一株降解微囊藻毒素菌种的鉴定及其活性研究
水中微囊藻毒素去除方法的研究
水中微囊藻毒素去除方法的研究
研究背景：
微囊藻毒素是污染水环境的主要原因。
它们会引发许多毒理作用，可能通过不同的生物和非生物过程对网络生态系统有害。
为了减轻微囊藻毒素对人体和环境的潜在毒性危害，十分必要的是开发有效的水处理技术来降低水体中的微囊藻毒素浓度，实现安全饮用水和水质保护。
研究内容：
本研究将集中研究微囊藻毒素去除方法，E-NTU法作为我们探讨的重点。
本研究将探讨微囊藻毒素去除效率及其影响因素，例如水温，加药量，pH值，来水流量和沉积时间等，以及膜过滤和活性炭及其他技术对微囊藻毒素去除效果的比较研究。
本研究还将针对微囊藻毒素去除时的工艺经济性进行评估。
研究进程：
本研究将以实验室和室内水处理系统为主要研究载体，主要研究步骤如下：
（1）详细研究微囊藻毒素的分类，观察其出现在水中的状况及其分布特征。
（2）测定不同pH值下微囊藻毒素的去除效果（汞板培养及凝集剂），并深入研究去除机理。
（3）应用E-NTU法进行微囊藻毒素去除实验，探讨水温、加药量、pH值、来水流量和沉积时间等条件下的E-NTU法微囊藻毒素去除效率及其影响因素的影响规律。
（4）研究膜过滤、活性炭和其他技术的去除效果，并探讨去除效果的机理，对比不同技术在同等条件下对微囊藻毒素去除效率的区别。
（5）本研究将建立模型，测算技术在各个参数下的经济性分析，以评估微囊藻毒素去除技术在实际应用中的技术经济性。
微囊藻毒素的检测及其治理研究进展
微囊藻毒素的检测及其治理研究进展微囊藻毒素是水体富营养化发生后产生的最大危险物质之一，对人体健康有极大的危害。
文章主要从藻毒素的危害、致毒机理、分析检测方法及其去除方法等方面，对近年来对藻毒素的研究进展进行介绍。
标签：微囊藻毒素；检测；去除方法微囊藻毒素（MC）是由微囊藻（Microcystis）、浮游蓝丝藻（Plankt othrix）、鱼腥藻（Anabaena）和颤藻（Oscillat oria）等淡水藻类产生的环七肽肝毒素[1]。
微囊藻毒素是”水华”产生的最大危险物质之一。
它不仅直接污染饮用水源，还可以在水生生物中富集，通过食物链而进入高等级生物体内，直接威胁人类的健康和生存。
1 微囊藻毒素的致毒机理根据藻毒素对生理系统、器官和细胞等主要器官的不同影响，一般分为肝毒素、神经毒素和接触、肠胃刺激性毒素。
有报告指出藻毒素可能促进肿瘤的发生[2]。
微囊藻毒素可以促进机体内脂类物质过氧化反应，破坏机体氧自由基的产生与清除的平衡，而体内自由基和许多疾病和外源性损伤的病理过程都有关联[3]。
2 微囊藻毒素的检测方法水环境中MC的分析检测是研究其在水环境中分布和迁移规律以及去除方法的基础。
目前MC的检测方法可以简单分为：生物检测法、免疫检测法、蛋白磷酸酶抑制法、色谱分析法和聚合酶链反应（PCR）分析。
2.1 生物检测法生物检测法分为动物实验和细胞学实验。
动物实验是通过研究藻毒素对动物的急性毒性作用来验证其毒理效应。
但其缺点是不能进行定性分析，且检测灵敏度不高。
细胞学实验是利用原代肝细胞来检测藻毒素，可大大减少受试动物的使用量，同时受试细胞的同质性还可避免在动物实验各出现的个体差异，缺点是对操作者要求较高，要求操作人员掌握一定细胞培养技术。
2.2 色谱分析法分析MC的色谱技术包括高效液相色谱（HPLC），液相色谱-质谱联用分析（（LC-MS），毛细管电泳技术（CE）等。
高效液相色谱（HPLC）是环境监测不可或缺的技术支撑，对藻类毒素及其同系物可做到定性和定量分析，是了解藻类毒素化学性质和结构的重要手段。
微囊藻毒素降解方法研究进展
１ ＭＣ 结构 ． １
的胞外溶解性毒素嘲 Ｌｍ ｅ 等发现 ， ；ａ ｂｒ ｔ 将活性炭滤池与常规
净 水单 元组 合 ， 以脱 除 ８ ％以上 的 Ｍ ， 可 ０ Ｃ 出水残 留毒素 低
（ 一 氨 酸 ＿ ＿ 一一 Ｄ丙 Ｌ ＿ ６ 甲基 ＿一 天冬 氨酸 ＿—＿—＿ｄ － 赤 Ｄ异 ＬｚＬｚＡ ａ Ｄ一 异谷 氨 酸 一 脱 氢丙 氨 酸 ）其 中 ， 甲基 。 环肽 结 构 中含 有 和 ｚ两 个可变 的 氨基 酸基 团（ １【 其 中 ， 图 ）。 共轭 二烯 支链 Ａ ｄ ｄａ （ 氧 基 ＿ 甲氧基 －，，三 甲基 一 一 基 ４，一 烯 酸 ） ３ ９ ． ２６ ８ １苯 ０ ６二 是表 达 藻毒 素 生 理 活 性 的 结 构 ； 和 ｚ在不 同 的 Ｍ Ｃ变 型 中代
ｓ ｍｍａ ｉｅ Ｎｅ ｓｒｖｎ ｉｅ ｔ ｎ ｒ ｌｏｐ ｔｆｒ ｒ ｏｅ ａ ｅＭ ｉｒ ｓｓｉｓ ｕ ｒｚ ｄ． ｗ ｔｉｉ ｇｄｒ ｃｉ ｓａ ｅａｓ ｕ ｏ ｗａｅｔ ｒｓ ｃ ｏｙ ｔ ． ｏ ｎ
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安徽 农 业科 学 ， ｕｎｌ ｆ ｎｕ Ａ ｒ Ｓｉ２ ０ ，６ ２ ：１— １ ， ０ Ｊ ｒａ ｏ Ａ ｈｉ ｇｉ ｃ．０ ８３ （）７４ ７５７ ｏ ． ４
责 任编 辑 张杨林 责 任校 对 王 淼
微囊藻毒素 降解 方法研 究进展
Ｄ－ｌ（ｓ） Ｇｕ ｉ ｏ
遍存在的两种典型微囊藻毒素 Ｍ －Ｒ和 Ｍ －Ｒ有很强的 ＣＲ ＣＬ
1株具有耐镉降解微囊藻毒素细菌的分离鉴定
近年来，许多城市的河道、湖泊等水体都受到 了污染，不仅氮磷超标，造成水体富营养化程度越 来越严重，蓝藻水华频发，产生多种毒素，包括最 危险的微囊藻毒素，而且重金属物质大量留存，影 响人体健 康。２０１１年 安 徽 通 报 怀 宁 儿 童 血 铅 超 标事件；湘江水系郴州段的河流镉超标 １．２～９
摘 要 从安徽镜湖腐烂的蓝藻中筛选出 １株细菌，命名为 Ｒ１，该菌株具有较强的耐镉、溶藻以及可降解微 囊藻毒素能力，经 １６ＳｒＤＮＡ序列对比分析鉴定，Ｒ１属于气单胞菌属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）。该菌株对 Ｃｄ２＋有很好的耐 受性，在含有 ５０ｍｇ／ＬＣｄ２＋的培养基中仍能正常生长；细菌通过分泌胞外物质溶解铜绿微囊藻，且该胞外物质 耐高温，属非核酸或多糖类物质，丙氨酸和苯丙氨酸协同作用而溶藻；在 ０．１ｍｇ／ＬＣｄ２＋存在的情况下，细菌溶 藻能力增强；微囊藻毒素的初始浓度为 １．８４ｍｇ／Ｌ时，７ｄ时间降解率为 ４０．２％。 关键词 微囊藻毒素降解菌；耐镉；溶藻 中图分类号 Ｑ９３９．９ 文献标识码 Ａ 文章编号 １００５－７０２１（２０１８）０５－００１５－０６ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００５－７０２１．２０１８．０５．００３
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌｓｔｒａｉｎｎａｍｅｄａｓＲ１ｗａｓｓｃｒｅｅｎｅｄｏｕｔｆｒｏｍ ｒｏｔｔｅｎｂｌｕｅｇｒｅｅｎａｌｇａｅｉｎＪｉｎｇｈｕＬａｋｅ（Ｍｉｒｒｏｒ Ｌａｋｅ）ｉｎＡｎｈｕｉ．Ｔｈｅｓｔｒａｉｎｈａｄｔｈｅｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｏｃａｄｍｉｕｍａｎｄｃａｐａｂｌｅｏｆｌｙｓｉｎｇａｌｇａｅａｎｄｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎｓ． Ｔｈｒｏｕｇｈｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｗｉｔｈ１６ＳｒＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｒ１ｂｅｌｏｎｇｓｔｏｔｈｅｇｅｎｕｓｏｆＡｅｒｏｍｏｎａｓ．Ｔｈｅｓｔｒａｉｎｈａｓａｇｏｏｄ ｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｏＣｄ２＋，ａｎｄｃａｎｎｏｒｍａｌｌｙｇｒｏｗｉｎｍｅｄｉｕｍ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ５０ｍｇ／ＬｏｆＣｄ２＋，ｔｈｅｓｔｒａｉｎｄｉｓｓｏｌｖｅｄＭｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｂｙｓｅｃｒｅｔｉｎｇｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ，ａｎｄｉｔｗａｓｗｅｌｌｔｏｌｅｒａｔｅｄｔｏｈｉｇｈｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｔｈｅｓｕｂｓｔａｎｃｅｂｅｌｏｎｇｓ ｔｏｎｏｎｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｏｒｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ｔｈｅａｌｇａｅｌｙｓｉｓｗａｓｓｙｎｅｒｇｅｔｉｃｅｆｆｅｃｔｏｆａｌａｎｉｎｅａｎｄｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ．Ｉｎｔｈｅｃｏｎｄｉ ｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｘｉｓｔｅｎｃｅｏｆ０．１ｍｇ／ＬｏｆＣｄ２＋，ｔｈｅａｂｉｌｉｔｙｏｆａｌｇａｅｌｙｓｉｎｇｗａｓｅｎｈａｎｃｅｄ；ｗｈｅｎｉｎｉｔｉａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｍｉ ｃｒｏｃｙｓｔｉｎｓｗａｓａｔ１．８４ｍｇ／Ｌ，ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｔｈｅｓｔｒａｉｎｗａｓａｔ４０．２％ ｉｎｓｅｖｅｎｄａｙｓ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎｓｂｉｏｄｅｇｒａｄｉｎｇｂａｃｔｅｒｉｕｍ；ｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｏｃａｄｍｉｕｍ；ａｌｇａｅｌｙｓｉｓ
光催化氧化法降解微囊藻毒素研究进展
光催化氧化法降解微囊藻毒素研究进展摘要近年来蓝藻水华现象日益严重，甚至威胁了人类饮用水的安全。
传统水处理技术对微囊藻毒素去除效果不明显，新型降解技术亟待研究。
概述了光Fenton氧化法、二氧化钛系列光催化氧化法的特点和类型，研究其应用进展，并提出未来光催化氧化法降解微囊藻毒素的主要研究方向。
关键词饮用水；微囊藻毒素；光Fenton氧化法；二氧化钛；降解近年来，大面积的蓝藻水华污染以及蓝藻细胞破裂释放出的具有高致癌性的微囊藻毒，严重影响了饮用水源的水质安全。
低剂量的微囊藻毒素残留就能引起人和动物的肝脏损伤，过量饮用会诱发肝癌甚至死亡。
根据我国2007年7月起实施的新版《生活饮用水标准》（GB5749-2006），饮用水中的微囊藻毒素含量的上限是1 μg/L[1]。
现有的传统水处理技术一般按照“混凝→沉淀→过滤→消毒”的工艺流程，能滤去未破裂的藻细胞及胞内毒素，但对于胞外毒素不起作用。
因此，探寻微污染水中微囊藻毒素的高效降解方法成为当下的紧要问题。
常规MC处理技术包括活性炭吸附，紫外光降解和化学氧化法，但各有局限性[2]。
高级氧化技术的操作条件易于控制且具有强氧化性，成为国内外学者的主要研究方向之一，主要包括光催化氧化法、湿式空气催化氧化法、（类）Fenton 试剂氧化法等。
