新生隐球菌总RNA抽提方法的实验研究

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[精品]实验一、RNA提取及检测

五、总RNA提取常见问题分析 RNA降解
1、外源RNA酶的污染：试剂，器械及实验环境中的RNA酶进入实验系统。 2、内源RNA酶的污染：抑制剂失效或者用量不够，实验样品过多；匀浆时温度过高。 3、外源性污染也可以排除，那么降解几乎都来自裂解液的用量不足。如果将裂解液直接加入培养皿中裂解细胞，一定要使裂解液能覆盖住细胞。在液氮条件下将组织研碎，并且匀浆时使用更多裂解液。样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后移至-70℃冰箱保存。样品决不能未经液氮速冻而直接保存于-70℃冰箱中。样品在与裂解液充分接触前决不能出现融化，所以研磨用具必须预冷。
电泳检测RNA质量：
（1）配制1.2%的琼脂糖凝胶（20mL）
称取琼脂糖0.24 g，加DEPC处理的ddH2O 12.04 mL，5×RNA 电泳缓冲液4 mL，电炉加热融化琼脂糖，冷却至55°C10 μ L，甲醛1.5 μ L，10× RNA Buffer 2 μ L，RNA (2～4 μ g, <10 μ L)混合液，65°C加热15min，迅速在冰浴中冷却片刻，然后加入3 μ L RNA 加样缓冲液和0.5 μ L EB，上样电泳。电泳Buffer 为1× RNA buffer。
样品量过少，则细胞组织中RNA含量较低；样品量过多则可能超过裂解液的裂解能力，裂解将不完全，从而导致RNA得率低。
六、注意事项：
1．所有实验过程均须避免Rnase的污染。 2．要避免沉淀完全干燥，否则RNA难以溶解。3.样品量和 Trizol的加入量一定要按步骤（1）的比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致 RNA降解。
（2）RNA电泳结果判别质量：出现的电泳条带有两条，是两条最大的核糖体RNA（rRNA）分子，即18S 和28S rRNA，较小的RNA也很丰富但看不到，因为太小，跑出了凝胶的边界。多数细胞中的信使RNA（mRNA）经EB 染色后不足以形成可见的带。只要18S 和28SrRNA带亮，且28S rRNA大约为18S rRNA 的两倍，说明提取的RNA没有发生降解，纯度好。

新生隐球菌DNA快速提取及通用PCR方法的应用研究

新生隐球菌DNA快速提取及通用PCR方法的应用研究发表时间：2017-02-07T14:18:48.723Z 来源：《医药前沿》2016年12月第36期作者：陈玉如[导读] 隐球菌（Cryptococcus）是属于担子菌门的酵母菌，为重要的临床致病真菌。

（贵州省贵阳市公共卫生救治中心检验科贵州贵阳 550000）【摘要】目的：验证一套快速提取新生隐球菌DNA的方法及通用的PCR反应体系的应用。

方法：使用1% SDS和0.2mol/L醋酸锂为裂解液的方法提取21株分离自环境或临床的新生隐球菌DNA，选取7个隐球菌常用基因和6个未知功能的基因设计特异性引物并进行PCR，获得的产物经电泳验证后进一步测序分析。

结果：该DNA提取方法简便快速，同时提取21株新生隐球菌的DNA仅需30min，用于后续通用PCR反应体系中均能一次性扩增出目的条带，且反应稳定，特异性强，双向测序符合率在99.9%以上。

结论：本文建立了一种快速高效的新生隐球菌基因提取方法，该PCR反应体系可通用于新生隐球菌各基因的扩增。

【关键词】新生隐球菌；PCR；DNA【中图分类号】R446.61 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）36-0207-02 隐球菌（Cryptococcus）是属于担子菌门的酵母菌，为重要的临床致病真菌。

随着分子生物学、基因组学等技术日益渗透到隐球菌研究领域，应用于新生隐球菌的技术方法也越来越多。

其中，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）作为一项基本的DNA扩增技术，被广泛应用于基因测序、克隆、多态性分析与疾病诊断等基础研究和临床检测的各方面。

由于其应用范围广且作为实验研究的前期基础操作，因此要求扩增的方法能在尽量简便和易于标准化操作的前提下实现最大的特异性和敏感度。

然而，传统的扩增方法常常需要根据每个DNA扩增片段的长度和特异引物的GC含量及Tm值反复试验，才能摸索出扩增效果最佳的条件，这样不仅费时费力，更不便于所得数据的交叉对比分析。

