柱层析、固相萃取和制备色谱共56页文档
柱色谱分离实验PPT精选文档
•干法：10g 硅胶 +乙醇
•先用乙醇 后用水
•操作
•组分颜色
装柱
加样 洗脱
收集
鉴定
•1mL样品
•加样操作 •0.5mL×2乙醇洗涤
•组分颜色
35
仪器和试剂
• 1.仪器 • 锥形瓶、玻璃漏斗、色谱柱 • 2.试剂 • 柱层析硅胶、脱脂棉、乙醇（95%）甲
柱色谱 Column Chromatography
1
一、实 验 目 的
了 解：
1. 柱色谱法分离有机物的原理。 2．固定相和流动相的选择原则。
掌 握：
1. 色谱柱的填充方法。 2．柱色谱分离的基本操作。
2
色谱法简介
色谱法亦称色层法， 层析法等，是分离，纯化 和鉴定有机化合物的重要 方法之一，还可定量分析。
•组分颜色
22
三、实 验 内 容
装柱 干法装柱 湿法装柱
吸附剂装填紧密，排除 气泡。最终应使吸附剂的上 端平整，无凹凸面，无断层。
装柱
23
• 装柱时应该注意均匀，不能有气泡，裂缝 ，否则样品可能顺缝隙流动而不吸附，影 响样品的分离，应用质软的物体如吸耳球 等轻轻敲击柱身，促使吸附剂装填紧密， 排除气泡。最终应使吸附剂的上端平整， 无凹凸面．
1/2） • （3）填吸附剂：称取10g 硅胶于小烧杯中 ,加入 15mL 蒸馏水 ,用玻
璃棒调好通过漏斗慢慢装入玻璃柱, 使其逐渐沉入底 部。用洗耳球敲打柱身使硅胶装填紧密，打开活塞，用小锥型 瓶承接, 控制滴速为1 滴／秒,装完后在上面加一层脱脂棉（ ，操作时要注意吸附剂始终不能露出液面）。
38
•（1）向柱内加入95%乙醇溶液洗脱（可以通过注射器沿管壁或安 装滴液漏斗）在恒压或加压条件下进行洗脱。控制流出速度1滴/秒 。逐渐出现色层带分离。 •（2）第一色层带到达色谱柱底部时，立即用锥形瓶收集第一色层 的溶液，直到其完全被洗出。【注意】洗脱时切勿使溶剂流干！ •（3）然后，改用水溶液作为洗脱剂，当第二色层带到达色谱柱底 部时，立即收集第二色层的的溶液，直到其完全被洗出。 •（4）用量筒分别量取所分离出来的两种溶液的体积后，倒入指定 的回收瓶中。 •（5）分离结束后，应先让溶剂尽量流干，然后倒置，用吸耳球从 活塞 向管内挤压空气，将吸附剂从柱顶挤压出。使用过的吸附剂倒 入垃圾桶里。
固相萃取技术的原理和步骤
固相萃取技术原理及应用一、固相萃取基本原理与操作1、固相萃取吸附剂与目标化合物之间的作用机理固相萃取主要通过目标物与吸附剂之间的以下作用力来保留/吸附的1）疏水作用力：如C18、C8、Silica、苯基柱等2）离子交换作用：SAX, SCX，COOH、NH2等3）物理吸附：Florsil、Alumina等2、p H值对固相萃取的影响pH值可以改变目标物/吸附剂的离子化或质子化程度。
对于强阳/阴离子交换柱来讲，因为吸附剂本身是完全离子化的状态，目标物必须完全离子化才可以保证其被吸附剂完全吸附保留。
而目标物的离子化程度则与pH值有关。
如对于弱碱性化合物来讲，其pH值必须小于其pKa值两个单位才可以保证目标物完全离子化，而对于弱酸性化合物，其pH值必须大于其pKa值两个单位才能保证其完全离子化。
对于弱阴/阳离子交换柱来讲，必须要保证吸附剂完全离子化才保证目标物的完全吸附，而溶液的pH值必须满足一定的条件才能保证其完全离子化。
3、固相萃取操作步骤及注意事项针对填料保留机理的不同（填料保留目标化合物或保留杂质），操作稍有不同。
1）填料保留目标化合物固相萃取操作一般有四步（见图1）：Ø 活化---- 除去小柱内的杂质并创造一定的溶剂环境。
（注意整个过程不要使小柱干涸）Ø 上样---- 将样品用一定的溶剂溶解，转移入柱并使组分保留在柱上。
（注意流速不要过快，以1ml/min为宜，最大不超过5ml/min）Ø 淋洗---- 最大程度除去干扰物。
（建议此过程结束后把小柱完全抽干）Ø 洗脱---- 用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并收集。