其中，作为一种高效的水体净化技术，光催化氧化法的应用前景十分广阔。
1 光Fenton氧化法光Fenton氧化法是指在传统的Fe2+/H2O2的基础上加入紫外光及光化学活性物质以提高羟基自由基的产生速率。
一般包括UV/Fenton法和UV-vis/草酸铁络合物/H2O2法2种。
1.1 UV/Fenton法UV/Fenton法相当于普通Fenton法和UV/H2O2系统的复合，其作用机理是在普通Fenton系统的作用基础上，由于Fe（OH）2+络合物的存在使Fe2+与UV 具有协同作用，促进H2O2的分解，从而减少Fe2+的使用量，提高H2O2的利用率。
微囊藻毒素降解菌S3的分子鉴定及其降解毒素的研究
第27卷第7期2007年7月环 境 科 学 学 报 Acta Scientiae Circu m stantiaeVol .27,No .7Jul .,2007基金项目:人事部留学回国人员择优资助项目(2005)Supported by the Scientific Research Foundati on f or the Returned Overseas Chinese Scholars (2005)作者简介:刘海燕(1983—),女,硕士研究生,E 2mail:liuhaiyan8327@;3通讯作者(责任作者),E 2mail:lijianhong @njnu .edu .cnB i ography:L I U Haiyan (1983—),fe male,E 2mail:liuhaiyan8327@;3Correspond i n g author ,E 2mail:lijianhong @njnu .edu .cn刘海燕,宦海琳,汪育文,等.2007.微囊藻毒素降解菌S3的分子鉴定及其降解毒素的研究[J ].环境科学学报,27(7):1145-1150L iu H Y,Huan H L,W ang YW ,et al .2007.Molecular identificati on of a m icr ocystin 2degrading bacteria strain S3and its bi odegradati on of m icr ocystin [J ].Acta Scientiae Circum stantiae,27(7):1145-1150微囊藻毒素降解菌S3的分子鉴定及其降解毒素的研究刘海燕1,宦海琳1,汪育文1,李建宏1,3,周耀明21.南京师范大学生命科学学院,南京2100972.南京师范大学化学科学学院,南京210097收稿日期:2006208202 修回日期:2007202206 录用日期:2007204210摘要:对一株具有强降解微囊藻毒素MC 2LR 能力的细菌S3进行了分子鉴定.测得该菌16S r DNA 为1396bp,GenBank 序列登录号为DQ836314.序列比对结果显示,该菌与类芽孢杆菌Paenibacillus validus 的相似性达98%.微囊藻毒素降解实验结果表明,该菌能在以微囊藻毒素为唯一碳、氮源的培养基中生长,微囊藻毒素在72h 内减少78.3%,菌株S3的最适生长温度是30℃,最适生长pH 值为7.0.关键词:类芽孢杆菌;微囊藻毒素;生物降解;16S r DNA文章编号:025322468(2007)0721145206 中图分类号:X172 文献标识码:AM olecul ar i den ti f i ca ti on of a m i crocysti n 2degrad i n g bacter i a stra i n S3and its b i odegrada ti on of m i crocysti nL I U Haiyan 1,HUAN Hailin 1,WANG Yuwen 1,L I J ianhong1,3,Z HOU Yaom ing21.L ife Sciences College,Nanjing Nor mal University,Nanjing 2100972.Che m ical Sciences College,Nanjing Nor mal University,Nanjing 210097Rece i ved 2August 2006; rece i ved in revised f or m 6February 2007; accepted 10Ap ril 2007Abstract:More than 18m icr ocystin 2degrading bacterial strains were is olated fr om water bodies with cyanobacteria bl oom s .The strain with the highest degrading capacity was strain S3.T o identify the s pecies,16S r DNA of S3was a mp lified by PCR.The PCR p r oduct was sequenced and the data subm itted t o GenBank under accessi on number DQ836314.BLAST sequence analysis showed that it had a 98%si m ilarity t o Paenibacillus validus .S3could gr ow on m ineral medium supp lied with m icr ocystins (mainly MC 2LR ),extracted fr om M icrocystis PCC 7806,as s ole carbon and nitr ogen s ources (m icr ocystins were substituted for NH 4+and glucose in M9medium ).S3could degrade and metabolize 78.3%of 5mg ・L -1MC 2LR in 72h .To find suitable conditi ons f or the bacterial degradati on ofMC 2LR,we investigated the effects of te mperature and pH on cell gr owth and MC 2LR degradati on rate .The results showed that 30℃and pH 7.0were the best conditi ons,which are si m ilar t o the envir onmental conditi ons f or M icrocystis bl oom s .So S3may be useful in removingMCs fr om water during algal bl oom s .Keywords:Paenibacillus validus ;m icr ocystin;bi odegradati on;16S r DNA1 引言(I ntr oducti on )微囊藻产生的微囊藻毒素(m icr ocystins,MCs )是在蓝藻水华中出现频率最高、分布广泛、毒性较大的一类藻毒素.它们不但对水生生态造成破坏,同时也可导致人类的肝损伤,诱发癌症(Falconer,1999;Ueno et al .,1996).而常规的饮用水生产工艺无法去除MCs,饮用水源中MCs 的存在对人体健康是一个潜在的威胁(施玮等,2000;狄留妹,2002).MCs 具有相当的稳定性,在一般的物理化学环境条件下降解十分缓慢(Cousins et al .,1996;Tsuji et al .,1997).活性碳吸附、Ti O 2催化光氧化、臭氧氧化等一些物理化学处理工艺已被尝试用以去除MCs (朱光灿,2003),但从技术和经济等方面的要求来环 境 科 学 学 报27卷看,目前尚无真正有效的手段消除水中的MCs.微生物降解是一条可行的途径,采用生物膜过滤可有效地除去MCs(吕锡武等,1999;Bourne et al.,2006; Ho et al.,2006).但MCs并不是普通氨基酸组成的环肽,只有一些产生特殊酶类的微生物才能降解MCs(Duy et al.,2000).显然,获得高效降解MCs 的菌株是这一途径成功应用的关键.关于MCs降解菌的分离,国内外已有一些研究报道(李祝等, 2005),已报道的菌株包括鞘氨醇单胞菌(S phingo m onas s pp.)、铜绿假单胞菌(Pseudo m onas aeruginosa)和青枯菌(R alstonia solanacearum),对其它降解菌种类未见研究报道.在前期工作中,我们已从南京市附近水华发生的水体中分离获得了18株具有显著降解微囊藻毒素(m icr ocystin2LR,MC2LR)能力的菌株(宦海琳等, 2006),其中具有最高强降解能力的菌株为S3 (strain S3).通过形态和生理生化特征已对S3进行了初步鉴定.本文将进一步采用16S r DNA序列比对的方法对其分类地位进行鉴定.同时对其降解微囊藻毒素的特性也进行研究,旨在为消除水源中微囊藻毒素的污染提供有用的材料和理论依据.2 材料与方法(Materials and methods)2.1 基于16S r DNA序列的S3菌株的分子鉴定2.1.1 菌株 菌株S3采用添加MCs的修改M9培养基从南京市附近水华发生的水体中分离获得(宦海琳等,2006).2.1.2 16S r DNA扩增及序列测定 基因组DNA 的提取参照分子生物学实验指南(奥斯伯等, 1999).16S r DNA PCR扩增采用细菌通用引物:P1, 5′AG AGTTTG ATCCTGGT CAG AAC3′;P6,5′T ACGGCT ACCTTG TT ACG ACTT3′(东秀珠,2001). PCR反应条件:95℃预变性5m in,95℃变性1m in, 59℃退火2m in,72℃延伸2m in,30个循环,最后72℃延伸10m in,保持4℃.反应结束后,取5μL反应液经1%琼脂糖电泳,E B染色,紫外检测.PCR产物由上海英骏公司完成测序.2.1.3 基于16S r DNA序列的系统发育树分析 从GenBank中选取类芽孢杆菌属(Paenibacillus)20个菌株,产芽孢细菌的其它7个属A licyclobacillus、Am phibacillus、A neu rinibacillus、B acillus、B revibacillus、Halobacillus、S porolactobacillus的菌株各1株进行分析.所有菌株的16S r DNA的全序列用Clustal(1.8)软件包排序,用MEG Aversi on2软件包中的Ki m ura22Para meter D istance模型计算进化距离,用Neighbor2 Joining法构建系统发生树;1000次随机取样,计算bootstrap值以评估系统发生树的置信度,并计算各菌株的相似性百分比.2.2 S3菌株对微囊藻毒素的降解实验2.2.1 微囊藻毒素提取 实验中所用微囊藻毒素从实验室培养的M icrocystis PCC7806细胞中用C18柱提取纯化(L inda et al.,2001).