常见荧光参比光谱
荧光光谱
2. 内转换: 是指两个电子能级非常靠近以致其振动能级有重叠时，
常发生电子由高能级转移至低能级的无辐射跃迂过程。 3. 系间跨越: 不同多重态间的无辐射跃迁，同时伴随着受激电子 自旋状态的改变，如S1→T1。 4. 外转换：激发分子通过与溶剂或其他溶质分子间的相互作用使
非辐射去激——不伴随发光现象的过程叫非辐射去激，体系内的多余的 能量以热的形式释放。
36
2.3 原理
1. 振动弛豫: 它是指在同一电子能级上，电子由高振动能级转移 至低振动能级的无辐射跃迁过程。
37
振动驰豫
S2
S1 T1
S0 λ1 吸 光 λ2 吸 光
S0
38
2.3 原理
1. 振动弛豫: 它是指在同一电子能级上，电子由高振动能级转移
8
1.2 特点
优点： （1）有较低的检出限，灵敏度高。特别对Cd、Zn等元素有相当低的检 出限，Cd可达0.001ng·cm-3、Zn为0.04ng·cm-3。现已有2O多种元素 低于原子吸收光谱法的检出限。由于原子荧光的辐射强度与激发光源 成比例，采用新的高强度光源可进一步降低其检出限。
45
振动驰豫
S2 内转换
S1
系 间 跨 跃
T1
外转换
S0 λ1 吸 光 λ2 吸 光 λ3 荧 光
S0
46
2.3 原理
2.3.3 辐射方式 磷光： 从第一激发三重态的最低振动能级回到基态所发出的辐射。由 于磷光的产生伴随自旋多重态的改变，辐射速度远小于荧光，磷光寿 命为10-4 ~10s
c.阶跃线荧光
荧光材料光致发光量子效率绝对测量通用检测方法-最新国标
荧光材料光致发光量子效率绝对测量通用检测方法1 范围本文件规定了荧光材料光致发光内/外量子效率绝对测量的通用办法。
本文件适用于荧光光谱范围在紫外、可见与近红外波段（200nm~1100nm），激发光波长范围在紫外和可见波段（200nm~780nm）的固体和液体荧光材料。
2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。
其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 5838.1—2015 荧光粉第1部分：术语3 术语和定义GB/T 5838.1-2015界定的以及下列术语和定义适用于本文件。
内量子效率 internal quantum efficiency荧光材料受到激发时，向空间各方向发出的荧光总光子数与激发光被发光材料吸收总光子数的比值。
[来源：GB/T 39492-2020，3.2，有修改]外量子效率 external quantum efficiency荧光材料受到激发时，向空间各方向发出的荧光总光子数与激发光入射总光子数的比值。
[来源：GB/T 39492-2020，3.1，有修改]样品仓 cell待测样品，参比样品如硫酸钡等的填充用容器，或配有聚四氟乙烯壁套的薄无荧光比色皿。
适于在积分球体凹处或缺处放置，保存试样的平板型器皿，以及分光光度计用器皿的总称。
参比样 reference用于激发光的光谱测定的具有高反射率的白色标准粉末或无色溶剂，白色标准粉末通常选用硫酸钡或氧化铝粉体，对于溶液，选择无荧光的溶剂，该溶剂且适合荧光材料分散。
白色漫反射板 white reflecting plate用于激发光光谱测定，氧化铝，聚四氟乙烯标准白板等高反射率白板。
[来源：GB/T 39492-2020，3.5，有修改]自吸收 self-absorption样品发出的光有部分会被自身吸收。
紫外吸收光谱法及分子荧光光谱
2 n→σ＊跃迁
所需能量较大。吸收波长为150～250nm，大部分在远紫外 区，近紫外区仍不易观察到。
含非键电子的饱和烃衍生物(含N、O、S和卤素等杂原子)
均呈现n→σ * 跃迁。
化合物 H2O
CH3OH CH3CL
CH3I CH3NH2
max（nm） 167 184 173 258 215
