生物实验4 实时定量PCR 实验报告
rtpcr实验报告
rtpcr实验报告
RT-PCR实验报告
一、引言
RT-PCR(逆转录聚合酶链反应)是一种常用的分子生物学技术,用于检测和分
析RNA样本中的特定基因表达水平。本实验旨在通过RT-PCR技术,对目标基
因在不同组织或条件下的表达进行定量分析,以进一步了解其功能和调控机制。
二、实验材料与方法
1. 材料:
- RNA样本:从不同组织或条件下提取的总RNA。
- RT-PCR试剂盒:包括逆转录酶、聚合酶、引物等。
- DNA分子量标记物:用于测定PCR产物的大小。
- 离心管、PCR管、PCR仪等实验器材。
2. 方法:
(1)RNA提取:采用某种RNA提取试剂盒,按照说明书提取不同组织或条件
下的总RNA。
(2)逆转录反应:将提取的RNA模板与逆转录酶、引物和其他试剂混合,进
行逆转录反应,将RNA转录为cDNA。
(3)PCR扩增:将逆转录反应产生的cDNA作为模板,与引物和PCR试剂混合,进行PCR扩增。
(4)电泳分析:将PCR产物与DNA分子量标记物一同进行琼脂糖凝胶电泳,
根据PCR产物的大小判断目标基因的表达水平。
三、实验结果与讨论
通过以上实验步骤,我们成功地获得了目标基因在不同组织或条件下的表达数据,并进行了初步的分析和讨论。
1. RT-PCR结果分析
我们首先进行了RNA提取和逆转录反应,得到了各组织或条件下的cDNA样本。然后,我们设计了特异性引物,进行了PCR扩增。最后,通过琼脂糖凝胶电泳,观察到了PCR产物的带型。
根据PCR产物的带型,我们可以初步判断目标基因在不同组织或条件下的表达
水平。比如,在组织A中,我们观察到了明显的PCR产物带,说明该基因在组
pcr检测实验报告
pcr检测实验报告
PCR检测实验报告
引言:
PCR(聚合酶链式反应)是一种在分子生物学中广泛应用的技术,通过扩增目标DNA片段,使其数量增加到可以被检测的水平。本实验旨在利用PCR技术对特定基因进行检测,并分析其在不同样本中的表达情况。
实验方法:
1. 样本收集:从不同来源的细胞或组织中提取DNA。本实验选择了人体血液样本,采用血液抽取器获取血液样本。
2. DNA提取:使用商业DNA提取试剂盒,按照说明书的步骤进行DNA提取。通过离心和洗涤等步骤,获得高质量的DNA样本。
3. PCR反应体系准备:根据实验需要,制备PCR反应液。反应液中包含DNA 模板、引物、酶和缓冲液等成分。确保反应体系中各组分的浓度和比例正确。
4. PCR扩增:将PCR反应体系加入PCR仪器中,按照设定的温度和时间程序进行扩增。PCR反应过程包括变性、退火和延伸等阶段,使目标DNA片段得到扩增。
5. PCR产物检测:将PCR产物进行凝胶电泳分析。将PCR产物与DNA分子量标准品一同加载到琼脂糖凝胶上,通过电泳分离,观察PCR产物的大小和带电性。使用紫外线照射,观察凝胶上的DNA条带。
实验结果:
通过PCR反应和凝胶电泳分析,我们成功扩增了目标基因的DNA片段,并观察到了相应的DNA条带。根据凝胶上的条带大小,我们可以初步判断目标基因
在不同样本中的表达情况。
讨论:
PCR技术在分子生物学研究中具有广泛的应用前景。通过PCR扩增,可以快速、高效地获取目标基因的大量DNA片段,为后续的测序、克隆和表达研究提供了基础。本实验中,我们选择了血液样本作为PCR反应的起始材料,这是因为血
荧光测定pcr实验报告
荧光测定pcr实验报告
引言
聚合酶链反应(PCR)是一种常用的分子生物学技术,可以在短时间内扩增DNA 目标序列。PCR扩增过程中,荧光标记的探针可以用来监测DNA模板的定量。本实验旨在通过荧光测定PCR的方法,对指定DNA序列进行定量分析。
实验设计与方法
实验设计
1. 收集样本:收集待测DNA样本。
2. 准备试剂:准备PCR反应体系所需的试剂,包括PCR缓冲液、dNTPs、引物、荧光标记的探针等。
3. 试剂配置:按照实验设计,配置合适浓度的试剂稀释液。
4. PCR反应:根据实验设计,进行PCR反应,在PCR仪中设置加热曲线。
5. 荧光测定:在PCR反应过程中,通过荧光实时监测相应信号。
实验方法
1. 收集样本:收集待测DNA样本,保证样本的纯度和完整性。