（注意流速不要过快，以1ml/min为宜）如下图1:2）填料保留杂质固相萃取操作一般有三步（见图2）：Ø 活化--除去柱子内的杂质并创造一定的溶剂环境。
（注意整个过程不要使小柱干涸）Ø 上样--将样品转移入柱，此时大部分目标化合物会随样品基液流出，杂质被保留在柱上，故此步骤要开始收集（注意流速不要过快）Ø 洗脱---用小体积的溶剂将组分淋洗下来并收集，合并收集液。
柱层析的分离原理和分离步骤
柱层析的分离原理和分离步骤：
柱层析是一种广泛应用于化学和生物学领域中的分离技术，其基本原理是利用混合物中各组分物理化学性质的差异，如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等，使各组分在固定相和流动相之间进行不同的分配和移动速度，从而达到分离的目的。
在柱层析中，固定相通常是由不溶性基质形成，如硅胶、大孔吸附树脂、聚酰胺等，而流动相则是由溶剂组成。
样品被加到柱子上后，用流动相洗脱，在洗脱过程中，样品中的各组分根据其在固定相和流动相中的分配系数不同，经历多次反复的吸附、解吸、再吸附、再解吸过程，最终实现分离。
柱层析的操作方式主要包括常压分离、减压分离和加压分离，其中，常压分离是最简单的分离模式，适用于大于50-100g的产品，但洗脱时间较长；减压分离可以节省填料的使用量，但由于大量的空气通过填料会使溶剂挥发，且有时易分解的化合物难以得到；加压分离可以加快淋洗剂的流动速度，缩短样品的洗脱时间。
固相萃取柱知识点
固相萃取柱知识点固相萃取柱是一种常用的分离和纯化技术，广泛应用于化学、生物、环境等领域的样品前处理中。
它基于固体相对溶液中溶质有选择性吸附的原理，通过固相材料填充在柱子中，将待分离的物质吸附在固相上，并通过洗脱，实现物质的分离和纯化。
知识点一：固相材料的选择固相材料是固相萃取柱中的关键组成部分，它决定了固相萃取柱的选择性和吸附能力。
常见的固相材料主要包括硅胶、活性炭、聚酸酯、氨基酸、离子交换树脂等。
不同的固相材料对不同的分析物有不同的选择性和亲合性，因此选择合适的固相材料很重要。
知识点二：固相萃取柱的基本原理知识点三：固相萃取柱的工作原理固相萃取柱的工作原理分为两个过程：吸附过程和洗脱过程。
吸附过程是目标物质从液相中被固相材料吸附的过程，吸附程度取决于固相材料的选择性和目标物质与固相材料之间的相互作用。
洗脱过程是用洗脱剂将吸附在固相材料上的目标物质从固相材料上洗脱下来，洗脱程度取决于洗脱剂和目标物质之间的相互作用。
知识点四：固相萃取柱的使用方法固相萃取柱的使用方法通常包括样品预处理、样品加载、洗脱、回收等步骤。
样品预处理包括对样品的前处理，如样品溶解、提取、浓缩等。
样品加载是将预处理好的样品通过固相柱进行加载，使目标物质被固相材料吸附。
洗脱步骤是将洗脱剂通过柱子冲洗，将目标物质从固相材料上洗脱下来。
回收步骤是将洗脱液收集，可进行进一步的分析和检测。
知识点五：固相萃取柱的应用领域固相萃取柱广泛应用于化学、生物、环境等领域。
在化学领域，固相萃取柱常用于样品前处理，如药物分析、环境污染物分析等。
在生物领域，固相萃取柱常用于样品纯化和富集，如蛋白质纯化、DNA提取等。
在环境领域，固相萃取柱常用于水样、土壤样品的前处理和分析。
总结：固相萃取柱是一种常用的分离和纯化技术，通过固相材料与待分离物质的选择性吸附和洗脱，实现样品的分离和纯化。
固相萃取柱的选择和使用方法对于样品处理和分析结果的准确性和可靠性非常重要。
固相萃取技术
在2003版的“食品卫生检测方法”标准系列中，有一个较大的改动就是很多项目，尤其是农药项目的前处理普遍使用了固相萃取技术（详见表1 ）。
现针对这一技术的原理、使用和误区进行探讨。
一．固相萃取技术简介固相萃取（Solid Phase Extraction，简称SPE）技术，发展于上世纪70年代，由于其具有高效、可靠、消耗试剂少等优点，在许多领域取代了传统的液－液萃取而成为样品前处理的有效手段。