提取rna实验步骤

提取rna实验步骤嘿，咱今儿个就来聊聊提取 RNA 的那些事儿！这可真是个精细活儿呢！你得先准备好各种家伙什儿，离心管啦、移液枪啦，就像战士上战场得有称手的兵器一样。

然后呢，把你要研究的样本弄到手，这就好比是找到战斗的目标。

接下来，开始破碎细胞。

你就想象成是给细胞来个“大拆迁”，把它们的外壳啥的都给弄破，让里面的 RNA 能跑出来。

这一步可得小心点儿，别太粗暴了，不然 RNA 也会被你不小心弄伤的哟！然后，加入各种试剂，就像是给 RNA 搭个小窝，让它们能舒舒服服地待着。

这里面的门道可多啦，每种试剂都有它的作用，就像不同的调料能做出不同味道的菜一样。

再之后就是离心啦！这就像是把好的和坏的分离开来，让 RNA 能聚集到一块儿。

离心的时候那机器嗡嗡响，就好像在说：“嘿，我在努力工作呢！”经过一番折腾，你就能看到那一点点珍贵的 RNA 沉淀啦！这就像是在一堆沙子里找到了金子，那叫一个高兴啊！提取 RNA 可不比做饭简单多少啊，每一步都得仔仔细细的，稍有差错可能就前功尽弃啦！你想想，要是好不容易做到最后发现 RNA 没了，那得多郁闷呀！所以呀，做这个实验的时候得打起十二分的精神。

这实验就像是一场冒险，你得小心翼翼地前进，遇到问题就得想办法解决。

就好像你在森林里迷路了，得靠着自己的智慧和勇气找到出路。

而且，这可不是一次就能成功的事儿，有时候得反复尝试好多次呢！咱再说说这 RNA 啊，它可重要啦！它就像是生命的密码，藏着好多好多的秘密。

通过提取它，我们就能解开这些秘密，了解生命的奥秘。

这多神奇呀！总之呢，提取 RNA 实验是个既有趣又有挑战性的事儿。

它需要你的耐心和细心，也需要你对科学的热爱和执着。

如果你能做好这个实验，那你可就是个小科学家啦！加油吧，朋友们，去探索 RNA 的奇妙世界吧！。

隐球菌病处理临床实践指南 2010年美国感染病学会更新

中国感染与化疗杂志２０１０年５月２０日第１０卷第３期ＣｈｉｎＪＩｎｆｅｃｔＣｈｅｍｏｔｈｅｒ，Ｍａｙ．２０１０，Ｖ０１．１０，Ｎｏ．３１６５处，不常规推荐（Ａ一Ⅲ）。

乙酰唑胺和皮质类固醇（除非ＩＲＩＳ）应避免用于控制颅内压力（Ａ一Ⅱ）。

（２Ｅ）症状和体征再发症状和体征再发，重新开始引流（ＢⅡ）。

再发的患者，治疗２周后进行腰椎穿刺测定脑脊液压力，以评价病情（昏ｍ）。

（六）长期脑脊液压力升高如果频繁腰椎穿刺引流，脑脊液压力仍持续升高，或症状持续存在，考虑ＶＰ分流术（Ａ一Ⅱ）。

（七）ＩＲＩＳ没有必要改变抗真菌治疗（Ｂ－１１１）轻度的ＩＲＩＳ可以在数天或数周内自愈，无需特殊处理（Ｂ－１１Ｉ）。

治疗主要并发症，如中枢炎症反应致脑脊液压力升高，可考虑使用皮质类固醇（相当于泼尼松０．５～１．０ｍｇ·ｋｇ叫·ｄ叫），对于中枢神经系统症状和体征严重的患者，可以使用更高剂量的地塞米松。