获得的毒素中MC2LR占68.2%、MC2RR占9.3%.毒素测定采用HP LC方法(宦海琳等,2006),标样购自中科院武汉水生所.2.2.2 降解菌在M9和MCs添加培养基中的生长测定 菌种基础培养基采用M9培养基(H ir oshi et al.,2004),活化后的菌种接种于M9液体培养基试管中,30℃振荡培养.每隔4h取样,在650nm波长测定光密度值.采用大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(S taphylococcus aureus)作对照菌.取适量菌接种到MCs添加培养基(MM9)中培养,在MM9中添加约50mg・L-1MC2LR作为唯一碳/氮源取代M9培养基中原有的碳(葡萄糖)和氮(NH4Cl)源,培养方法同上.由于在MM9中生长相对较慢,取样为8h间隔,测定方法同上.2.2.3 温度和pH对S3菌生长和降解MC2LR的影响 将活化的菌适量接种到含有MM9培养基的试管中,分别在20、25、30、37℃不同的温度条件下振荡培养S3菌,72h后取出测定OD650和MC2LR含量;分别用Na OH和HCl调节MM9的pH值为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,其它条件不变的情况下振荡培养S3菌,72h后取出测定OD650和MC2LR含量.在30℃、pH7.0条件下振荡培养测定MC2LR 降解动力曲线.在MM9中接种S3,每隔12h取样,高速离心后去除菌体,上清液用0.45μm滤膜过滤后,用HP LC分析MC2LR的含量,计算降解率.2.3 m lr A降解酶基因的扩增采用引物Pri m er M A:5′G ACCCG ATGTT CAA G AT ACT3′,Pri m er M B:5′CT CCTCC CACAAAT CA GG AC3′进行PCR扩增,检测S3菌株中是否包含微囊藻毒素降解酶基因m lr A(Sait o,2003).3 结果(Results)3.1 16S r DNA的扩增结果及序列测定 菌株S316S r DNA的长度为1396bp,序列在64117期刘海燕等:微囊藻毒素降解菌S3的分子鉴定及其降解毒素的研究GenBank 上的登录号为DQ836314.将S3菌株的16S r DNA 序列通过NCB I 网站B last (www .ncbi .nl m .nih .gov )录入,发现该菌株与类芽孢杆菌属(Paen ibacillus )细菌的相似性较高,进一步将该菌株与类芽孢杆菌属的20个菌株、芽孢杆菌属相近属的7个菌株进行序列比对,并构建系统发育树,如图1所示.结果显示,S3菌株与类芽孢杆菌属细菌与Paenibacillus validus 16S r DNA 碱基序列的相似性达到98%.聚类分析显示,S3菌株与P .va lidus 聚类的置信度为100%,二者在遗传学特征上有高度的一致性.图1 基于16S r D NA 的系统发育树Fig .1 Phyl ogenetic tree based on 16S r DNA sequence of selected strains 前期的工作已经通过形态和生理生化特征相分析,对照伯杰氏细菌鉴定手册,鉴定S3菌株与肠杆菌属(En terobacter )的特征相吻合(宦海琳等,2006),从表1可见,菌株S3与3株P .va lidus 16Sr DNA 序列均有很高的一致性,因此,该菌株应为一株P .validus .如何评估生理生化特征和分子遗传特征之间的差异,确立S3菌株分类归属,尚需进一步研究确定.7411环 境 科 学 学 报27卷表1 菌株S3与几株类芽孢杆菌16S rD NA 序列一致性比较Table 1 Comparis on of the 16s r DNA sequences of S3and Paenibacillusstrains菌株GenBank 登录号一致性(I dentity )Strain S3DQ836314100%Paenibacillus validus AB07320398%P .validus strain PR 2P9AF35369798%P .validus strain DS M3037D7832096%P .larvae DQ07962194%P .am ylolyticus AM06269094%P .polym yxaAY35963794%3.2 菌株S3对微囊藻毒素的降解图2所示是菌株S3对MC 2LR 降解的HP LC 图.结果可见,菌株S3对MC 2LR 降解后,MC 峰附近没有新的峰出现,表明S3是对微囊藻毒素的降解,并没有特异的产物生成和积累.图2 菌株S3降解M C 2L R 的HP LC 图谱(A:10mg ・L -1标品MC 2RR 和MC 2LR;B:降解前的MCs 2LR;C:菌株S3降解48h 后)Fig .2 HP LC Pr ofiles of MCs after bi odegradati on by strain S3(A:standard MC 2RR and MC 2LR at 10mg ・L -1;B:MC 2LR without S3;C:MC 2LR with S3f or 48h )3.3 菌株S3在M9和MM9培养基中的生长图3是菌株S3在M9和筛选培养基MM9中的生长曲线,结果发现,在M9基本培养基中S3和2株对照菌E .coli (G -)和S.au reus (G +)均能良好生长,在4～12h 内都进入了对数生长期,在12～36h 内都处于稳定期.在MM9培养基中,菌株S3生长良好,在8h 后也进入了对数生长期,但2株对照菌E .coli (G -)和S.aureus (G +)在筛选培养基中基本不生长,这说明菌株S3能以MCs 作为碳源和氮源进行生长.而不能降解MC 2LR 的E .coli 和S.aureus 却不能生长.图3 S3和对照菌株在M 9和MM 9培养基中的生长Fig .3 Gr owth curves of strain S3and contr ols in M9(A )andMM9(B )media3.4 温度和pH 对S3菌生长和降解MC 2LR 的影响图4所示为温度和pH 对S3生长和MC 2LR 降解的影响,结果可见,培养温度在20～37℃之间时,30℃是S3的最适生长温度,MC 2LR 的降解率也是30℃时最高;对pH 而言,中性条件比较适合S3菌的生长和对MC 2LR 的降解.从结果中还可以看到,pH 为5～9时菌浓度OD 650在0.21～0.37,变化不大,但MC 2LR 的降解率却从最低的32.6%变化到84117期刘海燕等:微囊藻毒素降解菌S3的分子鉴定及其降解毒素的研究最高的76.9%,可见pH 对S3菌降解MC 2LR 的影响较大.图4 温度和pH 对S3菌生长和降解M C 2L R 的影响Fig .4 Effects of temperature and pH on gr owth and MC 2LRdegradati on of strainS3图5 菌株S3对M C 2L R 的降解曲线Fig .5 Degradati on of MC 2LR by strain S33.5 最适条件下的藻毒素降解动力曲线在30℃、pH 7.0条件下测定S3对MC 2LR 降解的动力曲线.如图5所示,在起始浓度MC 2LR 为50mg ・L -1、OD 650(接种浓度)为0.350时,约36h 进入对数降解期,72h 达到最高,降解率达到78.3%,其后进入稳定期.4 讨论(D iscussi on )虽然在自然界广泛存在着能够降解MCs 的细菌,但一般的多肽水解酶不能分解MCs,只有一些特殊的细菌种类具备降解MCs 的能力.迄今为止,被分离和详细研究的MCs 降解菌株却很少.Bourne (2001)对MC 2LR 降解菌鞘氨醇单胞菌(Sph ingo m onas s p.MJ 2P V )研究,发现了与藻毒素降解相关的基因m lr A 、m lr B 和m lr C .Sati o (2003)发现在具有降解藻毒素能力的另2株菌Y2和MD 21中均存在m lr A 基因,但其它没有降解能力的鞘氨醇单胞菌属却没有m lr A 基因,因此,推测m lr A 基因只存在微囊藻毒素降解菌中,而不是鞘氨醇单胞菌属的共有基因.为了探讨本实验所筛得MC 2LR 降解菌的降解途径,作者也采用PCR 的方法检测降解菌S3中是否存在m lr A 基因,结果未能扩增特异性产物条带.因此,本实验分离获得的S3菌株,不同于已报道的属种,该菌有可能拥有不同的降解酶.HP LC 检测结果未见明显的MC 2LR 降解产物峰,可能有多种酶参与毒素完全降解过程.HP LC 检测中也发现S3对MC 2RR 也具有降解作用,但由于样品中MC 2RR 相对含量较低,故未对其进行定量分析.从对MC 2LR 的降解能力看,在本实验的条件下,72h 降解率达到了78.3%.总降解率显然与降解菌浓度和实验条件是相关的,但在已报道的文献中大多缺少细菌浓度的数据,因此,无法对这些细菌相对降解能力的高低进行比较.从MC 2LR 降解动力曲线来看,最大降解率达到接近80%后就不再增加,推测降解MCs 的酶可能是胞内酶,MCs 必须在一定的浓度下扩散到胞内才能被代谢.关于S3对MC 2LR 的降解机理有待进一研究.菌株S3的最适生长和最适降解温度为30℃,最适pH 为7.0.这些环境条件和蓝藻水华爆发的环境条件基本一致.因此,该菌株有可能被用于在水华爆发的季节消除水中的微囊藻毒素.5 结论(Conclusi ons )1)从水华发生的水体中分离获得具有显著降解微囊藻毒素(m icr ocystin 2LR,MC 2LR )能力的菌株S3.通过16S r DNA 进行同源比较,鉴定该菌株为芽孢杆菌属(Paenibacillus ).9411环 境 科 学 学 报27卷2)该菌株能明显的降解微囊藻毒素,在72h内的降解率可达78.3%.3)该菌株在以微囊藻毒素为唯一碳、氮源的培养基中最适生长温度为30℃,最适生长pH值为7.0.责任作者简介:李建宏,南京师范大学生命科学学院教授.