max 1480 150 200 365 600
K带红移：165250nm R 带红移: 290310nm
165nm p
R CO
Y
p
RK
R
n
p
p
p
p
np
n
p
p
cc
cO
cO
有机物吸收光谱与电子跃迁
（4）芳香烃及其杂环化合物 苯：
E1带180184nm； =47000 E2带200204 nm =7000
苯环上三个共扼双键的p→p* 跃迁特征吸收带；
H c
c
H
max=162nm
助色基团取代 p → p * （K带) 发生红移。
H
H
取 代 基 -S R -N R 2 -O R -C l C H 3 红 移 距 离 4 5 (n m ) 4 0 (n m ) 3 0 (n m ) 5 (n m ) 5 (n m )
有机物吸收光谱与电子跃迁
（2）共轭烯烃中的 p → p*
生色团与助色团
生色团： 最有用的紫外-可见光谱是由π→π＊和n→π＊跃迁产生的。这
两种跃迁均要求有机物分子中含有不饱和基团。这类含有π键的不 饱和基团称为生色团。简单的生色团由双键或叁键体系组成，如 乙烯基、羰基、亚硝基、偶氮基-N＝N-、乙炔基、腈基-CN等。 助色团：
荧 光 光 谱(
荧 光 光 谱(Fluorescence Spectroscopy)韩荣成(10303023)北京大学,03级生物医学工程一、背景知识：1.荧光，是指物质在吸收紫外光后发出的波长较长的紫外荧光或可见荧光，以及吸收波长较短的可见光后发出波长较长的可见荧光。
除了紫外荧光和可见荧光，还有红外荧光、X射线荧光等。
在很多情况下，分子从激发态回到基态过程中，能量通过热量等形式散失到周围。
但是在某些情况下，能量能以光子发射的形式释放出来。
分子的能量状态在光学分析中涉及的分子能量有：E0=Ee+Ev+Er，其中Ee:价电子运动能（electron）；Ev：原子在平衡位置的振动能（vibration）；Er：分子绕其重心的转动能（rotation）。
Ee 大约为1eV数量级；Ev大约为10－1～10－2 eV ；Er 大约为10－4～10－5eV数量级，可见⊿Ee>⊿Ev>⊿Er分子吸收能量后，处于激发态的分子通过非辐射过程丢失能量，首先到达S1的最低振动能级，这一过程称为内转换（internal conversion）,发生在10－11s内。
从S1的最低振动能级以光子形式放出能量而回到基态的不同振动能级，这一过程称为荧光（fluorescence）,发生在10－9s内；如果以非辐射的形式丢失能量则称为淬灭（quenching）。
如果某种物质在被某种波长的光照射以后能在较长的时间内发出比荧光波长更长的波长的光，则称这种光为磷光。
磷光产生的机制与荧光是不同的，虽然它们都属于发射光谱，但磷光不是处于第一电子激发态的最低振动能级的分子直接释放出光子回到基态的结果，而是从某种能量低于第一电子激发态的最低振动能级的另一种亚稳能级⎯三重态向基态的各振动能级以辐射方式产生跃迁时发出的光。
所谓三重态或三线态，是指分子中电子自旋量子数S=1，即原来两个配对的自旋方向相反的电子之一自旋方向改变，以至电子自旋之和不为0的情况。
x射线荧光光谱
X射线荧光光谱什么是X射线荧光光谱？X射线荧光光谱（X-Ray Fluorescence Spectroscopy, XRF）是一种用于化学元素定性和定量分析的非破坏性分析技术。
它通过测量样品受到激发后发射的X射线能谱来确定样品中的元素组成和相对含量。
X射线荧光光谱利用X射线与物质相互作用的原理进行分析。
当X射线入射到样品表面时，部分X射线将被物质中的原子激发，导致原子内部的电子跃迁。
当激发的电子回到基态时，会释放出能量，形成荧光X射线。
测量荧光X射线的能谱可以确定样品中存在的化学元素种类和含量。
X射线荧光光谱的应用领域X射线荧光光谱在许多领域中得到了广泛的应用，包括但不限于以下几个方面：1. 金属材料分析X射线荧光光谱可以对金属材料进行化学元素分析，包括金属材料的成分分析、纯度检测和杂质检测等。