根据经验决定激素的疗程并逐渐减量，一般为２～６周，但需要个体化。

同时给予抗真菌治疗（１３－ｍ）。

非皮质类固醇抗炎药物和沙利度胺也有使用，但经验太少无法做出推荐（Ｃ－Ⅲ）。

（八）大脑隐球菌球ＡｍＢｄ（０．７～１ｍｇ·ｋｇ。

１·ｄ～，静脉滴注），ＡｍＢ脂质体（３～４ｍｇ·ｋｇ。

１·ｄ～，静脉滴注），或ＡＢＬＣ（５ｍｇ·ｋｇ叫·ｄ～，静脉滴注）联合氟胞嘧啶（１００ｍｇ·ｋｇ叫·ｄ～，分４次口服）治疗至少６周（Ｂ－Ⅲ）。

氟康唑巩固和维持治疗（４００～８００ｍｇ／ｄ，口服）治疗６～１８个月（Ｂ－１１１）。

辅助治疗包括：①皮质类固醇治疗占位效应及水肿（Ｂ－Ⅲ）。

②外科治疗：大的病灶（≥３ｃｍ），可能存在占位效应，需开颅或立体定向治疗减负或（和）完全去除病灶；ＩＲＩＳ不能解释病灶变大，应进一步组织活检，明确诊断（ＢⅡ）。

三、非中枢神经系统隐球菌病的治疗推荐（表５）（一）肺部感染（免疫抑制患者）免疫抑制患者肺部隐球菌病，需作腰椎穿刺以除外脑膜炎。

rna提取一般步骤总结

RNA提取一般步骤总结RNA提取原理：| 通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。

但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。

RNA提取的一般步骤所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。

但其中最关键的是抑制RNA酶活性。

RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径:提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA 与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。

第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。

实验步骤：破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA。

1、破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。

2、分离RNA一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。

3、沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或异丙醇。

4、洗涤RNA使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。

5、融解RNA一般使用TE。

6、保存RNA应该尽量低温。

为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。

从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。

另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。

总rna提取实验实施方案

总rna提取实验实施方案总RNA提取实验实施方案。

一、实验目的。

总RNA提取是分子生物学研究中的重要步骤，其目的是从样本中提取出完整的总RNA，以便后续进行RNA定量、转录组分析等实验。

本实施方案旨在介绍一种简便、高效的总RNA提取方法，以满足科研工作者的实验需求。

二、实验材料。

1. 细胞或组织样本。

2. TRIzol试剂。

3. 氯仿。

4. 异丙醇。

5. 75% 乙醇。

6. DEPC水。

7. RNase-free 离心管。

8. 离心管架。

9. 离心机。

10. 磁力搅拌器。

11. 离心管枪。

12. 紫外可见分光光度计。

13. 微量吸光度计。

三、实验步骤。

1. 样本的收集和处理。

a. 采集细胞或组织样本，迅速转移到含有适量TRIzol试剂的离心管中。

b. 使用离心管架和离心机将样本在室温下离心10分钟，以沉淀细胞或组织。

2. 细胞或组织的裂解。

a. 将裂解后的样本加入氯仿，摇匀离心管，置于室温静置5分钟。

b. 离心管在室温下以12000×g离心15分钟，将上清液转移到新的离心管中。

3. RNA的沉淀和洗涤。

a. 加入等体积的异丙醇，轻轻摇匀，放置室温10分钟。

b. 离心管在室温下以12000×g离心10分钟，将上清液倒掉。

c. 加入75%乙醇洗涤RNA沉淀，离心管在室温下以7500×g离心5分钟，将上清液倒掉。

d. 使用DEPC水溶解RNA，测定浓度和纯度。

四、实验注意事项。

1. 操作过程中需严格避免RNase的污染，使用RNase-free试剂和消耗品。

2. 操作过程中需注意样本的保存和处理，避免RNA降解。

3. 实验过程中需严格按照试剂说明书和操作规程进行操作，确保实验可重复性和结果的准确性。

五、实验结果分析。

通过上述实验方案提取的总RNA样品，可以进行后续的RNA定量、cDNA合成、转录组分析等实验。

同时，可以通过紫外可见分光光度计和微量吸光度计对RNA样品的浓度和纯度进行检测，以保证后续实验的顺利进行。

RNA提取的实验步骤及结果剖析

RNA提取的实验步骤及结果剖析本文详细介绍RNA提取前的实验准备、RNA提取的详细实验步骤，以及对RNA提取结果的剖析。

希望可以大家在做克隆和荧光定量时有所帮助！注意:RNA提取也做到无菌操作的水平！ⅠTrizol法实验原理Trizol内含异硫氰酸胍能迅速破碎细胞，同时使核蛋白复合体中的蛋白变性并释放出核酸；由于释放出的DNA和RNA在特定pH值下的溶解度不同，且分别位于中间相和水相，从而使DNA和RNA得到分离；取出水相后，通过有机溶剂(氯仿)抽提及异丙醇沉淀，可得到纯净RNA。