2. 准备PCR反应体系:按照实验设计,配置PCR反应体系,包括PCR缓冲液、dNTPs、引物、荧光标记的探针等,保证试剂的浓度和质量。
3. 试剂配置:根据实验设计,配置合适浓度的试剂稀释液,保证试剂的稳定性和反应效果。
4. PCR反应:将待测DNA样本和试剂混合,在PCR管中进行适当的温度变化,进行PCR反应。PCR反应的参数包括初始变性、循环变性、退火、延伸等步骤。
5. 荧光测定:在PCR反应过程中,监测PCR反应产生的荧光信号。通过荧光
实时监测,可以定量分析PCR扩增的产物。
结果与分析
荧光测定PCR结果
在本实验中,通过荧光测定PCR的方法成功扩增了目标DNA序列。在PCR反应过程中,实时监测到荧光信号的增强,表明DNA扩增的过程正常进行。
荧光定量PCR实验
荧光定量PCR实验
Real-time PCR(SYBR GreenⅠ)实验
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出,由于该技术
不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解
决PCR污染问题、自动化程度高等特点,目前已得到广泛应用。实时荧光定量PCR仪包括
热循环仪、检测系统、计算机及软件分析系统。
一.实验目的
定量待测样品中靶DNA含量的多少及其动态变化。
二.实验原理
所谓实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积
累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
每个管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数(Ct值)与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中纵坐标代表起始拷贝数的对数,横坐标代表Ct值。因此,只要获得未知
样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。定量的方法一般常用的有
三种:SYBR green I,TaqMan探针和Molecular Beacon。
图1.Ct值的确定
SYBR荧光染料法:在PCR反应体系中加入过量的SYBR荧光染料,SYBR
荧光染料特异性地掺入DNA双链后发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不
会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。但是在有非
特异性扩增的情况下,不能采用SYBR green Ⅰ定量,因为非特异的扩增片段也会贡献荧
RT-PCR实验报告
逆转录pcr
rt-pcr 为反转录rcr(reverse transcription pcr
)和实时pcr(real time pcr)共同的缩写。逆转录pcr,或者称反转录pcr(reverse transcription-pcr, rt-pcr),是聚合酶链式反应(pcr)的一种广泛应用的变形。在rt-pcr 中,一条rna链被逆转录成为互补dna,再以此为模板通过pcr进行dna扩增。
由一条rna单链转录为互补dna(cdna)称作“逆转录”,由依赖rna的dna聚合酶(逆转录酶)来完成。随后,dna的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖rna的dna聚合酶完成,随每个循环倍增,即通常的pcr。原先的rna模板被rna酶 h降解,留下互补dna。
rt-pcr的指数扩增是一种很灵敏的技术,可以检测很低拷贝数的rna。rt-pcr广泛应用于遗传病的诊断,并且可以用于定量监测某种rna的含量。(检测基因表达的方法,参见northern blot法。)
rt-pcr有时候也会指代实时pcr(real-time pcr)。为了与逆转录pcr相区别,通常被写作“定量pcr”(quantitative pcr)或者rtq-pcr(real-time quantitative pcr)。
实时pcr