通过XRF技术，可以快速准确地确定金属材料中各种元素的含量和配比，从而对金属材料的质量进行评估。
2. 矿石和土壤分析矿石和土壤中含有丰富的化学元素，X射线荧光光谱可以用于分析矿石和土壤样品中元素的组成和含量。
这对于矿石勘探、矿石开采、土壤污染监测等具有重要的意义。
3. 环境监测X射线荧光光谱可以用于环境中有害元素的检测和监测，例如水中重金属离子的检测、空气中微量元素的分析等。
这对于环境保护和环境污染治理具有重要的实际应用价值。
4. 文物保护与考古X射线荧光光谱可以用于文物和古代艺术品的非破坏性分析，帮助鉴别文物的材料成分、年代和地域等信息。
此外，X 射线荧光光谱也可以用于考古学中的样品分析，帮助研究人员了解古代文化和历史。
X射线荧光光谱的仪器和测量方法X射线荧光光谱仪通常由X射线源、样品台、能谱仪和数据处理系统等组成。
其中，X射线源用来产生足够的X射线能量去激发样品，样品台用来放置待测样品，能谱仪用来测量荧光X射线的能谱，数据处理系统用来分析并解释测量结果。
测量方法的基本步骤如下：1.样品准备：样品需要经过预处理，例如固体样品需要制成小颗粒或片状，液体样品需要按一定比例加入载体等。
rox参比荧光的作用
rox参比荧光的作用简介r o x参比荧光是生物学研究中常用的一种内参标记物，它具有较强的荧光信号和良好的稳定性，能够在实验中提供可靠的参比标准。
本文将介绍r ox参比荧光的基本原理、应用领域和使用注意事项。
基本原理r o x参比荧光是一种细胞生物学和分子生物学实验中常用的参比标记物。
它属于融合蛋白的一部分，结构稳定，荧光信号强度与目标物之间的变化关系可预测。
ro x参比荧光的基本原理是通过比较目标物与参比物荧光信号的相对强度，来分析目标物的表达或浓度变化。
应用领域r o x参比荧光广泛应用于多个实验领域，主要包括：1.实时定量P C R在实时定量P CR实验中，r ox参比荧光用于稳定荧光信号，补偿不同扩增样本之间的荧光强度差异。
它可以提供准确、可靠的数据，帮助研究人员确定目标基因的表达水平。
2.蛋白质表达分析在蛋白质表达分析中，r ox参比荧光可用于研究蛋白质在不同条件下的表达变化。
通过荧光信号的相对强度比较，可以准确计算蛋白质的表达水平，找出差异表达的目标。
3.免疫荧光染色在免疫荧光染色中，r o x参比荧光可用于标记参比蛋白，以衡量目标蛋白的表达水平。
其稳定荧光信号能够提供可靠的相对强度比较，帮助研究人员定量分析免疫染色结果。
使用注意事项在使用r ox参比荧光时，需要注意以下几点：确定合适的参比荧光浓度1.：根据目标物与参比物的浓度比例，选择适当的参比荧光浓度，避免信号饱和或过低。
注意参比物和目标物的共存情况2.：如果参比物和目标物共存于同一实验系统中，需要确保二者的光谱不重叠，以避免信号干扰。
正常化数据处理3.：根据实验需求，选择适当的正常化方法对数据进行处理，以保证准确的结果分析。
实验重复性和统计分析4.：为了获得可靠的实验结果，建议进行实验重复，并使用合适的统计方法进行数据分析。
存储和保存5.：ro x参比荧光应存储在避光、干燥的环境中，避免温度过高或过低。
结论r o x参比荧光作为一种常用的内参标记物，具有较强的荧光信号和良好的稳定性，在生物学研究中发挥着重要的作用。
荧光相关光谱
荧光相关光谱
荧光光谱是一种物理学上用来检测和分析复杂物质的光谱技术。
它基本上实现
通过光激发细胞、样品中的分子，使它们生成对应的荧光或激发能量，而后将所获取的光谱数据进行处理，从而分析出其中的物质构成，以及相关的物理和化学特性，用以帮助人们了解复杂物质的性质。
荧光光谱把微细的物质特征识别出来，是分析复杂物质组成的一种重要方法。
它主要利用荧光光谱仪进行抗体检测、定量分析等，从而对样品中某种微量元素或细胞组分的含量、水平进行测定。