预备实验1.DEPC简介DEPC是一种潜在的致癌物质，主要是能生成乙酯基衍生物和乙酯类衍生物，其中尿烷是一种已知的致癌物质。

DEPC有刺激性，对眼睛和气道粘膜有强刺激，在操作中应尽量在通风的条件下进行，DEPC毒性并不是很强，但吸入的毒性是最强的，使用时戴口罩，不小心占到手上注意立即冲洗。

由于DEPC是一种酯类，较难溶于水，故通过加热搅拌的方式来使其溶解。

2.1%的DEPC水的制备（1L）取1mlDEPC于999ml去离子水中，37℃在磁力搅拌器上搅拌4h 以上使其溶解。

此溶液即1%DEPC水。

注意：①DEPC与水反应后会产生大量的气体，可用塑料膜将瓶口扎紧，剧烈混匀后通过观察塑料膜是否胀气来判断反应是否充分②DEPC水的量可以根据需要配制即可，原则上确保所有的物品都能浸在DEPC水中。

③制备的1%DEPC水，应留下100ml左右并装入100ml左右的试剂瓶中，以备溶解RNA用。

注意：根据试剂瓶的大小调节所留的DEPC水的量，原则是确保DEPC水能够充满整个试剂瓶，并且盛有DEPC水的试剂瓶也要放置过夜，然后高温高压灭菌使DEPC分解后才能用于溶解RNA。

④配制DEPC处理水时用棕色瓶。

3.离心管、各种大小的枪头（1000ul、200/100ul、10ul）根据步骤及提取的量计算所需的个数，然后用制好的1%DEPC浸泡比计算数目略多的过夜处理。

rna提取实验步骤

RNA提取实验步骤如下：
●匀浆处理：
●组织：将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆
仪进行匀浆处理。

●单层培养细胞：直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积（即
3.5cm直径的培养板）加1ml，用移液器吸打几次。

●细胞悬液：离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107
细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。

加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。

一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。

将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。

每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

2-8℃10000×g离心15分钟。

收集上清液。

使用酒精洗涤RNA，以去除离心管内残留的试剂和盐。

最后利用2-甲基硫氰酸盐（MECT）溶液进行脱水，使RNA干燥而不影响RNA的完整性。

此外，如果是从动物组织中提取RNA，还需要使用DNase I处理RNA，以去除残留的DNA。

如果是从细菌中提取RNA，需要先进行细菌的裂解和细胞壁的破碎。

同时需要注意，整个提取过程需要严格控制RNA酶的污染。

植物总rna的提取实验报告（共4篇）

植物总rna的提取实验报告(共4篇) 植物总RNA的提取实验植物总RNA 的提取RNA 的制备与分析对于了解基因在转录水平上的表达与调节和cDNA 的合成都是必须的，RNA 的纯度和完整性对于Northern blot，RT-PCR 和cDNA 文库的构建等分子生物学实验都至关重要。

RNA 分离的方法很多，最关键的因素是尽量减少RNA 酶的污染。

本实验采用异硫氰酸胍(GTC)和β-巯基乙醇等抑制RNA 酶利用GTC 和N-十二烷基肌氨酸钠将促使核蛋白复合体解离，使RNA 与蛋白质分离,并将RNA 释放到溶液中, 用乙醇沉淀方法分离RNA。

本实验从番茄幼苗中提取总RNA 的提取，掌握Trizol 提取的方法和步骤。

一材料与方法1. 植物组织设备番茄（Lycopersiconesculentum）幼苗为材料，利用移液器，冷冻高速离心机，低温冰箱，台式高速离心机，液氮罐，陶瓷研钵，1.5ml 离心管等设备。

2. 试剂本实验中所有试剂均用无RNA 酶灭菌水，用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃ 2 小时）装蒸馏水，然后加入0.01%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌而得到。

75%乙醇，氯仿:异戊醇(24 : 1 by volume) 或氯仿，异丙醇、无水乙醇、70％乙醇，Trizol 试剂等试剂由分子生物学实验室提供。

3. 实验方法1. 50-100mg 组织在液N 中磨成粉末后，加入1ml Trizol 液，注意样品总体积不能超过所用Trizol 体积的10%。

2. 研磨液室温放置5 分钟，然后以每1mlTrizol 液加入0.2ml 的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15 秒。