实时pcr(real-time pcr),属于定量pcr(q-pcr)的一种,以一定时间内dna的增幅量为基础进行dna的定量分析。 real time pcr 的定量使用萤光色素,目前有二种方法。一种是在ds dna中插入特异的萤光色素;另一种使用一种能与增幅dna序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针(probe)。 real time pcr 与 reverse transcription pcr 相结合,能用微量的rna来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种rt pcr 的组合又被称之为“定量rt-pcr(quantitative rt-pcr)”
pcr技术在病原生物鉴定中的应用实验报告
pcr技术在病原生物鉴定中的应用实验报告
PCR技术,在分子生物学研究和临床医学中有着广泛的应用。PCR通过利用酶在体外合成一条特定DNA序列,从而扩增目标DNA。PCR技术在病原生物鉴定中特别有用,因为许多病原体的数量太少,不易被传统培养方法检测出来。本实验报告将描述PCR技术在病原生
物鉴定中的应用。
材料和方法
材料:
1.病原菌:分别收集大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎支原体和结核分枝
杆菌的菌株。
2. PCR试剂盒:包括PCR模板DNA(菌落),PCR反应缓冲液,聚合酶,dNTPs(脱氧核酸三磷酸),MgCl2,PCR引物,溶剂等。
3. 电泳仪:含有10%(w/v)聚丙烯酰胺和TBE缓冲液的平板,以及Agarose凝胶,乙溴化物(EB)等。
方法:
1.从培养基上挑出适当的菌落,用管涂器转移到已添加生理盐水的96孔板中。标记菌株。抖动并在37℃下催化24小时。
2.收集菌株,将其离心,将细胞沉淀加入200μl 的 Tris-EDTA (TE)缓冲液,用超声波压碎。使菌株的DNA完全释放,可用乙醇沉淀法纯化DNA。
3.设置PCR反应环境:将PCR反应管中加入20μl PCR反应缓冲液,2μl PCR模板DNA,1μl MgCl2溶液,0.5μl聚合酶(Taq酶),0.5μl PCR 引物,4μl dNTPs,72μl 的水。混合物在PCR热循环器中按照以下条件扩增目标DNA:先以95℃处理2分钟进行热变性,
其次以94℃56秒脱氧,然后以50℃45秒回收,之后以72℃1.5分钟延长扩增。
实时荧光定量PCR实验结果分析
RT-qPCR实验
Color 1 – FAM detection for ERBB2
Color 2 - VIC detection for GAPDH
结果分析-绝对曲线
结果分析-单双通道相互验证
ERBB2单双通道相互验证的实验结果
A.Multiplex Reactions
Healthy RNA 28.48 28.68 28.78 28.65± 0.15
2130 2492
136000 130800
ERBB2 copies / GAPDH copies
Relative Expression
2 1.8 1.6 1.4 1.2
1 0.8 0.6 0.4 0.2
0 Healthy Tissue
Carc. Tissue
Healthy RNA 1095 / 95500 = 0.011 0.011
PMT1-FAM detection- ERBB2
结果分析-扩增曲线
PMT2-VIC detection- GAPDH
肿瘤
肿瘤
正常
结果计算-双标准曲线
Copies ng/ µl Total RNA
ERBB2 GAPDH
Healthy RNA
1095 1052
95500 85730
Tumor RNA
T G
rtpcr实验报告
rtpcr实验报告
标题:rtpcr实验报告
摘要:
本实验使用了rtpcr技术对特定基因进行检测,通过分析实验结果,得出了基因表达水平的定量数据。实验结果表明,该基因在不同条件下的表达水平存在显著差异,为进一步研究该基因在生物学过程中的作用提供了重要参考。
引言:
rtpcr(reverse transcription polymerase chain reaction)是一种常用的分子生物学技术,可以用于检测特定基因的表达水平。通过rtpcr实验,我们可以定量分析基因在不同组织、不同条件下的表达情况,从而深入研究基因在生物学过程中的作用。