主要从事微藻生理学和环境微生物方面的研究.E2mail: lijianhong@.References:Bourne D G,R iddles P,Jones G J,et al.2001.Characterizati on of a gene cluster involved in bacterial de gradati on of the cyanobacterial t oxin m icr ocystin LR[J].Envir on Toxicol,16(6):523—534 Bourne D G,B lakeley R L,R iddles P,et al.2006.B i odegradati on of the cyanobacterial t oxin m icr ocystin LR in natural water and bi ol ogically active sl ow sand filters[J].W ater Res,40(6):1294—1302Cousins I T,Bealing D J,Ja mes H A,et al.1996.B i odegradati on of m icr ocystin2LR by indigenous m ixed bacterial populati ons[J].W at Res,30(2):481—485D i L M.2002.Study on effect of m icr ocystins t oxin t o human body[J].J iangsu Preventive Medicine,13(3):5—6(in Chinese)Dong X Z,Cai M Y.2001.Manual of syste matic deter m inati on general bacteri ol ogy[M]Beijing:Science Press,410(in Chinese)Duy T N,La m P S,Sha w G R,et al.2000.T oxicol ogy and risk assess ment of fresh water cyanobacteria(blue2green algae)t oxic in water[J].Rev Envir on Conta m Toxicon,163:113—186 Falconer I R.1999.An overvie w of p r oble m s caused by t oxic blue2green algae(cyanobacteria)in drinking and recreati onal water[J].Envir onmental Toxicol,14(1):5—12Frederick M Ausubel,Robert E K.1999.Short Pr ot ocols in MolecularB i ol ogy[M].Beijing:Science Press(in Chinese)H ir oshi I,M iyuki N,Toshihiko A.2004.Characterizati on of degradati onp r ocess of cyanobacterial hepat ot oxins by a gram2negative aer obic bacterium[J].W at Res,38:2667—2676Ho L,Meyn T,Keegan A,et al.2006.Bacterial degradati on of m icr ocystin t oxins within a bi ol ogically active sand filter[J].W ater Res,40(4):768—774Huan H L,Han L,L I J H,et al.2006.Is olati on and identificati on of five m icr ocystin degrading bacterial strains[J].Journal of Lake Sciences,18(2):184—188(in Chinese)L inda A L,Christine E.2001.Purificati on of m icr ocystins[J].Chr omat ogr,912:191—209L i Z,Guo X Q,Zhao Y J,et al.2005.B i odegradati on of m icr ocystin in aquatic envir onment[J].Ecol ogic Science,24(1):90—95(in Chinese)LüX W,Yuhei I na mori,D ing G 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munoassay[J].Carcinogenesis,17:1317—1321中文参考文献:狄留妹,2002.微囊藻毒素对人体健康影响的研究[J].江苏预防医学,13(3):5—6东秀珠,蔡妙英.2001.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,410F奥斯伯,R E金斯顿.1999.精编分子生物学实验指南[M].北京:科学出版社,45宦海琳,韩岚,李建宏,等.2006.五株微囊藻降解菌的分离鉴定[J].湖泊科学,18(2):184—188李祝,郭向前,赵以军,等.2005.水环境中微囊藻毒素的生物降解[J].生态科学,24(1):90—95吕锡武,稻森悠平,丁国际.1999.有毒蓝藻及藻毒素生物降解的初步研究[J].中国环境科学,19(2):138—140施玮,朱惠刚.2000.微囊藻毒素毒理学研究综述[J].上海环境科学,19(2):82—86朱光灿,吕锡武.2003.去除藻毒素的水处理技术进展[J].中国给水排水,19(8):36—390511。
微囊藻毒素微生物降解途径与分子机制研究进展
微囊藻毒素微生物降解途径与分子机制研究进展一、内容描述微囊藻毒素(Microcystins,MC)是由某些单细胞藻类产生的一种具有高毒性的天然毒素，广泛存在于海洋环境中。
由于其对生态系统和人类健康的潜在危害，研究微囊藻毒素的微生物降解途径与分子机制具有重要意义。
近年来科学家们在这一领域取得了一系列重要进展。
首先研究人员发现了许多能够降解微囊藻毒素的微生物菌株，这些菌株主要包括细菌、真菌和病毒等，它们可以利用不同的酶类或代谢途径来降解微囊藻毒素。
例如一些细菌通过合成脲酶降解微囊藻毒素中的脲键，从而降低其毒性；真菌则通过降解微囊藻毒素中的脂肪酸酯来达到降解的目的。
此外还有一些病毒可以感染微囊藻并抑制其生长，从而间接地减少微囊藻毒素的产生。
其次科学家们揭示了微囊藻毒素降解过程中的关键酶和代谢途径。
研究表明微囊藻毒素的降解主要涉及多种酶的作用，如脲酶、酯酶、酰胺酶等。
这些酶在不同微生物菌株中具有特异性，可以有效地降解微囊藻毒素。
此外研究还发现，微囊藻毒素的降解过程受到环境因素的影响，如光照、温度、盐度等，这些因素可以影响微生物菌株的生长和代谢途径的选择。
研究人员还探讨了微囊藻毒素降解的分子机制，研究发现微囊藻毒素与微生物菌株之间的相互作用是影响降解效果的关键因素之一。
通过基因工程技术，科学家们已经成功地构建了一些具有抗性基因的微生物菌株，这些菌株可以在高浓度的微囊藻毒素环境中存活并进行有效的降解。
此外研究还发现，微囊藻毒素降解过程中的一些关键酶和代谢产物具有生物活性，可以作为药物或食品添加剂用于环境保护和健康促进等领域。
1. 微囊藻毒素的来源和危害微囊藻毒素是由某些单细胞藻类产生的一种有毒物质，主要存在于海洋中。
这些有毒藻类在生长过程中会分泌出微囊藻毒素，其中包括一些对人体健康具有极大危害的毒素，如艾氏藻毒素、汉氏氏藻毒素等。
微囊藻毒素具有极高的生物活性，能够破坏人体的细胞膜和线粒体功能，导致细胞死亡。
Bi2WO6光催化降解微囊藻毒素的研究的开题报告
Bi2WO6光催化降解微囊藻毒素的研究的开题报告一、研究背景和意义：微囊藻毒素是一种由蓝藻中的微囊藻分泌的毒素，容易在湖泊、河流、水库等水体中产生，对水质和人类健康造成威胁。
当前，已有多种光催化材料被用于微囊藻毒素的降解。
Bi2WO6作为一种新型的光催化材料，具有高光催化活性和强氧化性能，可以有效地降解微囊藻毒素。
因此，研究Bi2WO6光催化降解微囊藻毒素的方法和机理，对水质治理和人类健康保护有着重要的意义。
二、研究目标和内容：本研究旨在研究Bi2WO6光催化降解微囊藻毒素的方法和机理，并探究Bi2WO6对微囊藻毒素的降解效率、反应动力学和影响因素等方面的特性。
具体研究内容包括：1. 合成Bi2WO6光催化材料，并对其晶体结构和光学性能进行表征；2. 探究Bi2WO6光催化降解微囊藻毒素的反应过程和反应机理；3. 研究Bi2WO6对微囊藻毒素的降解效率、反应动力学和影响因素，如催化剂浓度、pH值、温度等；4. 比较Bi2WO6与其它光催化材料在微囊藻毒素降解方面的性能差异。
三、研究方法和技术路线：1. 合成Bi2WO6光催化材料：采用水热法或共沉淀法，控制合成条件并进行表征分析；2. 制备微囊藻毒素溶液：以水为溶剂，使用超声波或搅拌的方式制备微囊藻毒素溶液并进行定量分析；3. Bi2WO6光催化降解微囊藻毒素实验：控制pH值、温度等条件，将制备好的Bi2WO6与微囊藻毒素溶液进行光照反应，并进行溶液的取样、化学分析、动力学模型拟合等实验操作；4. 结果分析：得到实验数据后，使用数据处理软件对反应动力学曲线进行分析，比较不同催化剂对微囊藻毒素的影响，寻找最优的Bi2WO6光催化条件和实验参数。
四、预期成果和意义：本研究通过探究Bi2WO6光催化降解微囊藻毒素的方法和机理，研究Bi2WO6对微囊藻毒素的降解效率、反应动力学和影响因素等特性，得到以下预期成果：1. 研究Bi2WO6光催化材料的合成和表征；2. 探究Bi2WO6光催化降解微囊藻毒素的反应过程和反应机理，得出反应动力学模型；3. 研究Bi2WO6对微囊藻毒素的降解效率、反应动力学及其受影响的因素，比较不同光催化材料降解微囊藻毒素的性能差异；4. 提出Bi2WO6光催化降解微囊藻毒素的优化反应条件。
微囊藻毒素-RR的提取与生物降解
微囊藻毒素-RR的提取与生物降解钱元健【期刊名称】《净水技术》【年(卷),期】2012(31)4【摘要】对采集的微囊藻毒素-RR( microcystin-RR,MC-RR)提取并在其含量达到0.1 mg/g(湿重)的基础上,采用鞘氨醇单胞菌降解菌株对提取的MC-RR的生物降解进行了研究.结果表明在温度为30℃、pH=7.0并且有氧条件下,反应体系中初始浓度为42.3 mg/L的MC-RR在36 h内被完全降解.利用高效液相色谱(HPLC)分析发现,在MC-RR生物降解过程中相继出现两个降解产物,其中第一个降解产物的紫外扫描图谱与MC-RR相似度高达95％.%Microcystin-RR (MC-RR) was extracted from cyanobacterial cells. Extracted MC-RR whose concentration reached 0.1 mg/g (wet) was biodegraded by Sphingopyxis sp. in the paper. The results show when temperature is 30 ℃ and pH is 7.0, 42.3 mg/L MC-RR can be biodegraded completely with aerobic condition in 36 h. It is found that there are two biodegradation productions by high performance liquid chromatography (HPLC). UV spectrum similarity between one of the productions and MC-RR reaches 95 %.【总页数】5页(P27-30,143)【作者】钱元健【作者单位】上海青草沙投资建设发展有限公司,上海201206【正文语种】中文【中图分类】X524【相关文献】1.p-n型异质结催化剂Ag2O-BiVO4对微囊藻毒素(MC-RR)的光化学氧化机理研究 [J], 吴春红;方艳芬;Araya Hailu Tirusew;向淼淼;黄应平;陈春城2.微囊藻毒素LR、RR的提取和纯化 [J], 卫涛;向铮;张婧婧;冯小刚3.液相色谱-串联质谱法r检测水中痕量微囊藻毒素-LR和微囊藻毒素-RR [J], 李晨;马颖;李洪鑫;傅玉4.微囊藻毒素LR、RR的提取和制备 [J], 卫涛;向铮;冯小刚;张婧婧5.鞘氨醇单胞菌对微囊藻毒素-RR的降解作用与影响因素分析 [J], 刘剀剡;丁勤;袁梦玹;浦跃朴因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