3. 取上层水相于一新的离心管，加入等体积异丙醇，室温放置10 分钟，10000r/min 离心10 分钟。

4.弃去上清液，按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入70%乙醇，涡旋混匀，4℃下10000r/min 离心5 分钟。

RNA提取实验流程

RNA提取实验方法流程总RNA（total RNA）和信使RNA(mRNA)的抽提（自己的总结）1、实验目的提取人体细胞的总RNA和mRNA。

2、本实验所需试剂1）、CNE-2细胞及培养细胞的一系列条件，2）、PBS缓冲液，TRIZOL试剂，3）、DEPC处理过的水、大、中、小Tip及1.5 ml EP管,4）、新的氯仿、异丙醇和乙醇，5）、mRNA分离试剂盒：Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN。

6）、新配的电泳缓冲液，专跑RNA的琼脂糖（Agarose）。

3、实验流程(掌握内容)3.1 细胞总RNA的提取1）、6孔板细胞（CNE-2）汇合度为90-100%时，取出无菌室，去其上清，用PBS洗两次后，每孔加TRI ZOL试剂（Gibco公司）1 ml，摇匀，无菌罩内消化3-5分钟（观察：液体变粘稠，细胞脱壁）。

2）、将各孔内消化好的细胞裂解液吸到一DEPC处理过的1.5 ml EP管中，加新开的氯仿0.2 ml，轻摇1 5秒。

3）、室温静置2-3分钟后，12000 rpm，15 min，4℃，离心。

然后取上清无色水相（约0.6 ml）到EP管（DEPC处理过），加0.5 ml新开的异丙醇，室温下静置10分钟。

4）、12000 rpm，10分钟，4℃，离心。

观察总RNA在管底的白色沉淀，弃去上清（小心别丢了沉淀），75%乙醇1.0 ml洗涤（用DEPC水新配制）后，7500 rpm，5 min，4℃离心。

5）、去上清，点离，用小Tip吸干液体。

气干沉淀5-10分钟，DEPC处理水20-30 ul加入，中枪打匀，5 5-60℃水浴10分钟溶解总RNA，测OD值。

6）、电泳。

3.2 从总RNA中分离mRNA（Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN）1）、取上述提取的总RNA若干（少于0.25 mg）到一个新的无RNase 的EP管中，用无RNase的水定容到250 ul。

实验一RNA提取方法及原理

实验一RNA提取方法及原理RNA提取是从生物样本中提取RNA分子的一系列操作过程，其中包括细胞破碎、RNA与其他分子的分离和纯化。

RNA提取可用于研究基因表达、编码RNA功能等生物学研究领域。

一、RNA提取方法1.直接方法直接法是一种快速且简单的RNA提取方法，适用于较小的样本。

该方法不需要扩增RNA，并且避免了DNA污染。

主要步骤包括细胞破碎、蛋白质沉淀、RNA沉淀和洗涤。

直接方法可用于提取总RNA或其中一种特定类型的RNA（如mRNA）。

2.两步法两步法是RNA提取的常用方法之一，适用于大多数样本。

首先使用各种方法破碎细胞，使RNA释放出来。

然后通过蛋白质沉淀、RNA沉淀和洗涤来纯化RNA。

两步法具有更好的RNA纯度和更高的产量。

3.树脂结合法树脂结合法是一种通过RNA与树脂结合来纯化RNA的方法。

树脂有很强的亲和力，可以选择性地结合RNA。

树脂结合法适用于小样本量或从混合样本中纯化特定RNA的情况。

4.直接PCR法直接PCR法是一种将RNA直接用于PCR扩增的方法。

它通过添加DNA合成酶和逆转录酶，将RNA转录成cDNA，并立即进行PCR扩增。

二、RNA提取原理RNA提取的原理是利用物理和化学方法破坏细胞膜，使RNA释放出来，然后通过沉淀和洗涤来纯化RNA。

细胞破碎：细胞破碎的方法有多种选择，包括机械破碎、酶解和化学破碎等。

机械破碎可通过震荡或高压细胞破碎仪实现。

酶解法是利用酶消化细胞膜，促进RNA的释放。

化学破碎是利用化学物质，如氯仿、酚和乙酸酐等。

蛋白质沉淀：加入蛋白质沉淀剂（如酒精或异丙醇）可使蛋白质沉淀而RNA在上清液中。

RNA沉淀：加入RNA沉淀剂，通过离心将RNA从上清液中沉淀下来。

RNA沉淀后，上清液中的DNA和蛋白质会被除去。

洗涤：通过加入酒精或异丙醇溶液洗涤RNA，除去残留的污染物，如盐和酚。

在RNA提取过程中，需要注意一些关键点，以确保提取到高质量的RNA。

例如，实验过程中需注意酶和核酸酶的污染，使用无核酸酶的试剂和工具。

RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南

RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南准备试剂：氯仿，异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水或0.5℅SDS（溶液均需用DEPC处理过的水配制）。