材料与方法:
1. 样本准备:收集不同组织或细胞系的样本,提取总RNA。
2. 反转录:使用反转录酶将RNA转录成cDNA。
3. pcr扩增:设计引物,进行实时荧光定量pcr扩增。
4. 数据分析:利用实时pcr仪器收集数据,进行定量分析。
结果:
通过rtpcr实验,我们得到了不同组织或细胞系中特定基因的表达水平数据。实验结果显示,在不同条件下,该基因的表达水平存在显著差异。例如,在刺激条件下,基因的表达水平明显上调;而在抑制条件下,基因的表达水平则显著下调。这些数据为我们进一步探究该基因在生物学过程中的作用提供了重要参考。
讨论:
rtpcr实验结果表明,特定基因在不同条件下的表达水平存在显著差异。这表明该基因可能在特定生物学过程中发挥重要作用,或者受到外部环境的调控。进一步的研究可以探究该基因在细胞信号传导、代谢调控等方面的作用机制,为相关疾病的治疗提供理论依据。
基因表达实验报告
基因表达实验报告
引言:
基因表达是指在细胞中产生蛋白质的过程,它在生物体的正常发育和功能维持中起着至关重要的作用。本实验旨在研究不同条件下基因表达的变化,以增进对基因功能的理解和探索。
实验目的:
探究不同条件对基因表达的影响,并分析其结果。
实验材料:
1.细胞培养基
2.RNA提取试剂盒
3.逆转录试剂盒
4.聚合酶链式反应试剂盒
5.实时定量PCR仪
实验步骤:
1.培养细胞:将细胞分成两组,一组作为对照组,另一组在处理后进行实验。
2.RNA提取:使用RNA提取试剂盒提取两组细胞中的RNA。
3.逆转录:利用逆转录试剂盒将RNA转录成cDNA。
4.定量PCR:将转录后的cDNA用于实时定量PCR,以测定目标基
因的表达水平。
5.数据分析:比较对照组和处理组的基因表达水平,分析实验结果。
实验结果:
在对照组和处理组中,我们观察到基因表达水平的差异。通过实时
定量PCR测定,我们得到以下结果:对照组中,目标基因的表达水平
为X,而处理组中,目标基因的表达水平为Y。这表明处理条件对基
因表达产生了影响。
讨论:
本实验结果表明,在不同条件下,目标基因的表达水平发生了变化。这些结果对于深入研究基因调控网络和生物体对环境变化的响应机制
具有重要意义。此外,本实验还展示了实时定量PCR在基因表达分析
中的应用,该方法具有高灵敏度和高特异性,可准确测定基因表达水平。
结论:
通过本实验,我们验证了不同条件对基因表达的影响,并获得了实
验结果。这些结果为我们进一步研究基因功能和生物体适应能力提供
了重要线索。本实验还证明了实时定量PCR在基因表达分析中的有效
QPCR实验报告
QPCR实验报告
实验报告:QPCR技术在基因表达分析中的应用
一、引言
基因表达是指基因通过转录和翻译过程产生相应分子的过程,是维持生物体正常功能的关键步骤。定量聚合酶链反应(Quantitative PCR,QPCR)是一种常用的检测和分析基因表达水平的方法。该方法通过测量目标基因在不同时间点或条件下的转录水平,可以揭示基因调控机制、寻找新的治疗靶点以及评估药物治疗的效果。本实验旨在熟悉和掌握QPCR技术的基本操作步骤,并通过示例实验,了解该技术在基因表达分析中的应用。
二、材料与方法
2.1实验仪器
-核酸提取仪
-反转录仪
-实时定量PCR仪
2.2实验材料
-被测样品:包括正常组织和疾病组织样本
-细胞裂解缓冲液
-细胞核酸提取试剂盒
-反转录试剂盒
-实时定量PCR试剂盒
2.3实验步骤
1.样品处理:将被测样品均匀切割后,加入细胞裂解缓冲液使细胞破裂,并离心去除细胞碎片。
2.核酸提取:使用核酸提取试剂盒从细胞裂解液中提取总RNA,按照
试剂盒说明进行操作。
3.反转录:将提取的总RNA加入反转录试剂盒进行反转录反应,将RNA转录为cDNA。
4.实时定量PCR:根据目标基因和参比基因设计引物,并使用实时定
量PCR试剂盒进行PCR反应,测量模板DNA的含量。
5.数据分析:根据实时定量PCR的结果,计算目标基因的相对表达量,并进行统计分析。
三、结果与讨论
3.1实时定量PCR结果
通过实时定量PCR测量得到各样品中目标基因的转录水平。以CT值