一株微囊藻毒素降解菌的分离与鉴定
环境 工 程学 报
Ch inese Journal of Env ironm enta l Eng ineering
V o l. 4, N o. 9 Sep . 2 0 1 0
一株微囊藻毒素降解菌的分离与鉴定
刘晓文 李现尧 史全良*
( 苏州大学基础医学与生物科学学院, 苏州 215123)
K ey w ord s w aterbloom; m icrocystins; biodegradat ion; S tenotrophom onas acidam iniphila
水华藻类可产生有毒的化学物质, 其中微囊藻 毒素 ( m icrocyst ins, MCs) 是毒性最大, 出现范围最广 的一类藻毒素 [ 1] 。微囊藻毒素是由 7个氨基酸残基 组成的环状多肽, 由于多肽组成中氨基酸种类的变 化, 导致目前已发现该毒素有 60多种同类物, 其中 存在最普遍、毒性较大的是 M C LR、MC RR、M C YR ( L、Y、R 分别代表亮氨酸、精氨酸和酪氨酸 ) [ 2 ] 。微 囊藻毒素的靶器官是肝脏, 能强烈抑制蛋白磷酸酯 酶 1和 2A 的活性, 诱发癌症 [ 3] 。 1996年在巴西 Ca ruaru市一所透析医院的肾透析治疗中, 由于误用微 囊藻毒素污染水作为肾透析用水, 导致 116人中毒, 52人死亡 [ 4 ] 。 1998年世界卫生组织 ( WH O ) 推荐饮 用水中的微囊藻毒素浓度不高于 1 g /L[ 5 ] 。微囊藻 毒素性质稳定, 在水中的溶解度可达 1 g /L 以上, 一
关键词 水华 微囊藻毒素 生物降解 微嗜酸寡养单胞菌
中图分类号 Q 939 11 文献标识码 A 文章编号 1673 9108( 2010) 09 2023 06
高效降解微囊藻毒素食酸戴尔福特菌USTB_04的培养与活性研究
第1卷 第5期环境工程学报V o l .1,N o.52007年5月Ch i n ese Jour nal of Env iron m enta lEng ineeri n gM ay 2007高效降解微囊藻毒素食酸戴尔福特菌USTB 04的培养与活性研究徐春霞 何宏胜 张 超 吕 乐 闫 海*(河北农业大学海洋学院,秦皇岛066003)(北京科技大学应用科学学院生物科学与技术系,北京100083)摘 要 主要针对筛选的高效降解微囊藻毒素(m icrocy sti ns ,M Cs)的食酸戴尔福特菌USTB 04(D elfti a aci dovorans ,DA 菌)的培养方法进行了研究。
结果表明,以葡萄糖、甘油和乙醇作为惟一碳源时,与氯化铵和尿素相比,酵母粉是支持DA 菌生长的较好氮源。
在以酵母粉作为惟一氮源时,与甘油和乙醇相比,葡萄糖是提高DA 菌生长速度的源。
进一步研究显示,以葡萄糖和酵母粉作为碳源和氮源时,可以支持DA 菌的快速稳定生长,但在以甘油和酵母粉作为碳源和氮源时,培养出的DA 菌降解M Cs 的比活性最高。
此研究在培养高细胞浓度DA 菌作为生物催化剂用于饮用水源中的M C s 去除方面具有重要意义。
关键词 微囊藻毒素 食酸戴尔福特菌U S TB 04 生物降解 培养 活性中图分类号 X52 文献标识码 A 文章编号 1673 9108(2007)05 0021 04Culture and activity of bacteri cal D el f ti a aci dovorans U S TB 04for efficient biodegradati on of m icrocysti nsXu Chunx i a 1H e H ongsheng 2Zhang Chao 2Lu Le 2Yan H a i2(1 Ocean C ollege ,Agricu l tureU n i vers it y ofH ebe,i Q i nhuangdao 066003;2 Depart m en t of B i o l og i cal S ci en ce and Technol ogy ,School ofA pp lied S ci en ce ,Un i versity ofS ci ence and Techn ol ogy Beiji ng ,B eiji ng 100083)Abst ract The cu lture of an i s o lated D el f tia aci d ovorans USTB 04for t h e biodegradati o n of m icrocystins(MC s)w as i n vesti g ated .Co m pared w ith a mm oniu m chloride and urea ,yeast extracts w as found to be a better nitrogen source for the gro w th of D.aci d ovorans USTB 04w hen g lucose ,g lycero l and ethanolw ere used as car bon sources ,respectively .Itw as also i n d icated that g l u cose w as better car bon source co mpared w it h g l y cerol and ethano l for t h e gro w th of D.acidovorans USTB 04w hen yeast ex tractw as used as a so le nitrogen source .Further stud ies sho w ed that g l u cose and yeast extract supported the rapid gro w th o f D.acidovorans USTB 04,ho w ever D.aci d ovorans USTB 04g r own on g lycero l and yeast ex tracts m ainta i n ed the high biodegradation activity of M Cs ,wh ich has grea t si g n ificance i n the re m ova l o fM Cs fro m drinking w ater supp li e s usi n g D.aci d ovorans USTB 04as a ki n d of bio cata lyzer .K ey w ords m icrocystins ;Delftia aci d ovorans USTB 04;b i o deg radati o n ;cu lture ;acti v ity 基金项目:国家自然科学基金资助项目(2037704);北京市自然科学基金资助项目(8063029);教育部重点资助项目收稿日期:2006-09-06;修订日期:2007-01-23作者简介:徐春霞(1963~),女,硕士,副教授,主要从事环境生物学研究工作。
微囊藻毒素降解菌EMB分离鉴定及其降解特性
江苏农业学报(Ji ang s u J.of Ag r .Sci .),2010,26(3):631~636尹玉芬,胡梁斌,周 威,等.微囊藻毒素降解菌E M B 分离鉴定及其降解特性[J].江苏农业学报,2010,26(3):631 636.微囊藻毒素降解菌E MB 分离鉴定及其降解特性尹玉芬1,2, 胡梁斌3, 周 威2, 杨静东2,4, 周益军1,2, 石志琦2(1.南京农业大学植物保护学院,农业部作物病虫害监测与防控重点开放实验室,江苏南京210095;2.江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所,江苏南京210014;3.河南科技学院食品学院,河南新乡453003;4.江苏省东海县农业局,江苏东海222300)收稿日期:2009 08 06基金项目:国家 973 预研项目(2008CB117001)作者简介:尹玉芬(1983 ),女,河北沧州人,硕士研究生,研究方向为天然产物与生物毒素控制。
(Tel)025 ********;(E m ail )yi nyu 2006@163.co m通讯作者:石志琦,(E m ail)nytrpz @yahoo .cn摘要: 以藻毒素提取液作为唯一碳源和氮源,从太湖蓝藻堆积点底泥中分离筛选高效微囊藻毒素降解菌。
结果表明:经过驯化筛选得到1株高效降解菌E M B 。
在培养温度30!、p H 值为7时其降解毒素效率最高,培养21h 内可将初始浓度为2 99mg /L 和2 15mg /L 的M C RR 和M C LR 完全降解,此外菌株E M B 可以将太湖水华样品中的M C RR 和M C LR 在2周内降解到安全饮用水标准范围内。
形态、生理特性和16S rDNA 序列分析表明,菌株E M B 属于芽孢杆菌属(Bacill us.sp .),与已报道的B.sub tilis B FS06在进化树上距离最近。
关键词: 微囊藻毒素;芽孢杆菌;生物降解;16S r DNA中图分类号: S182 文献标识码: A 文章编号: 1000 4440(2010)03 0631 06Ide ntification and Characterization ofM icrocysti n degradi ng Strai n E M BY IN Yu Fen1,2, HU L iang B i n 3, Z HOU W ei 2, YANG Ji n g Dong 2,4, Z HOU Y i Jun 1,2, SH I Zh i Q i2(1.Colle g e of P l an tP rotection,Nanjing Ag ricult ura l Un i versit y,K e y Laboratory o f M onitoring and M anag e men t of Crop D isease s and P est In sects ,M inistry o f Agric u lt u re ,N anji ng 210095,C hina;2.In stit u t e of F oo d Safet y and Qua lit y,Jiang su Acade my of Agric u ltura lS ciences ,N anji ng 210014,Ch i na;3.S c hool of F oo d,H e nan In stit u te of S cie nce and T ec hnology ,X inx i ang 453003,C hina;4.Dongha iBu reau of Agric u lture ,Dongha i 222300,China )A bstrac t : A m icrocy sti ns degrad i ng stra i n w as iso l ated fro m acti va ted m ud o f b l ue green algae stacki ng po t o fT a i huLake through accli