一些传统的介绍SPE的书籍将其归于一个液相色谱的原理，这其实是引起使用不当的主要源由之一。
把SPE小柱看作一根液相色谱柱，不如把它看成单纯的萃取剂更合适，因为：液相色谱的重点在于分离，而SPE的重点在于萃取。
固相萃取技术在样品处理中的作用分两种：一是净化，二是富集,这两种作用可能同时存在。
固体萃取和液－液萃取相比，其长处在于方便和消耗试剂少，短处在于批次间的重复性难以保证。
出现这种情况的原因在于：液体试剂的重复性好，只要其纯度可靠，不同年代的产品的物理化学性质都是可靠的。
而固体萃取剂就算保证了纯度外，还存在着颗粒度的差异，外形的差异等液体试剂不存在的且难以衡量的因素，不同年代不同批号的萃取性质可能会有较大的区别。
从理论上和厂家宣传来看，固相萃取应该在色谱分析的前处理上得到很好的应用：有机溶剂用得很少，可批量处理样品，既可富集，又能除杂质，给人印象是前处理的革命性进步。
然而现实情况，起码在国内，虽然推广了多年，实际应用还是相当有限。
SPE应用得不广，与我们的使用方式和期望有关，也与它本身的局限有关。
对于供应商来说，从经济利益出发，向来都是忽略固相萃取的局限与不足。
固相萃取可以作为前处理手段的一个很好补充，但是在使用时，一定要清醒知道到它的优点和缺点，注意因地制宜，扬长避短。
二、固相萃取的应用优势在什么项目的前处理适合使用固相萃取技术，即用固相萃取会比普通的溶剂萃取更理想，个人认为有以下几种情况：（一）水中有机物的前处理。
柱层析法的原理和方法ppt课件
实验案例讨论与经验分享
案例介绍
介绍几个典型的柱层析法应用案例，包括实验设 计、操作过程、结果分析等。
经验分享
分享实验过程中积累的操作技巧、注意事项、故 障排除等方面的经验。
互动交流
鼓励与会者提问、分享自己的实验经验和心得， 进行深入的讨论和交流。
总结与展望
06
柱层析法原理与方法的总结回顾
柱层析法原理
方法 调整流动相的组成和pH值
优化柱温和流速
参数优化的方法和原则
• 选择合适的色谱柱和填料
参数优化的方法和原则
原则 通过实验确定最佳参数组合
根据目标物质的性质和分离要求进行参数优化 注意避免参数变化过大，以免对分离效果造成不利影响
结果分析方法和技术
方法 峰面积和峰高比较法
标准曲线法
结果分析方法和技术
离、纯化和鉴定。
生物样品分析
柱层析法可用于生物样品中痕量 物质的分离和分析，如生物碱、 氨基酸等，提高分析的灵敏度和
准确性。
柱层析法在食品安全检测中的应用实例
01
农药残留检测
柱层析法可用于食品中农药残留的分离和检测，通过合适的填料和洗脱
条件，将农药与食品中的其他成分分离，提高检测的准确性和可靠性。
发展历程
自20世纪初开始，柱层析法逐渐从基础的实验室技术发展为高效、自动化的现 代分离分析方法。
柱层析法的重要性和应用
重要性
柱层析法在化学、生物、医药、环境等领域发挥着重要作用 ，为复杂混合物的分离和纯化提供了有效手段。
应用
药物研发、天然产物提取、环境监测、食品安全等领域广泛 应用柱层析法。
柱层析法的基本原理
实验操作和案例分
05
析
色谱分析—柱色谱(分析化学课件)
柱色谱应用
（五）分子排斥色谱 （size- exclusion chromatography） 原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝
胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通 过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外 ，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。