荧光光谱技术还被广泛应用于石油和煤炭化验、病毒检测、药物分析、生物材料检测等，可以大大提高物质的分析效率和检测准确性。
荧光光谱作为一门分析学科拥有广泛的临床应用，它在分析诊断过程中也得到
了广泛运用，为医疗诊疗提供了有价值的参考信息，帮助临床医生准确诊断病因，还可以用来分析植物或动物身体内的物质分布，可以准确的追踪有害的小分子，以及可以较高精度的监测药物的作用情况。
荧光光谱是一种有效、准确的检测技术，可以在大量抗体检测、定量分析、石
油和煤炭化验、病毒检测、药物分析、生物材料检测等科学和临床应用领域中得到有效研究和运用。
它丰富了研究领域，是精准医学和健康技术研究的重要手段。
荧光相关光谱要点ppt课件
三、应用
• 1.生物分子相互作用 • 金环蛇毒素和乙酰胆碱受体的作用 • 组氨酸标记肽与金属螯合脂的作用 • 转铁蛋白与人转铁蛋白受体的作用 • 秋水仙碱与微管蛋白的作用 • ……
2.活细胞相关研究
• A.细胞膜 • 磷脂双分子层4nm厚，可按二维模型处理
• 胰岛素原C-肽与人细胞膜的相互作用 • 表皮增长因子与膜结合受体的特异结合 • 神经肽在胰腺癌细胞细胞膜的结合作用
一、概念
• FCS通过测定溶液中微区内（fL）发光粒 子因布朗运动或化学反应而产生的荧光 涨落现象，分析荧光涨落的相关函数而 获得单个粒子（如分子）的浓度、化学 动力学参数等信息。
• 概念于20世纪70年代提出，90年代开始 发展。（计算机技术、光学检测技术、 激光共焦技术）
Rhodamine green 488nm激发
相关公式
• 微区内荧光分子数在任一时间t的变化导致荧光 强度的涨落值为：
• 用归一化自相关函数将荧光涨落与延迟时间τ 相关：
二、相关实验技术
• 激光器 • 共焦显微镜 • 高数值孔径物镜
• 1.单光子激发
• 2.双光子激发
• 3.荧光互相关光谱：
• 分子量之差小于8倍，扩散系数之差小于2倍。 • 标记两种不同荧光试剂，两个独立激光器激发，两个
• B.胞内 • 线粒体中NADH、黄素蛋白有自发荧光
• 乳胶微球在细胞内的扩散行为 • 寡聚核苷酸在细胞核内的分子运动 • β-半乳糖酶融合蛋白在胞内的运动
3.核酸研究 • DNA PCR扩增动力学研究 • DNA单个分子构象波动
4.疾病诊断
• 结合PCR扩增或其他扩增
• HIV • HBV、HCV、SARS • 朊病毒
2. 荧光光谱
原子荧光光谱仪
原子荧光仪分为两类，色散型和非色散型。 荧光仪与原子吸收仪相似，但光源与其他部件不 在一条直线上，而是900 直角，而避免激发光源 发射的辐射对原子荧光检测信号的影响。
原子荧光光谱仪
激发光源：空心阴极灯或 氙弧灯 滤光片 原子化器： 非色散型 色散系统：色散型-光栅 非色散型-滤光片 检测系统：光电倍增菅 数据处理和仪器控制系统 色散型 氢化物发生系统
荧光光谱
荧光光谱
• 物体经过较短波长的光照，把能量储存起来，然后缓慢放 出较长波长的光，放出的这种光就叫荧光。 • 如果把荧光的能量--波长关系图作出来，那么这个关系图 就是荧光光谱。荧光光谱当然要靠光谱检测才能获得。
原子荧光光谱的产生
1964年以后发展起来的分析方法, 是以原子在辐射能激发 下发射的荧光强度进行定量分析的发射光谱分析法。 原子荧光为光致发光，二次发光，激发光源停止时，再 发射过程立即停止。
应用
• 1、水泥、粉煤灰、矿渣、煤矸石、粘土、高岭土等 样品中Ca、Si、Al、Fe、Mg、Na、K、Ti、S等元素 的定量分析。 • 2、转炉渣、石膏、玻璃、碳素结构钢等样品中主 次元素的定量测定。 • 3、水泥不同水化龄期液相中离子浓度的测定。该 法将样品滴在滤纸片上来测定液相中的离子浓度， 解决了微量样品较难进行元素定量分析的难题。 • 4、油品中24个微量元素的定量分析
X射线荧光光谱仪
能量色散型 色散型 X射线荧光光谱仪 （EDXRF） 波长色散型 （WDXRF） 同时式光谱仪 顺序式光谱仪 混合式光谱仪