m atization w ith m icrocysti ns (M Cs)ex tract from a l gae powder as so l e carbon and n itrog en sources .T he stra i n E M B pe rf o r m ed t he m ost e fficientM Cs biodegradati on w hen i ncubated at 30!and p H 7 0.2 99m g /L M C RR and2 15m g /L M C LR w ere comp l e tely degraded by stra i n E M B w it h i n 21h .A dditi ona ll y ,t he concentrati ons o fM C RR andM C LR i n the w ater bloo m sa m ple fro m the T a i hu Lake decreased to the standard o f sa fe dri nki ng wa ter by app l y i ng stra i n E M B for 2w eeks .The strai n E M B w as i dentified as Bacillus sp .wh i ch w as the c l o sest to the B.sub tilis B FS06in t he phy log en i c tree by mo rpho l og ica l and phys i o l og ica l prope rti es and 16S rDNA sequence analysis .K ey word s : m i crocy sti n ;B acillus ;biodegradation ;16S r DNA水体富营养化可导致蓝藻水华暴发,铜绿微囊藻水华是淡水水体中危害最严重的一类[1],其产生的微囊藻毒素(M icrocystins ,M Cs)能抑制蛋白磷酸酶1和2A 的活性,导致肝损伤、诱发肝癌[2]。
微囊藻毒素提取及其生物降解研究
---------------------------------------------------------------范文最新推荐------------------------------------------------------ 微囊藻毒素的提取及其生物降解研究水质下降、水体环境污染和富营养化问题日趋严重，特别是蓝藻水华问题在淡水湖泊的频繁爆发，已引起全球的关注。
在蓝藻死亡后，其细胞裂解，并向环境介质中释放多种不同类型的微囊藻毒素(MCs)，对人类产生危害。
因此需要建立快速、灵敏、稳定、高效的方法对环境介质中的微囊藻毒素进行定性、定量分析。
同时，需要进一步研究其生物降解机理，对已爆发蓝藻问题的水域进行治理。
本论文在比较有关研究蓝藻、微囊藻毒素研究的基础上，进一步验证和探究微囊藻毒素MC-LR的提取、纯化以及分析检测条件。
优化了固相萃取(SPE)结合高效液相色谱法(HLPC)分析水中的MC-LR的方法，主要确定了20%的甲醇为淋洗液、含有0.06%三氟乙酸(THF)的纯甲醇为洗脱液的MC-LR的SPE提取条件。
并初步探究了漆酶、锰过氧化物酶对不同浓度MC-LR的降解作用。
8110关键词微囊藻毒素、固相萃取、高效液相色谱、锰过1 / 15氧化物酶TitleStudy on the extraction and biodegradation of microcystinsAbstractThe deterioration of water quality,serious environmental pollution and eutrophicationof water, especially the high frequency of algal bloom in freshwater lakes, has attractedglobal attention. After the death of the cyanobacteria, the cells split and release varioustypes of microcystins (MCs) to the environmental media, which are harmful to humanbeings. Therefore, it’s needed to establish a rapid, sensitive, stable and efficient method---------------------------------------------------------------范文最新推荐------------------------------------------------------for qualitative and quantitative analysis of MCs in environmental media. At the sametime, a furtherstudy on itsbiodegradation mechanism is required, which is used forcontrolling algal bloom in lakes.On the foundationof the studies available on cyanobacteria and MCs,the3.3.2实验仪器133.2.3MC-LR的分析检测. 133.4漆酶对MC-LR的降解153.4.1实验材料153 / 153.4.2降解实验153.5锰过氧化物酶对MC-LR的降解16 3.5.1实验材料163.5.2降解实验164结果与讨论..164.1淋洗液浓度的选择. 164.2洗脱液浓度的选择. 184.3三氟乙酸(THF)浓度的选择.. 194.4漆酶对不同浓度的MC-LR的降解.. 19 4.5MnP对不同浓度的MC-LR的降解. 20 结论22---------------------------------------------------------------范文最新推荐------------------------------------------------------ 致谢23参考文献..241绪论近些年来，由于许多自然和人为因素的影响，排入湖库的氮、磷等营养物质不断增加，致使水体富营养化状况加剧，进而导致各地水体蓝藻水华的暴发越来越频繁，规模也越来越大。
一株降解微囊藻毒素菌种的鉴定及其活性研究
ｆｒ ｈ ｉ ｅｒｄｔ ｎｏ ｓｂ ｒｉ ， ｎ ｅｂｏｅ ｒｄｔ ｎｒｔ ｆ ｃｏｙｔ －Ｒ（ － ｇ ａｄｍｉ ｏｙｔ － ｏ ｅｂｏ ｇａａｉ ｆ ｔ ｄ ｏ ＭＣ ｙｓ ａ Ｍ９ ａ ｄｔ ｉｄｇａａｉ ｅ ｏ ｒｃ ｓｎＲ ＭＣ ｇ ） ｎ ｃｃ ｓｎ ｔ ｎ ｈ ｏ ａ ｓ ｍｉ ｉ ｒ ｉ Ｌ （ －Ｒ ｎ ４ ｈ ｗｅｅ７ ． ａｄ ８ ．％，ｒｓｅｔ ｅ ．（ ４ Ｓ ４ｗ ｓｔｅ ｂｓ ｎ ｒｇ ｎ ｓｕｃ ｒｓａｎ Ｍ９ Ｒ ＭＣ Ｌ ）ｉ ８ ｒ ０ ％ ｎ ４ Ｏ １ ｅｐｃｉ ｌ ＮＨ ） Ｏ ａ ｈ ｅｔ ｉｏ ｅ ｏ ｒｅ ｆ ｔ ｉ ｖｙ ２ ｔ ｏ ｒ
ｂｏ ｅ ｒｄ ｔ ｎ ａ ｔ ｉ ｆ ｍｉ ｏ ｙ ｔ ｓ（ ｓ ｙ ｓ ａ ｒ ｉ ｅｔ ａｅ ． Ｈ ． Ｗ ｈ ｅｔ ｖ ｌ ｏ ｈ ｉｄ ｇａ ａ ｏ ｃｉ ｔ ｏ ｃ ｃ ｓ ｎ ＭＣ ）ｂ ｔ ｉ Ｍ９ ｗｅｅ ｎ ｓ ｇ ｔｄ ｐ ７０ ａ ｔｅ ｂ ｓ ａｕ ｆｒ ｔｅ ｉ ｖｙ ｒ ｉ ｒｎ ｖ ｉ ｓ ｅ
ｈ ｄ ａ９ ％ ｓｍｉ ｒｔ ｕ ｔｉ ｉ ｓ ｎ ｉ Ｔ ｅｅ ｅ ｔ ｏ Ｈ， ｄ ｉｉｎ ｌ ａｂ ｎ ａ ｄｎ ｔｏ ｅ ｏ ｒ ｅ ， ｄ ｍｅ ａ ｎ ｎ ｔ ｅ ａ ９ ｉ ｌ ｉ ｔ ｋ ｒｈ ａｇ ｂ ｏ ｉ． ｈ ｆ ｃｓ ｆ ａ ｙ ｏ ｐ ａ ｄ ｔ ａ ｒ ｏ ｎ ｉ ｇ ｎ ｓ ｕ ｃ ｓ ａ ｔ ｌ ｏ ｓ ｏ ｏ ｃ ｒ ｎ ｉ ｈ
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中国环境科学 2011,31(1)：116~122 China Environmental Science 一株降解微囊藻毒素菌种的鉴定及其活性研究吴涓*,钟升,王光云,李玉成(安徽大学生命科学学院,安徽合肥 230039)摘要：从巢湖水体中分离出一株能够降解微囊藻毒素(MCs)的菌株M9,通过生理生化实验以及16S rDNA序列比对和序列分析,表明该菌株16S rDNA的全序列与吉氏库特菌kurthia gibsonii的相似性达99%.研究了pH值、外加碳源、氮源以及金属离子对菌株M9降解MCs 活性的效应,发现菌株M9降解MCs的最适pH值为7.0.乙醇可显著提高MCs的降解活性,在48h内对微囊藻毒素RR(MC-RR)和微囊藻毒素LR(MC-LR)的降解率分别达到70.0%和81.4%.以硫酸铵为氮源时该菌株对MC-RR和MC-LR的降解率最高,分别为70.4%和80.9%.金属离子Cu2+、Zn2+和Mn2+对菌株M9降解MCs有明显的促进作用,48h时MC-RR和MC-LR的降解率分别达到了85%和93%以上;而Fe3+和Mg2+对降解过程的促进作用不如Cu2+、Zn2+和Mn2+.关键词：微囊藻毒素；鉴定；16S rDNA；生物降解；活性中图分类号：X172 文献标识码：A 文章编号：1000-6923(2011)01-0116-07Identification and activity of a bacterial strain for the biodegradation of microcystins. WU Juan*, ZHONG Sheng, WANG Guang-yun, LI Yu-cheng (School of Life Science, Anhui University, Hefei 230039, China). China Environmental Science, 2011,31(1)：116~122Abstract：A microcystin-degrading bacterial strain M9 isolated from Chaohu Lake was identified by physiological- biochemical characteristics and homology analysis of 16S rDNA gene sequence. BLAST sequence analysis showed that it had a 99% similarity to kurthia gibsonii. The effects of pH, additional carbon and nitrogen sources, and metal ions on the biodegradation activity of microcystins (MCs) by strain M9 were investigated. pH7.0 was the best value for the biodegradation of MCs by strain pared with glucose