操作步骤：1. 匀浆处理a. 植物组织:以叶片RNA提取为例.取新鲜叶片在液氮中充分研磨或将叶片剪碎后直接在Trizol中研磨,研磨要迅速,最好不要超过1min.，大约100mg 叶片使用1 ml Trizol.b. 动物组织:以鼠肝脏RNA提取为例.取新鲜或-70℃冻存组织,每50-100mg组织加1ml Trizol,用匀浆仪进行匀浆处理.样品体积一般不要超过Trizol体积的10%.c. 单层培养细胞.直接在培养板中加入Trizol裂解细胞,每10cm2面积加1ml Trizol.用取样器吹打几次.注意:Trizol加量根据培养板面积决定,不是由细胞数决定.如果Trizol加量不足,可能导致提取的RNA中有DNA污染.d.细胞悬液:离心取细胞，每5-10×106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml Trizol。

加Trizol 前不要洗涤细胞，以免降解mRNA。

一些酵母和细菌细胞可能需要匀浆仪处理。

e.血液处理:直接取新鲜的血液,加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10min，10 000rpm 离心1min。

弃上清，收集白细胞沉淀。

每1ml血液收集的白细胞沉淀中加入1ml Trizol。

2. 将匀浆样品在15-30℃放置5mim，使得核酸蛋白复合物完全分离。

3. 可选步骤:4 ℃10 000rpm离心10min，取上清。

如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。

离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。

处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。

取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。

4. 每使用1ml Trizol加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s，室温放置3min。

新型隐球菌实验报告注意

一、实验目的本次实验旨在了解新型隐球菌的生物学特性，包括菌落特征、培养特性、形态学特征等，为新型隐球菌的鉴定、诊断和治疗提供实验依据。

二、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）新型隐球菌菌种：由实验室提供。

（2）实验培养基：沙保氏培养基、血琼脂培养基。

（3）实验试剂：墨汁、生理盐水、乳酸酚棉蓝染色液等。

2. 实验仪器：（1）恒温培养箱。

（2）显微镜。

（3）离心机。

（4）高压蒸汽灭菌器。

三、实验方法1. 菌落培养（1）将新型隐球菌菌种接种于沙保氏培养基和血琼脂培养基。

（2）将接种好的培养基置于37℃恒温培养箱中培养。

（3）观察菌落生长情况，记录菌落特征。

2. 形态学观察（1）将培养好的菌落用生理盐水洗下，制成悬液。

（2）取少量悬液滴于载玻片上，用墨汁染色。

（3）在显微镜下观察菌体形态、大小、出芽情况等。

3. 分离纯化（1）将新型隐球菌菌落接种于沙保氏培养基和血琼脂培养基。

（2）将接种好的培养基置于37℃恒温培养箱中培养。

（3）观察菌落生长情况，挑取单菌落进行纯化。

4. 病原学检测（1）将纯化后的菌种接种于沙保氏培养基和血琼脂培养基。

（2）观察菌落生长情况，记录菌落特征。

（3）将培养好的菌落用生理盐水洗下，制成悬液。

（4）取少量悬液滴于载玻片上，用乳酸酚棉蓝染色液染色。

（5）在显微镜下观察菌体形态、大小、出芽情况等。

四、实验结果1. 菌落培养（1）沙保氏培养基：菌落呈白色、圆形、湿润、表面光滑，边缘整齐。

（2）血琼脂培养基：菌落呈白色、圆形、湿润、表面光滑，边缘整齐。

2. 形态学观察（1）菌体呈球形，直径5-20μm，出芽繁殖，不形成假菌丝。

（2）菌体周围有肥厚的荚膜，折光性强，一般染料不易着色。

3. 分离纯化（1）沙保氏培养基：菌落呈白色、圆形、湿润、表面光滑，边缘整齐。

（2）血琼脂培养基：菌落呈白色、圆形、湿润、表面光滑，边缘整齐。

4. 病原学检测（1）菌体呈球形，直径5-20μm，出芽繁殖，不形成假菌丝。

RNA提取实验方案

RNA提取实验方案1.所需试剂和设备-细胞样品（细菌、真核细胞等）- RNA提取试剂盒（例如TRIzol）- RNase去除剂（例如RNase A）-乙醇或异丙醇-游离亚硫酸-蒸馏水-离心机-定量和质量测量设备（例如紫外-可见光分光光度计）-冰桶和冷冻离心管2.操作步骤A.细胞样品处理和收集1.根据实验需求选择适当的生长培养基和条件培养细胞。