多色散型—波长色散和能 量色散结合在一起 非色散型
X射线荧光光谱仪
生产厂商：德国布鲁克公司 仪器型号：SRS3400 元素：O8-U92 可测样品形态：块状、粉末、液体以及不规则零件 检测范围：从ppm - ～100%
荧光光谱FL
S1
外转移
反系间 窜跃
荧光
迟 滞 荧 光
系间 窜跃
１. 辐射跃迁的类型
共振荧光：10-12 sec 荧 光：10-8 sec 磷 光：1~10-4 sec 迟滞荧光:102~10-4 sec
T1 ２. 无辐射跃迁的类型
振动弛豫: Vr 10-12sec
外 转 移:无辐射跃迁回到
磷
基态
光
内 转 移:S2~S1能级之间有
大多数的荧光物质的量子产率在0.1~1之间；
例如：0.05mol/L的硫酸喹啉，F=0.55； 荧光素 F=1
化合物
F 0.11 0.29
0.46
0.60
0.52
16
§2 分子荧光与磷光强度的影响因素
一.荧光的量子产率
二. 荧光与有机化合物的结构
1. 跃迁的类型
π * →π π* → n
对于有机荧光物质: n →π* εmax＜ 100 平均寿命10-5~10-7sec
相对速率
与分子的直径、激发 M hv M*
1
粘度、温度等因素 有关。
发射 M* k1 M hv ,
K1 [M*]
熄灭 M* Q k2 M Q ΔH K2 [M*] [Q]
2. 能量转移熄灭
再吸收过程：
共振能量转移：
D* D hv , A hv A*
6.4 >1000
λ Fmax(nm) 315
318
316
319
320
~
λ
P max
(nm)
470
476
473
483
484 488
τ p(s)
2.6
荧光光谱知识
荧光光谱教程一、化学发光反应的类型1．直接化学发光和间接化学发光化学发光反应可分直接发光和间接发光。
直接发光是被测物作为反应物直接参加化学发光反应，生成电子激发态产物分子，此初始激发态能辐射光子。
表示如下：式中A或B是被测物，通过反应生成电子激发态产物C*，当C*跃迁回基态时，辐射出光子hv。
间接发光是被测物A或B通过化学反应后生成初始态C*，C*不直接发光，而是将其能量转移给F，使F处于激发态，当F*跃迁回基态时，产生发光。
如下式表示式中C*为能量给予体，而F为能量接受体。
例如，用罗丹明B－没食子酸的乙醇溶液测定大气的O3，其化学发光反应就属这一类型。
没食子酸被O3氧化时吸收反应所产生的化学能，形成受激中间体A*，而A*又迅速将能量转给罗丹明B，并使罗丹明B分子激发，处于激发态的罗丹明B分子回到基态时，发射出光子。
该光辐射的最大发射波长为584nm。
2. 气相化学发光和液相化学发光按反应体系的状态来分类，如化学发光反应在气相中进行称气相化学发光，在液相或固相中进行称液相或固相化学发光，在两个不同相中进行则称为异相化学发光。
本节主要讨论气相和液相化学发光，其中液相化学发光在痕量分析中更为重要。
（1）气相化学分光主要有O3、NO、S的化学发光反应，可用于监测空气中的O3、NO、NO2、H2S、SO2和CO等。
☆臭氧与乙烯的化学发光反应机理是O3氧化乙烯生成羰基化合物的同时产生化学发光，发光物质是激发态的甲醛。
这个气相化学发光的最大波长为435nm，发光反应对O是特效的，线性响应范围为1ng·mL-1～1μg·mL-1。
☆一氧化氮与臭氧的气相化学发光反应有较高的化学发光效率，其反应机理为：这个反应的发射光谱范围为600～875nm，灵敏度可达1ng·mL-1。
若需同时测定大气中的NO2时，可先将NO2还原为NO，测得NO总量后，从总量中减去原试样中NO的含量，即为NO2 的含量。
荧光光谱的原理及应用
分子能级与跃迁
分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；
激发： 基态(S0)→激发态(S1、S2激发态振动能级)：吸收
