剂———冰醋酸有挥发性且膨胀系 数较大，高氯酸滴定液的浓
度受温度和贮存条件影响很大。滴定时与标定时的温 度差对高氯酸滴定液浓度的
影响很大，一般温度差小于１０℃时，滴定液的浓度
精品课件
（３）冰醋酸溶剂的挥发、弱碱性杂质的存在都可能对测定 结果造成干扰，故该法必须进行空白校正，即不加供试品， 同法操作，所得结果应扣除空白。 （４）常用电位滴定法和指示剂法作为终点的指示方法，但 指示剂的终点颜色变化需用电位滴定法确定。
精品课件
１离子对色谱法
核苷酸类药物的磷酸基在反相高效液相色谱 条件下经常以离子化状态存在，保留很弱，不利于分离和 测定。
离子对高效液相色谱法可以有效改善核苷酸的 色谱保留，实现准确定量。
《中国药典》（２０１５年版） 收载的环磷腺苷、 三磷酸腺苷二钠和胞磷胆碱钠均采用离子对色谱法进行含 量测定。
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（二）发酵法生产核苷
在右边的合成途径中，嘌呤 核苷酸生物合成的第一个酶 PRPP转酰胺酶受AMP、 ADP、以及腺嘌呤衍生物的 强烈抑制而受鸟嘌呤衍生物 的抑制很弱。IMP脱氢酶受 最终产物GMP及鸟嘌呤衍生 物反馈抑制，SAMP合成酶 受AMP反馈抑制的。 枯草杆菌的腺嘌呤缺陷型， 当培养基中提供限量腺嘌呤 时就累积肌苷。 而枯草杆菌的腺嘌呤、黄嘌 呤缺陷型，当培养基中提供 限量鸟嘌呤时就累积腺苷。
（二）发酵法生产核苷酸
黄苷酸（XMP）是鸟苷酸（GMP）的前体产物， 可以通过累积黄苷酸（XMP），之后再用酶转化 法生产GMP。 菌种A：丧失GMP合成酶的鸟嘌呤缺陷型和腺嘌 呤缺陷型。
菌种B：5’-核苷酸分解力微弱，GMP合成酶活性 强. 控制A、B菌接种比例，混合培养，大量产生 XMP并高效转化成GMP。
核酸类药物分类－自然结构核酸类物质的类似物和 聚合物
它们是当今人类治疗病毒、肿瘤、艾滋病 的重要药物，也是产生干扰素、免疫抑制 的临床药物。 主要有叠氮胸苷、阿糖腺苷、阿糖胞苷、 聚肌胞等。
核酸类药物分类－自然结构核酸类物质的类似物和 聚合物
O HN O N CF 3 O HN N O CH3 O HN N O
• RNA 以 甲 酰 胺 化 学水解，树脂分离、 结晶，可制得4种
核苷。
（二）发酵法生产核苷
发酵法生产核苷是近代发酵工程领域中的杰出成
果，产率高，周期短，控制容易，产量大。
菌种：枯草芽孢杆菌或短小芽孢杆菌变异株，嘌
呤核苷分解活性低，而嘌呤核苷酸酶活性高。
枯草杆菌的嘌呤核苷酸合成途径。(参见吴梧桐主编，p337)
第十四章 核酸类药物
第一节 核酸类药物概述 第二节 天然核酸类物质的制取 第三节 核酸类结构改造药物的制备 1.叠氮胸苷（AZT） 2.阿糖腺苷 3.三氮唑核苷 4.阿糖胞苷 5.聚肌胞苷酸 (PolyI:C） 6.胞二磷胆碱
核酸类药物概述
在1869年，F. Mischer从细胞核中分离得到一种
①腺嘌呤缺陷型（A ）； ②GMP还原酶缺失（GMPred-）； ③磺胺脒抗性（SGr）； ④精氨酸缺陷型（Arg-）。 选育出从遗传上解除正常代谢控制的理想 菌株。肌苷产率达20g/L.