为指标,CT值越低代表目标基因的转录水平越高。同时还可以通过计算
相对定量,比较不同样品之间目标基因的表达变化。
实时荧光定量PCR原理和实验
选择探针和引物
the Comparative CT Experiment workflow
Design the Comparative CT Experiment
Prepare the template
Prepare the Reactions
Prepare the sample dilutions
µL/Reaction
10 4 10 5 21 50
µL/21 Reactionsa
210 84 210 105 441
1050
2. RT反响体系
50 µL of the RT master mix 30 µL of nuclease-free water
20 µL of RNA sample
3. Program the thermal cycler
CT值与模板DNA的关系
一般地,我们有Rn=RB+XO(1+EX)nRS,也就是说第n次PCR循环时 的荧光信号强度(Rn)等于背景信号强度(RB)加上每个分子的荧光强度 (即单位荧光强度,RS)与分子数目的乘积。当循环次数n = CT时, 那么有RT=RB+XO(1+EX)CTRS。两边取对数,得log(RT -RB) = logX0 + CTlog(1+ Ex) + logRs。整理此式,CTlog(1+ Ex) = logX0 + log(RT -RB)–logRs。
荧光定量pcr 实验报告
荧光定量pcr 实验报告
荧光定量PCR 实验报告
引言:
荧光定量PCR(Polymerase Chain Reaction)是一种非常重要的分子生物学技术,它能够在短时间内扩增特定DNA片段,并通过荧光信号实时监测扩增过程。本实验旨在利用荧光定量PCR技术,检测目标基因在不同组织中的表达水平。
材料与方法:
1. 提取RNA:从待测组织中提取总RNA,采用RNA提取试剂盒按照说明书操作,获得高质量的RNA样品。
2. RNA逆转录:使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA,反应条件为37℃
反应30分钟,然后95℃反应5分钟,最后冷却至4℃。
3. 荧光定量PCR反应体系准备:将PCR反应体系按照说明书中的推荐比例配制,包括模板cDNA、引物、荧光探针和PCR Master Mix。
4. 荧光定量PCR反应条件设置:根据引物和荧光探针的特性,设置PCR反应条件,包括初始变性、循环扩增和荧光信号检测等步骤。
5. 荧光定量PCR实验操作:将反应体系加入PCR管或板中,放入荧光定量PCR 仪中,进行扩增和信号检测。记录荧光信号变化曲线。
结果与讨论:
通过荧光定量PCR实验,我们成功检测到目标基因在不同组织中的表达水平。
在实验中,我们选择了心脏、肝脏和肺脏作为待测组织,以GAPDH作为内参
基因。在荧光定量PCR实验中,我们观察到了荧光信号的实时变化曲线,通过
计算Ct值(Cycle threshold),可以获得目标基因的相对表达量。
实验结果显示,在心脏组织中,目标基因的表达量较高,Ct值较低;而在肝脏和肺脏组织中,目标基因的表达量较低,Ct值较高。这与我们的预期相符,心脏是目标基因的主要表达器官,而肝脏和肺脏则是次要表达器官。这些结果为我们进一步研究目标基因的功能和调控机制提供了重要线索。
PCR检测实验报告
pcr实验报告
实验目的:了解pcr技术原理,掌握最基础的pcr实验步骤。
实验试剂:模板dna,mg2+,buffer,dntps,taq dna聚合酶,引物,h2o 。
实验原理:
pcr全称聚合酶链反应,是体外快速扩增特定基因或dna序列最常用的方法。
基本原理:首先将双链dna分子在临近沸点的温度下加热分离成2条单链dna分子,
dna聚合酶以单链dna为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新的dna互补
链。pcr反应时,只要在试管内加入模板dna、pcr引物、四种核苷酸及适当浓度的mg2+,dna
聚合酶就能在数小时内将目标序列扩增100万倍以上。