特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；
失活： 激发态 →基态：多种途径和方式(见能级图)；速
度最快、激发态寿命最短的途径占优势；
第一、第二、…电子激发单重态 S1 、S2… ； 第一、第二、…电子激发三重态 T1 、T2 … ；
7
雅布隆斯基分子能级图
内转换
振动弛豫 内转换
S
系间窜越
2
S1
能
T1 T2
量
发
发
吸
射
外转换
射
收
荧
磷 振动弛豫
光
光
S0
l1
l 2 l 2
l3
8
跃迁规则
Franck-Condon原理：
在电子跃迁完成的瞬间，分子中原子核的构型是来不及改
变的。
跃迁前后原子核的构型没有发生改变、跃迁过程中电子自旋没有 改变、跃迁前后电子的轨道在空间有较大的重叠和轨道的对映性
发生了改变的跃迁是允许的；
跃迁过程中电子自旋发生了改变、跃迁前后电子的轨道在空间不 重叠或轨道的对映性未发生改变的跃迁是禁阻的。
9
失活的途径
电子处于激发态是不稳定状态，容易返回基态，在这个过程中通过
辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量，这个过程就称为失活。
失活途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光
磷光
系间窜越 内转换 外转换 振动弛豫
寿命和这些过程的速率常数有关，总的失活过程的速率常数k可以
用各种失活过程的速率常数之和来表示:
荧光光谱
荧光光谱
荧光是物质吸收电磁辐射后受到激发，受激发原子或分子在去激发过程中再发射波长与激发辐射波长相同或不同的辐射。
当激发光源停止辐照试样以后，再发射过程立刻停止，这种再发射的光称为荧光。
荧光光谱包括激发谱和发射谱两种。
激发谱是荧光物质在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效率；发射谱则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况，也就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。
灵敏度高：荧光分析的最大特点是灵敏度高，通常情况下要比分光光度计的灵敏度高出2-3个数量级。
选择性强：包括激发光谱和发射光谱，在鉴定物质时，通过选择波长可以使分子荧光分析有多种选择。
试样量少和方法简便。
技术参数：
1.功率50W，最大电压50KV，最大电流2mA
2.50W端窗Pd靶X光管
3.硅漂移计数器，分辨率小于170eV
4.3位置次级靶自动转换系统，即3束X激发光源。
5.可选真空、充气、常压系统
主要特点：
1.偏振X光激发样品，具有极低的背景，极佳的灵敏度
2.真正意义的Na-U的全分析，无需滤光片。
3.分析的含量范围ppm级到100%
4.极为丰富的软件系统，提供各种方法及校正模式。
荧光光谱分析
荧光光谱分析(总19页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--第十七章荧光光谱分析当紫外线照射到某些物质的时候，这些物质会发射出各种颜色和不同强度的可见光，而当紫外线停止照射时，所发射的光线也随之很快地消失，这种光线被称为荧光。
西班牙的内科医生和植物学家于1575年第一次记录了荧光现象。
17世纪，Boyle和Newton等著名科学家再次观察到荧光现象。
17世纪和18世纪，又陆续发现了其它一些发荧光的材料和溶液，但是在荧光现象的解释方面却没有什么进展。
1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍长，才判明这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是由光的漫射所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念。