and glycerol, ethanol was found to be a better carbon source for the biodegradation of MCs by strain M9, and the biodegradation rates of microcystin-RR(MC-RR) and microcystin- LR(MC-LR) in 48h were 70.0% and 81.4%, respectively. (NH4)2SO4 was the best nitrogen source for strain M9 comparing with other nitrogen sources, and the biodegradation rates of MC-RR and MC-LR in 48h were 70.4% and 80.9%, respectively. It was shown that the biodegradation of MCs could be increased with Cu2+, Zn2+ and Mn2+, and the biodegradation rates of MC-RR and MC-LR in 48h were higher than 85% and 93%, respectively. However, obvious acceleration with Fe3+ and Mg2+ for the biodegradation of MCs was not observed.Key words：microcystins；identification；16S rDNA；biodegradation；activity微囊藻是淡水水体中最常见的一类水华蓝藻,它所释放的微囊藻毒素(MCs)分布最广、危害最严重,对动物和人类健康构成潜在威胁[1].由于MCs具有环状化学结构,具有稳定性高、难降解的特点,因此在常规的水处理工艺中难以有效地去除[2].天然水体和沉积物中均存在着能够降解MCs的微生物[3-4],目前已筛选出一些能够降解MCs的特殊微生物菌种,如纯菌株青枯菌(Ralstonia solanacearum)[5]和食酸戴尔福特菌(Delftia acidovorans)[6-7],铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugiosa)[8]和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)[9].水体中的碳氮[7]、磷[10]、金属离子[6]以及环境温度、水体pH值[11-12]等都会对菌株降解MCs的活性产生重要的影响.徐春霞等[7]发现,以葡萄糖和酵母粉为碳源和氮源时不仅可以获得最大的生物量,而且可以获得最大的降解MCs活性;周洁等[3]发现,外加葡萄糖对培养基中MC-LR的降解具有明显的抑制作用;这表收稿日期：2010-05-14基金项目：安徽省自然科学基金项目(090415203);中石化石油勘探开发研究院项目(WXSWX2008-007)* 责任作者, 副教授, wujuan@1期吴涓等：一株降解微囊藻毒素菌种的鉴定及其活性研究 117明对于不同种类的微生物,上述因素对生物量及菌株降解MCs活性的影响有所差异.而金属离子往往作为酶的辅助因子在生物降解中发挥重要作用[13-14].在前期工作中,本实验室已从巢湖水体中分离获得了12株具有降解MCs能力的菌株,其中降解活性最高的是菌株M9.在此基础上,本研究将通过生理生化实验对菌株M9进行初步鉴定,并进一步采用16S rDNA序列比对的方法对其进行分子鉴定,同时分别研究pH值、外加碳氮源、金属离子等因素对菌株M9降解MCs活性的影响,为采用安全、高效的生物技术消除饮用水源中的MCs污染提供科学依据.1材料与方法1.1实验材料标准品微囊藻毒素RR(MC-RR,分子式:C49H75N13O12,分子量:1038.2)和微囊藻毒素LR (MC-LR,分子式:C49H74N10O12,分子量:995.2)均购自美国Sigma公司,纯度>95%.所用菌株为前期从巢湖水体中分离纯化得到的菌株M9.生物降解实验中所用MC-RR和MC-LR均是从安徽巢湖的水华蓝藻细胞中提取纯化获得,方法如下:将 5.0g巢湖水华蓝藻藻粉加入到50mL 40%甲醇溶液中,经超声波振荡1.0h后,在高速冷冻离心机上离心(12000r/min)10min.去沉淀,将上清液过固相萃取柱(Waters,OASIS TM HLB Cartridge).先用10mL、40%的甲醇溶液过柱清洗吸附于柱上的杂质,再用10mL、80%的甲醇溶液对吸附在柱上的MCs进行洗脱,流速控制在1.0mL/min左右.最后将洗脱液在旋转蒸发仪上于60℃下蒸干,用去离子水溶解残留固体,溶液再经0.45μm滤膜过滤后,保存于冰箱(-18℃)中作为实验用MCs的储备液.经过与标准品MC-RR和MC-LR的HPLC 图谱的比对,以及在200~400nm范围内最大紫外吸收的扫描对比,可确认本实验所提取提纯的化合物就是MC-RR和MC-LR.经初步测定,提取提纯的MC-RR和MC-LR的纯度分别为8.1%和3.9%左右,可以作为降解底物进行筛选降解菌以及降解活性的实验.采用基础培养基[5],添加提取纯化的MCs作为微生物生长的唯一碳源和氮源,其初始pH值为7.5.1.2实验方法1.2.1 菌株M9的生理生化测定将分离纯化的菌株M9进行培养性状和生理生化测定,根据《常见细菌鉴定手册》[15]将其初步鉴定到属.1.2.2菌株M9的分子鉴定细菌基因组与质粒的提取步骤参照文献[16].16S rDNA PCR扩增采用细菌通用引物:A:5'-AGAGTTTGATCCTG- GCTCAG-3'和B:5'-GGTTACCTTGTTACGAC-TT-3'.PCR反应体系(25μL)如下:10×PCR Buffer5μL,MgCl2(25mmol/L)3μL,dNTPs(10mmol/L)1μL,引物A(5pmol/μL)和引物B(5pmol/μL)各1μL,模板DNA(100ng/μL)1μL,TaqDNA聚合酶0.5μL,灭菌双蒸水12.5μL.PCR反应条件:95℃预变性5min,95℃变性1min,55℃退火1min,72℃延伸2min,完成30个循环后,72℃延伸10min.反应结束后,取5μL反应液经1%琼脂糖电泳检测.由上海生工生物工程技术服务有限公司完成对PCR产物的16S rDNA测序,应用BLAST将菌株M9的16S rDNA序列与GenBank核酸序列数据库中已有的数据进行同源性分析.1.2.3菌株M9对MCs的降解实验在150mL三角瓶中配制50mL液体培养基,将富集培养3d的菌液按10%的接种量接种至含MCs的基础培养基中,在30℃、180r/min条件下培养,置于黑暗处防止光降解.每隔6h取样测定培养液的OD600值及MCs的浓度.MCs降解率可用式(1)求得.D(%) = (A0－A)/A0×100%(1) 式中: A0为未接种菌株的空白培养液中MCs的初始浓度;A为接种菌株M9并培养一定时间后的培养液中MCs的浓度;D(%)为生物降解率.在本实验中,生物量以未接种的培养基为参比测定的OD600来表示.1.2.4 MCs的分析测定首先用标准品MC-RR和LR配制浓度分别为0.1,0.2,0.5,1.0,2.0,5.0mg/L的标准溶液,然后根据高效液相色谱(HPLC)图上238nm波长处的峰面积,建立峰面积与标准溶液浓118 中国环境科学 31卷度之间的一元线性回归方程.在不同反应时间,取一定体积的实验样品,经12000r/min,离心10min后,取上清液直接在HPLC(安捷伦1100)上测定其峰面积,代入回归方程即可计算MC-RR和MC-LR 的浓度.测定条件是:流动相60%甲醇+40%水,在水相中含有0.05%的三氟乙酸;流速为1.0mL/min;紫外检测波长为238nm;进样量为20μL.分离柱为WatersμBondapak C18 column(300mm×3.9mm)色谱分离柱.1.2.5 菌株M9降解MCs的活性研究在含有MCs的基础培养基中,分别加入10g/L的葡萄糖、乙醇和甘油作为碳源,以考察不同外加碳源对菌株M9的生长和对MCs降解活性的影响;在培养基中分别添加1g/L的氯化铵、硫酸铵、酵母和尿素,以考察不同外加氮源对菌株M9的生长和对MCs降解活性的影响.实验中以提取提纯的MCs为唯一碳源的培养基作为对照.分别用NaOH和HCl调节基础培养基的pH 值为:5.0,6.0,7.0,8.0和9.0,在其他条件不变的情况下振荡培养菌株M9,以研究pH值对菌株M9的生长和对MCs降解活性的影响.分别配制浓度为10g/L的金属离子Cu2+、Zn2+、Mn2+、Fe3+和Mg2+的储备液,实验时将其分别稀释,使其在基础培养基中的浓度均为1mg/L,以研究可能作为降解MCs酶辅助因子的金属离子对生物降解MCs的效应.实验中以不添加金属离子的培养基为对照.在基础培养基中,均添加提纯的MCs作为微生物生长的唯一碳源和氮源,MC-RR和MC-LR 的初始浓度分别约为40和25mg/L.菌株M9对MCs的降解活性大小以MCs的降解率来表示.采用SPSS14.0统计软件对实验结果进行方差分析.2结果与讨论2.1菌株M9的生理生化特征前期分离纯化得到的菌株M9能够有效地利用MCs作为碳源,对藻毒素有较好的降解效果.该菌株的生理生化特征见表 1.通过鉴定实验,根据《常见细菌鉴定手册》[15]可初步确定菌株M9为吉氏库特菌属.进一步的鉴定将通过以下的16S rDNA序列分析来完成.表1藻毒素降解菌M9的生理生化测定实验结果Table 1 Results of physiological-biochemical tests for microcystin-degrading bacterial strain M9 生化反应实验结果生化反应实验结果生化反应实验结果过氧化氢酶实验 + 柠檬酸盐实验-甘露糖发酵实验-葡萄糖产酸产气实验- 硝酸盐还原实验-木糖发酵实验-淀粉水解实验-乳糖发酵实验-三糖铁琼脂实验-明胶液化实验-蔗糖发酵实验-硫化氢实验-甲基红实验 +麦芽糖发酵实验-吲哚实验-VP测定 +果糖发酵实验－注:“+”表示阳性, “－”表示阴性2.2菌株M916S rDNA的扩增结果及序列测定按照Weisburg的方法[17],以大肠杆菌的16S rDNA序列设计引物,应用PCR技术,以菌株M9的总DNA为模板,扩增其16S rDNA片段.经琼脂糖凝胶电泳,发现1条1.5kbp左右的亮带与理论长度相近.将PCR产物送到上海生物工程技术服务有限公司进行序列对比.从上下游向中间测序,测通16S rDNA片段的全序列,共计1461bp,测序结果已在NCBI注册,序列号lcll52287.将该菌株的16S rDNA序列在GenBank中比较后发现,与之最为接近的前3位菌株分别是kurthia gibsonii strain HC050630C-1(登录号EF611423.1)、kurthia gibsonii strain GC56 (登录号DQ071565.1)、kurthia gibsonii strain FM-2(登录号EE794726.1),均属于吉氏库特菌属,其比对覆盖率均为99%,最大同源性同为99%以上,其中与kurthia gibsonii strain HC050630C-1(登录号EF611423.1)比对后得分最高(2595分).