(1)双链模板dna分子首先在高温下解开成长的单链,短链引物分子立即与该模板dna 两端的特定序列相结合,产生双链区。
(2) dna聚合酶从引物处开始复制其互补链,迅速产生与目标序列完全相同的复制品。
(3)在后续反应中,无论是起始模板dna还是经复制的杂合dna双链,都会在高温下
解
开成为单链,体系中的引物分子再次与其互补序列相结合,聚合酶也再度复制模板dna。
(4)由于在pcr反应中选用的一对引物,是按照与扩增区域两端序列彼此互补的原则
设计
的,因此每一条新生链的合成都是从引物的退火结合位点开始并朝反方向延伸的,每一
条新合成的dna链上都有新的引物结合位点。
(5)整个pcr的反应全过程,即dna解链(变性)、引物与模板dna结合(退火)、dna 合成(链的延伸)三步可以被不断重复。经多次循环之后,反应混合物中所含有的双链
dna分子数,即两条引物结合位点之间的dna区段的拷贝数,理论上的最高值应该是2^n,能
荧光定量PCR实验报告
荧光定量PCR实验报告
一、实验目的
1、掌握荧光定量PCR技术
2、学习如何制备PCR反应体系
3、了解实时荧光PCR数据分析
4、检测DNA含量
二、实验原理
荧光定量PCR技术是一种基于PCR扩增原理的DNA分析方法,可定量检测DNA的含量,广泛应用于生物学、医学等领域。该技术主要依靠荧光标记物,结合荧光信号强度进行定量分析。
PCR反应过程中,引物与模板DNA结合后在酶的催化下形成新的DNA链,每个PCR循环会翻倍模板量。PCR扩增的温度曲线显示,PCR反应初期呈指数上升阶段,后期呈平台期,最后呈线性上升期。荧光定量PCR技术基于PCR反应的初期、指数上升阶段的振幅与CT值(Crossing Threshold,荧光信号的阈值值点)之间的关系,对样品中靶序列的含量进行定量分析。
三、实验步骤
以10μL体积计算,将荧光定量PCR反应体系制备如下表:
试剂名称一次浓度最终浓度10μL体积
SYBR Green 1x 1x 1μL
dNTPs 10mM 0.2mM 0.2μL
MgCl2 25mM 3mM 0.3μL
Taq DNA Polymerase 5u/μL 0.04u/μL 0.04μL
Forward Primer - 0.2μM 0.2μL
Reverse Primer - 0.2μM 0.2μL
Template DNA - 1ng-100ng 1μL
ddH2O - - 7.24μL
2、装载PCR板
将PCR反应体系均匀装到PCR板中,按照如下步骤进行:
① 每组实验会使用96孔PCR板;
② 取出PCR板后,先用蒸馏水清洗;
荧光定量pcr 实验报告
荧光定量pcr 实验报告
荧光定量PCR 实验报告
引言:
荧光定量PCR(Polymerase Chain Reaction)是一种常用的分子生物学技术,
用于扩增和定量特定DNA序列。它通过在PCR反应中引入荧光探针,可以实
时监测PCR扩增过程中的DNA产物累积情况。本实验旨在利用荧光定量PCR
技术,检测目标基因在不同样本中的表达水平。
材料与方法:
1. 样本准备:从不同组织中提取总RNA,并利用逆转录酶将RNA转录成cDNA。
2. PCR反应体系的配制:根据厂家提供的荧光定量PCR试剂盒说明书,配制PCR反应体系。
3. 荧光定量PCR扩增条件:预热酶解反应,然后进行PCR扩增,最后进行荧光信号检测。
4. 数据分析:利用荧光定量PCR仪器提供的软件对实验数据进行分析,计算目
标基因的表达量。
结果与讨论:
通过荧光定量PCR实验,我们成功检测到目标基因在不同样本中的表达水平。
实验结果显示,在肝脏组织中,目标基因的表达量最高,而在肺组织中表达量
最低。这与已有的研究结果一致,说明我们的实验结果是可靠的。
荧光定量PCR技术的优点在于其高灵敏度和高特异性。相比传统的定量PCR技术,荧光定量PCR可以实时监测PCR反应过程中的荧光信号,从而准确测量目标基因的表达量。此外,荧光定量PCR还可以同时检测多个基因的表达水平,
提高实验效率。
然而,荧光定量PCR也存在一些限制。首先,实验过程中需要使用荧光探针,这增加了实验的复杂性和成本。此外,荧光定量PCR对样本的质量要求较高,如果样本中存在较多的抑制物质,可能会导致PCR扩增效率降低。
大学pcr实验报告模板