全部在死体积前出峰； 可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按 质量分离。
柱色谱应用
（三）离子交换色谱（ion-exchange chromatography） 原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应； 固定相：阴离子或阳离子离子交换树脂； 流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子 交换树脂作固定相，采用碱性水溶液； 阳离子交换：R-SO3H+M+ =R-SO3 M+H + 阴离子交换：R-NR4OH+X-=R-NR4 X+OH应用：离子、可离解的化合物、氨基酸和核酸等。
柱色谱应用
1.吸附剂 吸附剂为多孔性微粒物质。常用的有硅胶、氧化铝、聚酰胺和大孔吸附树脂等。 需满足以下条件： ❖具有较大的吸附表面和吸附中心； ❖与样品、溶剂和洗脱剂均不发生化学反应； ❖不能被溶剂或洗脱剂溶解； ❖粒度均匀，且有一定的粒度。
柱色谱应用
（1）硅胶 适用于酸性或中性物质 （2）氧化铝 碱性氧化铝 pH 9.0～10.0 适于分析碱性、中性物质 中性氧化铝 pH＞7.5 适于分析酸性碱性和中性物质 酸性氧化铝 pH 4.0～5.0 适于分析酸性、中性物质 （3）聚酰胺 氢键作用，氢键能力↑强，组分越后出柱。 注：吸附剂含水量越大，活性级别越高，吸附活性越低，吸附能力越弱。
柱色谱应用
A
B
C
D
柱色谱应用
固相萃取小柱终极版剖析
主要干扰物
萃取柱
腐殖质
反相柱
碳水化合物、 色素、酚、
有机酸
PSA、NH2 （保留干扰物）
反相柱
阳离子交换柱
阴离子交换柱
固相萃取方法的建立
根据目标化合物的性质选择吸附剂
目标化合物
溶于有机溶剂
溶于水
溶于己烷
溶于甲醇
不可解离
可解离
正相填料
正相填料
反相填料
阳离子
阴离子
Silica Florisil
Carb
反相柱（非极性作用）
如C18、C8、C2、PS、PEP等 吸附剂：非极性或弱极性基团 目标化合物：非极性至中等极性化合物 样品溶液：水或含少量甲醇的水溶液 特点：选择性较差。可从水中吸附目标化合物，如用
于 蛋白质除盐。
固相萃取柱的分类
反相柱通用操作流程
活化/平衡：甲醇活化，纯水或样品溶剂平衡 上样：样品溶液 淋洗：纯水、甲醇水溶液或样品溶液淋洗 洗脱：含适量有机溶剂的水溶液、甲醇或极性更低的
DNA分离，蛋白质除盐
固相萃取存在的问题
流速问题
流速过快降低目标化合物的回收率 过慢降低工作效率，增加杂质吸附机率
回收率问题
活化：活化溶剂选用不当或量太少 上样：柱容量不够，填料不合适 洗脱、淋洗：溶剂选择不当
污染问题
生产不当造成 污染
固相萃取的前景展望
应用领域不断扩大
生命科学、工业产品、无机检测
有 机溶剂
溶剂体系极性：样品溶剂>淋洗溶剂>洗脱溶剂
固相萃取柱的分类
正相柱（极性作用）
如NH2、Florisil、Silica、PSA等 吸附剂：强极性基团 目标化合物：中等极性到强极性 样品溶液：非极性至中等极性
固相萃取柱原理及应用
❖ 淋洗(Washing)：上样后，部分干扰物与目标化合物同时被保留，需要加入合适的溶液以 最大可能地除去干扰物而不影响目标化合物的保留，通常情况下用上样时的样品溶剂淋洗 不会影响回收率，但洗脱强度较大的溶剂能最大程度地去除干扰物，选择淋洗液时需要在 回收率和净化效果间找到平衡点；
非极性相互作用(Non-Polar Interaction)
❖ 非极性相互作用是指发生在(吸附剂上)烃基和 (目标化合物上)烃基之间的作用力，这类基团 呈现非极性或弱极性，它们之间仅存在一种 名为“色散力”的作用力(属于 Van Der Waals力的一种)。由于绝大多数有 机化合物分子均含有或多或少的非极性基团， 非极性相互作用会使这些化合物保留在含有 非极性官能团的吸附剂上。