因此,可以1期 吴 涓等：一株降解微囊藻毒素菌种的鉴定及其活性研究 119推测该菌株属于吉氏库特菌属.在有关藻毒素降解菌的报道中,尚未见到与此相同的菌株. 2.3 菌株M9降解MCs 的动力学过程图1显示了菌株M9的生长和降解MCs 的动力学过程.结果表明,24h 时MC -RR 的降解率为24.5%,MC -LR 的降解率为44.1%;24~48h 之间菌株M9仍保持较高的降解能力.至48h 时,MC -RR 的降解率达到33.5%,MC -LR 的降解率达到62.2%.从图1中还可以看出,菌株的生长和对MCs 的降解是同步的.Bourne 等[13]报道,鞘氨醇单胞菌MJ -PV 对MC -LR 的降解不需要MC -LR 的诱导,并推测MJ -PV 中负责催化降解MC -LR 的酶与细胞壁上的肽聚糖循环有关,对MC -LR 的降解是非特异性的.这与本研究的结论是一致的.时间(h)降解率(%)0.00.20.40.60.81.0O D 600图1 菌株M9的生长和对MC -RR 及MC -LR 的生物降解Fig.1 Growth of strain M9 and biodegradation ofMC -RR and MC -LR by strain M92.4 菌株M9降解活性的影响因素2.4.1 pH 值对菌株M9降解活性的影响 由图2可见,当pH 值从5.0增大到7.0时,菌株M9对MC -RR 的降解率从23.5%增大到46.9%,对MC -LR 的降解率从33.0%增大到61.5%.当pH 值从7.0增大到9.0时,菌株M9对MC -RR 的降解率从46.9%减小为28.9%;对MC -LR 的降解率从61.5%减小为35.2%.因此,该菌降解MC -RR 和MC -LR 的最适pH 值为7.0,当pH 值低于6.0或高于8.0时,MCs 的降解率受到显著的抑制(P <0.01).说明该菌在降解MCs 的过程中对环境的酸碱度有一定的要求,中性条件适合藻毒素的降解.降解率(%)pH 值 图2 pH 值对菌株M9降解MCs 活性的影响Fig.2 Effects of pH on the biodegradation activities ofMCs by strain M9pH 值对于酶促反应来说是非常重要的,pH 值可影响酶分子活性中心上必需基团的解离程度,也可影响底物和辅酶的解离程度,从而影响酶与底物的结合.过酸或过碱的条件可能会使酶蛋白在等电点发生沉淀,而导致酶活性降低[18].由此可推测,本试验中菌株M9在pH6~8范围内表现出对MCs 较高的降解活性,可能是因为所分泌的降解酶在此pH 范围内能更好地发挥作用.苑宝铃等[19]发现,一株假单胞菌M -6的胞内酶粗提液在降解MC -LR 的过程中,其酶促反应受环境pH 值的影响非常显著,在pH6~8范围内降解率最高,pH 值小于6或大于8时降解效果不理想,与本试验结果较为相似.2.4.2 碳源对菌株M9降解活性的影响 在微生物培养中,葡萄糖是最容易被利用的碳源之一,且乙醇和甘油也为微生物代谢中常见的代谢中间产物之一,其价格也较便宜.因此,为提高菌株M9对藻毒素的降解能力,在不添加其它氮源的条件下,在含有MCs 的基础培养基中分别添加10g/L 的葡萄糖、乙醇和甘油作为外加碳源,考察它们对该菌株生长及降解活性的影响,结果如图3所示.120中 国 环 境 科 学 31卷O D 600时间(h)图3 不同碳源对菌株M9生长的影响Fig.3 Effects of different carbon sources on the growth ofstrain M9研究显示,和对照相比,加入葡萄糖后,菌株M9的生长明显受到抑制,生物量急剧下降(P <0.01),同时也发现培养基pH 值由原先的7.0降为 4.0.这表明葡萄糖不利于该菌株的生长.而在培养基中添加乙醇时,对菌株M9的生长只是略有促进,且生物量在24~60h 之间可保持较高水平,但甘油则不利于该菌株的生长.由图4可见,与对照相比,葡萄糖的加入反而使该菌降解藻毒素的活性下降(P <0.01).试验已证实酸性环境不利于藻毒素的降解,因此这里降解活性的下降与培养基pH 值的降低、微生物生长不良等因素有关.周洁等[3]也发现,外加葡萄糖对培养基中MC -LR 的降解具有明显的抑制作用,这是由于该菌在利用葡萄糖作为碳源的过程中,产生了某些酸性物质的积累,导致培养基pH 值降低,从而抑制了降解菌的生长及活性.而乙醇和甘油的加入对该菌降解藻毒素则有明显的促进作用,特别是乙醇.在用乙醇为外加碳源时,菌株M9在48h 时对MC -RR 和MC -LR 的降解率分别达到70.0%和81.4%,降解率比未添加乙醇时有较大幅度的提高.究其原因,一是菌株M9在利用乙醇的代谢过程中,环境pH 值没有像添加葡萄糖时那样发生大幅度的变化;二是可能在代谢过程中产生了可以促进藻毒素降解酶分泌的物质,或是MCs 的降解产物与添加的碳源物质的代谢产物之间发生了协同作用;三是可能由于共代谢和碳源优先利用等作用[3,20].有关藻毒素降解机理的研究将在今后的工作中进一步展开.对照葡萄糖乙醇 甘油20406080降解率(%)不同碳源图4 不同碳源下菌株M9降解MCs 的活性 Fig.4 Biodegradation activities of MCs by strain M9cultured by different carbon sources0O D 600时间(h)图5 不同氮源对菌株M9生长的影响Fig.5 Effects of different nitrogen sources on the growthof strain M92.4.3 氮源对菌株M9降解活性的影响 在不添加其它碳源的条件下,在含有MCs 的基础培养基中添加不同的含氮化合物作为菌株M9生长的氮源.结果显示(图5),与不加入氮源的对照相比,所添加的4种氮源对该菌株的生长都有不同程度的促进作用,特别是添加酵母粉和尿素时,它们对菌株M9生长的促进作用更为明显.这表明菌株M9可以利用这些含氮化合物作为支持其生长的氮源.但图6表明,氯化铵和硫酸铵对MC -RR 和MC -LR 的降解有显著的促进作用,而酵母粉和尿素对MC -RR 和MC -LR 的降解则1期 吴 涓等：一株降解微囊藻毒素菌种的鉴定及其活性研究 121没有很明显的促进作用.对照 氯化铵 硫酸铵酵母粉尿素降解率(%)不同氮源图6 不同氮源下菌株M9降解MCs 的活性 Fig. 6 Biodegradation activities of MCs by strain M9cultured by different nitrogen sources由于MCs 是一种含氮有机物,属于单环多肽化合物,其生物降解一般要经过开环、肽键的断开和羧基、氨基的脱除等历程[20].如果培养基中除了藻毒素以外未添加任何其他含氮化合物,那么微生物通常是通过对藻毒素的降解而获得氮源;但在添加其他含氮化合物时,微生物可能优先从这些容易利用的含氮化合物而不是从藻毒素中获得氮源,因此菌株M9的生长得到了促进.氯化铵和硫酸铵属于无机氮化合物,酵母粉和尿素属于有机氮化合物,本研究表明,菌株M9对无机氮化合物利用得更快.当这些容易利用的营养物质即外加的无机氮化合物很快被消耗完时,菌体的生长量比较大,在巨大的生存竞争条件下,大量的MCs 即被作为碳氮源降解利用.因为MCs 的分子结构与蛋白胨中的环状寡肽相类似,微生物会像利用蛋白胨中寡肽的方式降解MCs,为机体的正常生长提供必要的物质和能量[14].而与无机氮化合物相比,可能微生物对酵母粉和尿素的代谢较为缓慢[21].因此,最终表现出氯化铵和硫酸铵对MCs 的降解有显著促进作用,而在相同时间下,酵母粉和尿素对MCs 的降解则没有很明显的促进作用.其中以硫酸铵为氮源时,该菌对MC -RR 和MC -LR 的降解率分别为70.4%和80.9%,与对照相比分别提高了25.4%和23.6%.陈彩云等[12]在研究假单胞菌M -6降解藻毒素的酶作用机理时发现,主要有3种酶参与反应,且这3种酶都是细胞本身所含有的组织酶,为非诱导性酶类.而本研究表明,生长于不同碳源和氮源上的菌株M9仍对MCs 表现出降解活性,也说明其产生降解MCs 的酶并不需要MCs 的诱导. 2.4.4 金属离子对菌株M9降解活性的影响 在含有MCs 的基础培养基中分别添加不同的金属离子Cu 2+、Zn 2+、Mn 2+、Fe 3+和Mg 2+,考察金属离子对菌株M9降解MCs 活性的影响(此时不添加其它碳氮源).由图7可以看出,与不加金属离子的对照相比,Cu 2+、Zn 2+和Mn 2+对菌株M9降解MCs 的过程有明显促进作用,48h 时对MC -RR 和MC -LR 的降解率分别达到85%和93%以上.而Fe 3+和Mg 2+虽有促进作用但其效果不如Cu 2+、Zn 2+和Mn 2+的促进作用那样明显.对照Cu Zn Mn Fe Mg20406080100降解率(%)金属离子图7 金属离子对菌株M9降解MCs 活性的影响 Fig. 7 Effects of metal ions on the biodegradationactivities of MCs by strain M9Bourne 等[13]发现,至少有3种酶参与了MC -LR 的代谢过程,其中第1种酶是微囊藻毒素酶,是包含336个氨基酸残基的金属酶;第2种酶是青霉素结合酶家族,包含402个氨基酸残基;第3种酶是包含507个氨基酸残基的金属酶.而且在鞘氨醇单胞菌催化降解MC -LR 的3种酶中,负责催化第1步和第3步反应的酶都是金属酶-激活酶,都需要金属离子Zn 2+[14].周洁等[6]对食酸戴尔福特菌USTB04生物降解MCs 的活性进行122 中国环境科学 31卷了研究,发现Mn2+对MCs的降解过程有促进作用,而Zn2+和Cu2+对MCs的降解有一定的抑制作用.因为酶催化降解MCs的机理可能因菌种而异,所以由本实验结果可推测,菌株M9催化降解MC-RR和MC-LR的酶不同于其他菌所产生的降解酶,或可能与Cu2+、Zn2+、Mn2+等离子有关,其机理有待于进一步研究.3结论3.1 从发生水华的巢湖水体中分离获得具有显著降解MCs能力的菌株M9,通过生理生化特性以及16S rDNA进行同源性比较,鉴定该菌株属于吉氏库特菌属(kurthia gibsonii).3.2pH对菌株M9降解MCs活性的影响较为显著,该菌株降解MCs的最适pH值为7.0.3.3菌株M9能以MCs作为碳源和氮源进行生长,而且其生长和对MCs的降解是同步的.3.4与葡萄糖和甘油相比,乙醇是菌株M9降解MCs的最适碳源,48h时该菌株对MC-RR和MC-LR的降解率分别达到70.0%和81.4%,降解率比未添加乙醇时有较大幅度的提高.与酵母粉和尿素相比,氯化铵和硫酸铵是菌株M9降解MCs的最适氮源,其中以硫酸铵为氮源时该菌对MC-RR和MC-LR的降解率分别为70.4%和80.9%,与对照相比分别提高了25.4%和23.6%.3.5金属离子Cu2+、Zn2+、Mn2+对菌株M9降解MCs有明显的促进作用.48h时该菌株对MC-RR的降解率均接近88%,对MC-LR的降解率均达到93%以上.参考文献：[1]王伟琴,金永堂,吴斌,等.水源水中微囊藻毒素的遗传毒性与健康风险评价 [J]. 中国环境科学, 2010,30(4):468-476.[2]Lambert T W, Holmes C F B, Hrudey S E. 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