同时，他由发荧光的矿物“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。
1867年，Coppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝-桑色素配合物的荧光进行铝的测定。
1880年，Liebeman提出了最早的关于荧光与化学结构关系的经验法则。
到19世纪末，人们已经知道了600种以上的荧光化合物。
20世纪以来，荧光现象被研究得更多了。
例如，1905年Wood发现了共振荧光；1914年Frank和Hertz利用电子冲击发光进行定量研究；1922年Frank和Cario发现了增感应光；1924年Wawillow进行了荧光产率的绝对测定；1926年Gaviola进行了荧光寿命的直接测定等。
荧光分析方法的发展离不开仪器应用的发展。
19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由Jette和West研制出第一台光电荧光计。
早期的光电荧光计的灵敏度是有限的，1939年Zworykin和Rajchman发明光电倍增管以后，在增加灵敏度和容许使用分辨率更高的单色器等方面，是一个非常重要的阶段。
1943年Dutton和Bailey提出了一种荧光光谱的手工校正步骤，1948年由Studer推出了第一台自动光谱校正装置，到1952年才出现商品化的校正光谱仪器。
荧光光谱分析法-课件
b. 荧光光谱的形状与激发波长无关
电子可以跃迁到不同激发态能级,吸收不同波长的能量
(如能级图l 2 、l 1)，产生不同吸收带，但荧光光谱却只有一
个发射态，如l 3 。
为什么？
20
c. 镜像规则 由于电子基态的振动能级分布与激发态相似,故通常
荧光光谱与它的激发光谱成镜像对称关系。
各小峰波长 递减值与振 动能级差有 关,各小峰的 高度与跃迁 几率有关。
电子能级的多重性 M=2S+1
平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则),三重态能级比相应
单重态能级低;
大多数有机分子的基态处于单重态；
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小结:激发单重态与激发三重态的不同√
激发单重态分子中没有净电子自旋,因而具有反磁性;激发 三重态有2个自旋平行电子，是顺磁性的 激发单重态分子平均寿命短（10-8~10-6s），而激发三重态 的长（10-4~10s） 基态单重态到激发单重态的激发，不涉及电子自旋方向的 改变而容易发生，属于允许跃迁；而到激发三重态属于禁阻 跃迁
2008年诺贝尔化学奖
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澳大利亚科学家最新发现, 一种叫“螳螂虾”的海里 动物通过发出色彩鲜艳的 荧光来恐吓警告敌对者或 者吸引性配偶，
用荧光抗体染色之 原生动物
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green-fluorescent protein (GFP) K. Brejc et.al., PNAS 94 (1997) 2306
S0→S1、S2 允许跃迁; S0→T1、T2 禁阻跃迁；通过其他途径进入 (见能级图)；进入的几率小；
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内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
T1 T2
量
吸 收
荧光 光谱.