2.在适当的培养条件下培养细胞样品直到其数量达到目标水平。

3.将细胞样品收集到冷冻离心管中，通过离心将细胞沉淀于离心管底部。

B.细胞裂解和RNA分离4. 在冷冻离心管中加入适量的RNA提取试剂盒（例如TRIzol），按照试剂盒说明书中的比例加入。

5.快速颠倒离心管，混合细胞样品和试剂，使样品充分裂解。

6.在室温下静置5-10分钟，促使RNA与试剂发生充分结合。

7. 加入适量的RNase去除剂，按照试剂盒说明书中的比例加入。

8.快速颠倒离心管，继续混合样品。

9. 在室温下静置10分钟，使RNase去除剂与RNA结合。

C.RNA沉淀10.加入等体积的冷异丙醇或乙醇，混合样品。

11.在室温下静置10分钟，使RNA沉淀。

13.小心倒掉上清液，避免损失沉淀的RNA。

15.重复洗涤步骤一次。

D.RNA溶解和保存16.用适量的蒸馏水溶解RNA沉淀，使其完全溶解。

17.使用紫外-可见光分光光度计定量和质量测量RNA的浓度和纯度。

18.根据实验需求将RNA保存在合适的条件下（例如冷冻保存）。

3.注意事项- 在整个过程中要注意RNA的RNase污染，使用经RNase去除的试剂和消毒实验器具以避免污染。

-在RNA提取过程中要注意细胞样品的处理和保存，避免样品质量下降。

-每个步骤中的试剂和设备要根据实验室的具体情况进行选择和调整。

-在浓度和纯度测量RNA时要严格按照设备和试剂的操作要求进行操作。

这份RNA提取实验方案提供了一个通用的操作步骤，以便科研人员从细胞样品中提取RNA。

根据实验需求，可以对方案进行修改和调整，以获得更好的提取效果。

新型隐球菌实训报告万能

一、引言新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）是一种常见的真菌，广泛存在于自然界中，尤其在鸽粪、土壤和鸟类羽毛中。