❖ 极性相互作用(Polar Interaction)：目标化合物上的极性官能团与吸附剂 上的极性官能团之间的作用力，这种作用力在弱极性或非极性溶剂环境 下才能较好的体现；
❖ 离子相互作用(Ion Interaction)：离子型目标化合物上的离子官能团与吸 附剂上带有相反电荷的官能团之间的库伦力；
❖ 次级相互作用(Secondary Interaction)：对于反相硅胶键合吸附剂，颗粒 表面残余的硅羟基会与极性化合物发生极性相互作用，并且部分硅羟基 解离后会与碱性化合物发生离子相互作用，相对于非极性相互作用这些 作用力处于次要地位，因而被称为次级相互作用。次级相互作用是反相 硅胶吸附剂所不期望的，通常可以通过封端技术(Endcaping)加以消除；
❖ 洗脱(Elution)：让洗脱能力较强的溶剂通过吸附剂，打断吸附剂与被保留的化合物之间的 作用力，使这些化合物随溶剂从吸附剂中流出；通常情况下，能刚好洗脱目标化合物的洗 脱溶剂是最佳选择，此时洗掉的干扰物最少，选择洗脱液时也需要在回收率和净化效果间 找到平衡点；
固相萃取技术上
洗脱
分析物
第42页/共67页
第三节 固相萃取装置
固相萃取的基本装置包括固相萃取柱和固相萃取过滤装置。固相萃取柱是整个固相萃取装置的核心。
第43页/共67页
（1）固相萃取柱
第44页/共67页
常见固相提取小柱的构造
第45页/共67页
SPE 产品常见形式
第46页/共67页
第3页/共67页
固相提取技术
Solid Phase Extraction (SPE)
色谱填料颗粒填装小柱1978年由Waters首次推出商品化产品：
“Sep-Pak Cartridges”Sample Enrichment & Purification非常成熟的技术数千化合物的参考文献
第4页/共67页
第16页/共67页
分离模式
正相萃取 （非极性液体相，极性改良固体相） 亲水性相互作用极性—极性相互作用氢键π-π相互作用偶极－偶极相互作用偶极－诱导偶极相互作用 极性键合相，如硅胶键合－NH2、－CN，-Diol（二醇基）；极性吸附剂，如Silica、Florisil、(A-,N-,B-)alumina、硅藻土等，可以从强极性的溶剂中吸附是非极性到中等极性的化合物。
第21页/共67页
分离模式
反相吸附原理离子交换原理
复合模式
第22页/共67页
2、操作步骤
固相提取技术的基本要求：样品必须呈液态驱动力(Driving Forces)－操作方式重力压力真空
第23页/共67页
固相提取技术的基本要求
样品必须呈液态驱动力(Driving Forces)－操作方式重力压力真空
溶剂极性图
反相溶剂洗脱强度
第13页/共67页
薄层色谱和柱层析资料
用单一溶剂为展开剂时，由于溶剂组分简单，分离重现性好，对 于难分离的化合物经常要用二元、三元甚至多元溶剂组成的展开剂。 在混合展开剂中占比例大的主要溶剂起溶解物质和基本分离的作用， 比例较小的溶剂起调整改善分离物质的Rf值及对某些物质的选择作用。 一般主要溶剂选用不易形成氢键的溶剂，或极性比分离物质低的溶剂， 否则将使被分离物质的Rf值太大或甚至跟随溶剂前缘移动。
薄层固定相
• 按照固定相的种类，薄层板可分为正相薄层板（如硅 胶薄层板、聚酰胺薄层板）、反相薄层板（如C18键合 相薄层板）等。
• 硅胶薄层板是目前使用最广的薄层板，有硅胶G板、 硅胶GF254板、硅胶H板和硅胶HF254板等规格。
• 高效薄层板（HPTLC，High Performance TLC）所使 用的固定相较普通薄层板平均粒度小，颗粒分布范围窄， 因此在相对短的展开距离中可以达到更好的分离效果。
chrome意为“色彩”，graphy源自希腊文，“写”。色谱为 层析的同义语，都是从英语chromatography译来的。
茨维特色谱图 （1906）
叶绿素的石油醚溶液流经
装有CaCO3的柱子，然后 用石油醚淋洗.
CaCO3对叶绿素各成分吸 附能力不同，而分离成为
色带.