荧光寿命
当某种物质被一束激光激发后,该物质的分子吸 收能量后从基态跃迁到某一激发态上,再以辐射跃迁 的形式发出荧光回到基态.当激发停止后,分子的荧光 强度降到激发时最大强度的1/e所需的时间称为荧光 寿命.
5). 荧光标记
荧光标记是将荧光基团共价连接到蛋白、核酸等分上的 过程。通常使用能够选择性地与目标分子上存在的功能 基团反应的荧光素基团衍生物来完成这样的过程。最常 见的标记过的分子是抗体，经常使用标记过的抗体来检 测特定的目标分子。
内转换 S2
内转换 振动弛豫 系间跨越
S1
能 量 吸 收 T1 发 射 荧 光 T2
外转换
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l1
l2
l 2
l3
a)光吸收：荧光物质从基态跃迁到激发态，过程约10-15s。此时， 荧光分子处于激发态。 b)内转换：处于电子激发态的分子由于内部的作用，以无辐射 跃迁过渡到低的能级。 c)外转换：处于电子激发态的分子由于和溶剂以及其他分子的 作用，以及能量转移，过渡到低的能级 d)荧光发射：如果不以内转换的方式回到基态，处于第一电子 激发态最低振动能级的分子将以辐射的方式回到基态，平均寿命 约为10ns左右。 e)系间转换：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。 如 电子自旋改变，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。 f）振动驰豫：高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振 动弛豫的时间10 -12 s。
2.常用荧光光谱
荧光光谱有瞬态荧光光谱和稳态荧光光谱两类。 通常荧光光谱指的是稳态荧光光谱。 1）荧光的激发光谱，发射谱 激发谱：固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射 的荧光强度与激发光波长的关系曲线 。 荧光的发射谱：固定激发波长，发射强度与发射波 长的关系。
荧光光谱法
• 2、被激发到第一电子激发态的各个振动能 级的分子，通过无辐射跃迅降落到第一电 子激发态的最低振动能级；
• 3、降落到第一电子激发态的最低振动能级
的分子，继续降落到基态的各个不同振动
的耗散常使一部分吸收能丧失，剩余荧光 能强烈发光的分子几乎都是通过吸收π→π*跃迁而到达电子激发态的。
主要是指它比起其它方法来说应用范围还不够广泛。 大多数的分子在吸收了光而被激发至第一或以上的电子激发态的各个振动能级之后，通常急剧降落至第一电子激发态的最低振动能级
的能量比吸收的能量小，因此荧光在更长 ，在达一过程中它们和同类分子或其它分子碰撞而消耗了相当于这些能级之间的能量，因而不发出光，即无辐射跃迁。
d. 根据Frankcondon原理，电子跃迁过程中 核的相对位置不变（近似的），若吸收光 谱中某一振动带的跃迁几率最大，则在荧 光发射光谱中，其相反跃迁的几率也应最 大(说明高峰对高峰，低峰对低峰）非镜 像对称的峰出现，则表示有散射光或杂质 存在。
二、产生荧光的过程和条件
• 荧光物质产生荧光的过程可以分为这样四 个步骤：
2、被激发到第一电子激发态的各个振动能级的分子，通过无辐射跃迅降落到第一电子激发态的最低振动能级； 谱并无变化，这是动态猝灭的一个例子。
• 4、到达基态的各个不同振动能级的分子， 吸收光谱和荧光光谱能级跃迁示意图
分子的寿命和猝灭剂的浓度限制。 ——用石英制成，形状:正方形、长方形、圆形的。
再通过无辐射跃迁最后回到基态的最低振 能区分I、I0讯号的微小差别，故在低A时
在荧光法中，灵敏度与该物质激发时的ε及