-
1．发酵法生产肌苷（I或Iou）
工艺要点： ①保证培养基有充足N源。 3②短小芽孢杆菌受PO4 的抑制。 ③Mg2+、Ca 对肌苷生产有促进作用。 ④提供的生长因子腺嘌呤或酵母粉必须亚 适量。 ⑤发酵条件，30～34℃，pH6.0～6.2，高 溶氧，低分压。
（二）发酵法生产核苷酸
IMP生成总反应过程
（二）发酵法生产核苷酸
AMP和GMP的生成
SAMP
①SAMP合成酶 ③IMP脱氢酶 ②SAMP裂解酶 ④GMP合成酶
（二）发酵法生产核苷酸
1．发酵法生产肌苷酸（IMP）
肌苷酸钠是一种高效增鲜剂，在谷氨酸钠 中添加2%，鲜度可以增加3倍。因此在味 精中添加肌苷酸钠后成为第二代特鲜味精。
酵母菌体收率高，易于提取RNA 。
可以从自然界筛选并可用诱变育种的方法提高酵母的 RNA含量。
（一）RNA的提取与制备
发酵法生产高含量RNA
酵母及其RNA提取工艺
流程见图12-8。
（一）RNA的提取与制备
3．用工业废水培养高含量RNA酵母
使用工业废水培养高含量RNA酵母减少环境污
染，降低粮食消耗，如味精生产废水中的成份基
第十四章 核酸类药物
第一节 核酸类药物概述 第二节 天然核酸类物质的制取 第三节 核酸类结构改造药物的制备
第十四章 核酸类药物
第一节 核酸类药物概述 1.核酸类药物概述 2.核酸类药物分类 第二节 天然核酸类物质的制取 第三节 核酸类结构改造药物的制备
第十四章 核酸类药物
第一节 核酸类药物概述 第二节 天然核酸类物质的制取 1.RNA与DNA的提取与制备 （一）RNA的提取与制备 （二）DNA的提取与制备 2.单核苷酸的制备 （一）酶解法 （二）发酵法生产核苷酸 （三）半合成法制备核苷酸 3.核苷的制备 （一）RNA化学水解法制备核苷 （二）发酵法生产核苷 第三节 核酸类结构改造药物的制备
核酸类药物分类－具有天然结构的核酸类物质
这些药物多数是生物体自身能够合成的物质，在
具有一定临床功能的前提下，毒副作用小，它们
的生产基本上都可以经微生物发酵或从生物资源
中提取。
ATP：用于心肌炎、心肌梗死、心力衰竭、及动脉或冠状动脉硬化、 肝炎等的治疗或辅助治疗。 肌苷：用于急慢性肝炎、肝硬化、白细胞减少、血小板减少等。
O
I HN 2
N N N
HO
HO O
O
HO
O
HO
O
OH 三氟代 胸 苷
N3 叠氮 胸 苷
OH 5'- 碘 脱氧 尿 苷
OH
OH OH 三 氮唑 核苷
OH
OH NH H2N N
OH
NH
N
N
NH HO HO N O
N N
N N O
NH H2N N
N N
H2N
N
O H
CH2OH CH2OH
HO
OH 无环鸟 苷
2+
2．发酵法生产鸟苷和黄苷（G，X）
鸟苷生产菌性状：以肌苷产生菌为出发菌株，再
纤维状DNA沉淀
（二）DNA的提取与制备
2．具有生物活性DNA的制备 可从动物内脏（肝、脾、胸腺）中提取制备，操作条件0～3℃。
动物内脏加4倍量生理盐水经组织捣碎机捣碎1分钟，匀浆于2500rpm离
心30分钟，沉淀用同样体积的生理盐水洗涤3次，每次洗涤后离心，将沉淀
悬浮于20倍量的冷生理盐水中，再捣碎3分钟，加入2倍量5％十二烷基磺酸 钠，并搅拌2～3小时，在0 ℃2500rpm离心，在上层液中加入等体积的冷乙 醇，离心即可得纤维状DNA，再用冷乙醇和丙酮洗涤，减压低温干燥得粗品 DNA。
酸性物质，即现在被称为核酸的物质。 1939年，E. Knapp等第一次用实验方法证实核酸 是生命遗传的基础物质。 核酸不仅携带有各种生物所特有的遗传信息而且 影响生物的蛋白质合成和脂肪、糖类的代谢。
核酸类药物概述