叶绿素 叶绿素
叶黄素'， " 斑点直径一般
不超过0.5cm。
0.5 cm 展开剂浸入高度
起跑线 15-18 cm
前 沿
5 cm
线
2 cm
薄层板示意图
展开
选择大小适合的展开容器，将点有样品的薄层 板放入容器内的展开剂中，浸入深度以展开剂液面 距点样基线5mm为宜，密闭，展开。一般上行展开 8-15cm，高效薄层板上行展开5-8cm。在溶剂前沿 达到预定展距后，取出薄层板，晾干，待检测。
柱层析文档——精选推荐
柱层析柱层析操作方法的选择柱层析，又称柱色谱分离,是利用层析柱将混合物各组分分离开来的操作过程称为柱层析。
柱层析是层析技术中的一类，依据其作用原理又可分为吸附柱层析、分配柱层析和离子交换柱层析等。
其中以吸附柱层析应用最广。
以下只介绍吸附柱层析的相关问题。
目前,柱色谱分离的操作方式 ,主要包括常压分离、减压分离和加压分离 3种模式。
常压分离是最简单的分离模式方便、简单 ,但是洗脱时间长。
减压分离尽管能节省填料的使用量,但是由于大量的空气通过填料会使溶剂挥发 ,并且有时在柱子外面会有水汽凝结,以及有些易分解的化合物也难以得到 ,而且还必须同时使用水泵或真空泵抽气。
柱子规格的选择市场上有各种规格的柱层析分离柱。
柱子长了 ,相应的塔板数就高 ,分离就好。
目前市场上的柱子 ,其径高比一般在1: 5～15范围 ,在实际使用时 ,填料量一般是样品量的30～50倍,具体的选择要根据样品的性质和含量进行具体分析。
如果所需组分和杂质的分离度较大 ,就可以减少填料量,如果 Rf相差不到0.1,就要加大柱子,增加填料量。
装柱柱层析色谱柱的填装主要有湿法和干法两种,湿法省事,一般用淋洗剂溶解样品,也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等,但溶剂越少越好,不然溶剂就成了淋洗剂了。
柱子底端的活塞一定不要涂润滑剂,否则会被淋洗剂带到淋洗液中 ,可以采用聚四氟乙烯材料的阀门。
另一种是将玻璃管下端拉细，套上一段弹性良好的管子。
这段管子必须是不能被淋洗剂溶解的，普通橡皮管一般不可充作此用，因为橡皮易被氯仿、苯、THF等溶剂溶胀，而聚乙烯管子对大多数溶剂是惰性的，所以常常使用。
干法和湿法装柱没什么实质性差别,只要能把柱子装实就行。
装完的柱子应该有适度的紧密(太密了淋洗剂流速太慢) ,并且一定要均匀,不然样品就会从一侧斜着流动。
同时柱中不能有大气泡,大多数情况下有些小气泡没太大的影响,因为只要加压气泡就可消失。
但是柱子更忌讳的是开裂 ,开裂会影响分离效果 ,甚至报废。
柱层析、固相萃取和制备色谱
制备HPLC概述—分离效能
取决于分离速度、分辨率和上样量。对某一个 分离参数进行优化常会影响到其他分离参数。
分辨率 速度
载样量
增加洗脱液流速会降 低分辨率，分辨率也 会因上样量过大而下 降。但分辨能力并不 总是制备HPLC首要考 虑的因素，制备型 HPLC应首先具有经济、 快速的生产所需产品 的能力。
大样品量的 纯化方法
分析系统的放大: 使用直径更大的制备柱、 更高的流速，根据色谱柱的长度增加进样量 并保持样品浓度不变，峰形尖锐而对称。需 大型的色谱柱和大量的溶剂来分离较少的样 品，不经济
色谱柱超量载样：相同的条件下超量进样
浓缩法和 体积超载法
26
制备HPLC的首要 问题是快速、 高效的制备色 谱纯的产品！！
固相萃取所需 时间为液－液 萃取的1/2， 费用为液－液 萃取的1/5。
➢ 提高分析质量，减少背景的干扰
➢ 提高了回收率
40
SPE柱
最简单的固相萃取装置就是一根直径为数毫米的小 柱．由医用聚丙烯管，多孔筛板，填料三部分组成。 小柱可以是玻璃的，也可以是聚丙稀﹑聚乙烯﹑聚四氟 乙烯等塑料的，还可以是不锈钢制成的。
1ml 3ml 6ml 12，20或60ml 12，20或60ml 90mm
被萃取样品的质量不超过柱中填料量的5%！！
42
SPE柱及其配套装置
自然淋洗-----简易支架 加正压 -----注射器 加负压 -----真空装置
43
SPE常见填料类型
1.硅胶和键合硅胶 2.高分子聚合物 3.其他吸附型填料，如氧化铝、硅藻土 4.混合型或专用柱系列
• 此外,大量的杂质降低对目标产物分离度,因此限制了进 样量和生产效率. 同时分别用正反相色谱去除前后杂,比 单用一种色谱得到目标产物更简单易行.