作为一种机会性致病菌，新型隐球菌主要感染免疫抑制的患者，如艾滋病患者、器官移植受体和长期使用免疫抑制药物的患者。

本次实训旨在通过对新型隐球菌的实验室培养、形态观察、鉴定方法及感染机制的研究，加深我们对这一病原体的认识，提高我们对真菌性脑膜炎等疾病诊断和治疗的能力。

二、实训目的1. 掌握新型隐球菌的实验室培养技术。

2. 学习新型隐球菌的形态学观察和鉴定方法。

3. 了解新型隐球菌的感染机制和致病特点。

4. 提高对真菌性脑膜炎等疾病的诊断和治疗水平。

三、实训内容1. 新型隐球菌的培养实训中，我们首先学习了新型隐球菌的培养方法。

在无菌条件下，将新型隐球菌接种于沙堡弱培养基上，置于25℃培养箱中培养。

经过24-48小时，观察到菌落呈白色、奶油状，表面光滑，边缘整齐。

2. 新型隐球菌的形态学观察使用显微镜观察新型隐球菌的形态，发现其呈圆形或卵圆形，直径约为5-20微米，具有宽厚的荚膜。

在荚膜外，可见一薄层细胞壁，细胞内含有大量核质颗粒。

3. 新型隐球菌的鉴定为了进一步鉴定新型隐球菌，我们采用了多种方法：（1）印度墨汁染色：将新型隐球菌涂片，滴加印度墨汁，加盖玻片，显微镜下观察。

结果显示，新型隐球菌呈红色，荚膜呈黑色，具有典型的隐球菌特征。

（2）乳糖发酵试验：将新型隐球菌接种于乳糖发酵培养基上，置于37℃培养箱中培养。

结果显示，新型隐球菌不发酵乳糖。

（3）脲酶试验：将新型隐球菌接种于脲酶试验培养基上，置于37℃培养箱中培养。

结果显示，新型隐球菌产生脲酶，使培养基呈紫色。

4. 新型隐球菌的感染机制新型隐球菌主要通过呼吸道侵入人体，在肺部引起感染。

随后，病原菌可通过血液循环进入中枢神经系统，引起真菌性脑膜炎。

在感染过程中，新型隐球菌的荚膜具有抗吞噬作用，使其在宿主体内存活和繁殖。

新生隐球菌线粒体的快速抽提和电镜观察

ＫｅｏｄＣｒｐｔｃｃｕ０ｙｗｒｓ：ｙｏｏｃｓ』
；ｔｃｏｄｉ）ｍｉｈｎｒａＤＮＡ；ｔａｔｕｔｒｏｕｔｓｒｃｕｅｒ
线粒体（ｉｃｏｄｉ）一种具有半自主性的细胞器，ｍｔｈｎｒ是ｏａ有着自身独特的遗传系统，细胞棱Ｄ与ＮＡ不同的是，粒体线ＤＮＡ（ｔＮ具有母系遗传特征，线粒体基因组与棱基ｍＤＡ）且
隐球菌线粒体，后从经Ｄｓｌ理的线粒体制备液中分离纯化线粒体ＤＮＡｐ对差速离心中所获得的苗体、然Ｎａｅ处并原生质体ｌ线粒体三部分沉淀进行了透射电镜观察，结果均证明了我们所抽提的ＤＮＡ是纯净的，用于酶切分析和适ＰＲ分析研究，此成功地建立了快速有效分离和纯化线粒体ＤＣ由ＮＡ的方法。美蕾词：生隐球菌｝粒体；ＮＡ；微结构新线Ｄ超中围分类号：９ — ３ｑ３３文献标识码：Ａ文章编号：２３７２２０）１０Ｏ００５ —０７（０２Ｏ —０６一３
ＲａｉｘｒｃｉｎｏＤＮＡｆｏＣｙｔｃｃｕｅｆｒｎｐｄＥｔａｔｆＭｔｏｒｍｒｐｏｏｃｓｏｏｍａｓｎ
ａｄＥｘｍｉｅｙＥｌｃｒｎｃＭｉｒｓｏｎａｎｄｂｅｔｏｉｃｏｃｐｙ
ＡｂｔａｔＣｒｐｏｏｃｓｓｒｃ｛ｙｔｃｃｕ ∞ ， Ⅲ ５Ｄｍａｅｇｏｏｔｅｅｐｎｎｉｌｐａｅａｅｂｏｅｙａｃｍｂｎｔｎｏ — ｙｂｒｗｎｔｈｘｏｅｔｈｓ，ｔｒｋｎｂｏｉａｉｆＮｏａｏ

一种快速提取新生隐球菌及其他酵母样真菌DNA方法

ｏｔｈｅｒｙｅａｓｔ — ｌｉｋｅｆｕｎｇｉ．ＴｈｅｎｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｅｄＤＮＡｗａｓｖｅｒｉｆｉｅｄｔｈｒｏｕｇｈＰＣＲｗｉｔｈｓｐｅｃｉｆｉｃ＂ｐｒｉｍｅｒｓ，ａｒｉｄｃｏｎｆｉ＊ｔｒｉｅｄｂｙｒｅ —
增检测特异性酵母样真菌。结论该方法可以用于提取新生隐球菌及其他酵母样真菌。
【关键词】新生隐球菌；酵母样真菌；ＤＮＡ提取ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ。１６７２－９４５５．２０１３．０５．００９文献标志码：Ａ文章编号：１６７２９４５５（２Ｏ１３）０５ — ０５３０，０２
１ｉｋｅｆｕｎｇｉ．ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｅｅｎｚｙｍｅｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｗａｓａｄｏｐｔｅｄｔｏｅｘｔｒａｃｔＤＮＡｏｆＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓａｌｌｄ
峰，刘彩林，欧国平，孙明月，孙自镛△（华中科技大学同济医学院附属同济医院
４３００３０）
徐令清，汪
检验科，武汉
【摘要】目的寻找一种快速提取酵母样真菌ＤＮＡ的方法。方法使用酶溶解法提取新生隐球菌及其他酵