核酸是一种多聚体大分子，它的组成单元是核苷 酸，将核苷酸中的磷酸基团去掉，剩余部分称核 苷，核苷进一步分解可生成戊糖和碱基。
本上可供酵母生长。
（一）RNA的提取与制备
4.RNA提取实例
（二）DNA的提取与制备
DNA，可以促进细胞的活化，调节新陈代谢，延缓机 体衰老，维护正常免疫功能有积极的作用。
1．工业用DNA的提取 从冷冻鱼精中提取。鱼精中主要含有核蛋白、酶类以及多种微量元素。核 蛋白的主要成分是脱氧核糖核酸(DNA)和碱性蛋白质(鱼精蛋白)，其中DNA 占大约2／3。
（一）酶解法
1. 酶解法制备脱氧核苷酸，参见吴梧桐主编，p330
（一）酶解法
2. 酶解法制备戊糖核苷酸，参见吴梧桐主编，p331
（一）酶解法
3．双酶法生产肌苷酸和 鸟苷酸（I+G）。 呈味核苷酸的主要品种是 肌苷酸钠和鸟苷酸钠，商 品名称为（I+G），用核 酸酶P1降解RNA可获得 GMP和AMP，其中AMP 经脱氨生成IMP。 双酶法生产肌苷酸和鸟苷 酸的工艺流程
胰核酸酶
胰、肠核苷酸酶 核苷酶
核酸类药物概述
核酸类药物则正是在恢复它们的正常代谢或干扰 某些异常代谢中发挥作用的。
高尿酸血症：尿酸盐结晶沉积于关节、软组织、软骨及肾， 导致关节炎、尿路结石和肾脏疾病。 治疗：别嘌呤醇
核酸类药物概述
核苷及其衍生物干扰病毒DNA的合成，治疗病毒 疾病。 腺苷、肌苷、尿苷、核苷酸、脱氧核苷酸、双丁 酰环腺苷酸、胞二磷胆碱、核苷三磷酸等核酸组 分及衍生物，是天然的代谢激活剂，有助于改善 机体的物质代谢和能量代谢，加速受损组织的修 复。临床广泛用于放射病、血小板减少、急慢性 肝炎、血细胞减少、心血管疾病等。 辅酶A是调节糖、脂肪及蛋白质代谢的重要因子 ，用于治疗动脉硬化、脂肪肝、各种肝炎等。
(1)产氨短杆菌嘌呤核苷酸生物合成途径， 代谢调控和肌苷酸发酵机制。（参见吴梧桐主编，
p333）
（二）发酵法生产核苷酸
（二）发酵法生产核苷酸
对5 ’ -IMP的生物合成来说，关键的酶是PRPP转
酰胺酶，利用产氨短杆菌直接发酵法生产肌苷酸 的关键：
①使用腺嘌呤缺陷型菌株。
②提供亚适量腺嘌呤从而解除了对PRPP转酰胺
O OH
丙氧 鸟 苷
OH 阿糖腺苷
双 脱氧 肌 苷
它们大部分通过由自然结构的核酸类物质进行半合成为结 构改造物，或者采用化学一酶合成法。
珍奥核酸究竟是什么？
是从动植物组织中提取的核酸类物质，并不 一定含有上述核酸类药物。因而珍奥核酸是一种保 健品，服用珍奥核酸起不到上述治疗作用，保健 品也不应作为药物使用。
酶的活性影响。
③选育Mn 不敏感性变异株
2+
④菌本身的5 ' -核苷酸降解酶活力低
（二）发酵法生产核苷酸
2.发酵法生产黄苷酸（XMP）及酶法转化成鸟苷
酸（GMP）。 鸟苷酸钠是比肌苷酸钠更强的增鲜剂，它还 是三氮唑核苷和无环鸟嘌呤的原料，因此在食品 工业和制药行业中需求量很大。 然而直接发酵生产GMP产量很低， 由于发酵法生产核苷的产率很高，因此可由发酵 法生产核苷后经提取，精制再经磷酸化制取核苷 酸。 方法：将核苷悬浮于磷酸三甲酯或磷酸三乙酯中， 在冷却条件下加入氯化氧磷，进行磷酸化。从核 苷生成5‘-核苷酸收率可达90%。
肌苷，悬浮于磷酸三乙酯中 氯化氧磷 0℃ 肌苷酸（IMP）
（一）RNA的提取与制备
1. RNA的工业来源 从微生物中提取RNA，是工业上最实际和有效的方法， 一些最常见的菌体含有丰富的核酸资源。通常在细菌中 RNA占5％-25％，在酵母中占2.7％～15％，在霉菌中占 0.7%~28%, 面包酵母含RNA4.1％～7.2％。 2. 高RNA含量酵母菌体的筛选