固相萃取柱知识点
1、使用阳离子固相萃取柱前为什么要用甲醇和水活化要是使用的是高聚物基质的阳离子柱，可直接上样，不用活化，要是使用的是硅胶基质的阳离子柱，活化是为了打开键合在硅胶上的碳基团链，使之充分发生作用，甲醇是为了与碳链互溶，用水过度是为了能和样品溶液相溶。
2、固相萃取技术原理及应用一、固相萃取基本原理与操作1、固相萃取吸附剂与目标化合物之间的作用机理固相萃取主要通过目标物与吸附剂之间的以下作用力来保留/吸附的1）疏水作用力：如C18、C8、Silica、苯基柱等2）离子交换作用：SAX, SCX，COOH、NH2等3）物理吸附：Florsil、Alumina等2、p H值对固相萃取的影响pH值可以改变目标物/吸附剂的离子化或质子化程度。
对于强阳/阴离子交换柱来讲，因为吸附剂本身是完全离子化的状态，目标物必须完全离子化才可以保证其被吸附剂完全吸附保留。
而目标物的离子化程度则与pH值有关。
如对于弱碱性化合物来讲，其pH值必须小于其pKa值两个单位才可以保证目标物完全离子化，而对于弱酸性化合物，其pH值必须大于其pKa值两个单位才能保证其完全离子化。
对于弱阴/阳离子交换柱来讲，必须要保证吸附剂完全离子化才保证目标物的完全吸附，而溶液的pH值必须满足一定的条件才能保证其完全离子化。
3、固相萃取操作步骤及注意事项针对填料保留机理的不同（填料保留目标化合物或保留杂质），操作稍有不同。
1）填料保留目标化合物固相萃取操作一般有四步（见图1）：Ø 活化---- 除去小柱内的杂质并创造一定的溶剂环境。
（注意整个过程不要使小柱干涸）Ø 上样---- 将样品用一定的溶剂溶解，转移入柱并使组分保留在柱上。
（注意流速不要过快，以1ml/min为宜，最大不超过5ml/min）Ø 淋洗---- 最大程度除去干扰物。
（建议此过程结束后把小柱完全抽干）Ø 洗脱---- 用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并收集。
实验九 柱层析讲解
柱层析原理
流动相流过时各组分会以 不同的速率向下移动，吸附弱 的组分以较快的速率向下移动。 随着流动相的移动，在新接触 的固定相表面上又依这种吸附 溶解过程进行新的分配，新鲜 流动相流过已趋平衡的固定相 表面时也重复这一过程，结果 是吸附弱的组分随着流动相移 动在前面，吸附强的组分移动 在后面，吸附特别强的组分甚 至会不随流动相移动，各种化 合物在色谱柱中形成带状分布， 实现混合物的分离。
柱色谱操作流程---洗脱与接收
? 用不同比例的石油醚和乙酸乙酯进行梯度洗 脱（先用28mL的(2.5:1)混合液，然后用1:1 的洗脱液20mL）
? 先收集黄色带（邻硝基苯胺），如果有交叉， 换接受瓶收集交叉组分。
? 再收集浅黄色带（对硝基苯胺），减压除去 溶剂。（旋转蒸发）
柱色谱操作流程--浓缩
? 显色 分离的化合物若有颜色，很容易识别出来各个样
点。但多数情况下化合物没有颜色，要识别样点， 必须使样点显色。通用的显色方法有碘蒸气显色和 紫外线显色。
①碘蒸气显色：将展开的薄层板挥发干展开剂后， 放在盛有碘晶体的封闭容器中，升华产生的碘蒸气 能与有机物分子形成有色的缔合物，完成显色。
②紫外线显色：用掺有荧光剂的固定相材料（如 硅胶 F，氧化铝 F等）制板，展开后在用紫外线照射 展开的干燥薄层板，板上的有机物会吸收紫外线， 在板上出现相应的色点，可以被观察到。
色谱法须在两相系统间进行。一相是固定相， 需支持物，是固体或液体。另一相为 流动相， 是液体或气体。当流动相流经固定相时，被 分离物质在两相间的分配，由平衡状态到失 去平衡到又恢复平衡，即不断经历吸附和解 吸的过程。随着流动相不断向前流动，被分 离物质间出现向前移动的速率差异，由开始 的单一区带逐渐分离出许多区带，这个过程 叫展层。