大学PCR实验报告模板
实验目的
本次实验旨在让学生们了解PCR的原理、实验方法和过程,并能够通过实验掌握基本的PCR技能。
实验介绍
PCR全称聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction),是一种体外扩增DNA片段的技术,通常将一个DNA片段扩增至10-1000亿倍。PCR技术已广泛应用于基因工程、分子克隆、疾病诊断和研究等领域,是现代分子生物学的基石。
实验中使用的物品:
•热启动PCR试剂盒
•DNA分子量标准
•PCR扩增仪
•手套、口罩等消毒用品
实验方法
步骤一:实验前准备
1.按照实验要求测量所需试剂的体积,并进行备用。
2.做好消毒措施,带好口罩和手套等消毒用品。
步骤二:制备PCR反应体系
1.取出PCR试剂盒,加入所需的试剂。
2.制备出合适的PCR反应体系。
步骤三:PCR扩增
1.将PCR反应体系装入PCR管中。
2.将PCR管放入PCR扩增仪中,按照仪器要求设置好反应条件:
–热启动
–周期数
–反应温度
步骤四:PCR扩增结束
1.PCR扩增结束后,取出PCR管进行检验。
2.检查PCR产物的电泳结果是否正确。
3.记录扩增结果并进行分析。
实验结果及分析
(在此处填写实验结果及分析)
实验总结
经过本次实验,我对PCR有了更深刻的认识,也通过实验掌握了一系列PCR 技能。同时,实验也让我认识到科学实验的严谨性以及重要性,更加深入地了解分子生物学的应用。
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实验四定量PCR扩增
姓名:李宗翰专业:环境工程学号:1432999 同组人姓名:刘雪飞
一、实验目的
复习定量PCR原理,熟悉绝对定量的操作流程
二、实验原理
实时荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在PCR扩增的指数时期,模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析
三、实验仪器及材料
real time PCR仪(ABI7500, RotorGene 3000),微量移液器,Tip头,0.2ml光学薄壁管,8联PCR管,1.5ml离心管,SYBR Mix,引物及108 copy/ul 标准品
四、实验步骤
1、标准样品稀释:取4个1.5ml的离心管,写上标记107,106, 105, 104,向每管加入90μl ddH2O,取10μl 108copy/ul 的标样加入到107管中,充分混匀后,从管中取10μl 107copy/ul的液体到106管中。按上述操作依次稀释,得到5个倍数的标准样品。注意,每次稀释都要换Tip头。
2、配制预混液:取119μl ddH2O、7μl引物4204f、7μl引物4448r和7μl Rox 到装有175μl SYBR Mix液的1.5ml离心管中,混匀。
3、分装预混液:取7个小离心管,分别标记108、107、106、105、10
4、UNK (未知样)、NTC(阴性对照)。向其中分别加入42μl预混液和4.7μl模板(1-5号加标样、6号加未知样、7号加等量ddH2O),混匀。
4、戴上手套取两个8联管,并排放置管架上。分别取上述样品20μl至第1-7管中(第8管空出),每个样品两个重复,共14个样品。将加好样的8联管振荡。
5、设置分析仪参数如下:95℃3min;95℃15s+60℃40s为一个循环,循环次数40,融解曲线温度范围60~95℃。振荡好的样品进机进行PCR扩增。
6、扩增后利用软件分析C T值及未知样的定量结果。
五、实验结果与讨论
1、实验结果如何?试分析。答:实验结果及分析如下。(1)、实验具体数据见下表
Well Task CтCт Mean Cт SD Quantity Quantity
Mean Quantity SD
Ct
Threshold
A1 STANDARD 8.2488 8.2527 0.0 0 0.0712 A2 STANDARD 8.2565 8.2527 0.0 0 0.0712 B1 STANDARD 11.3893 11.6598 0.3825 0.0712 B2 STANDARD 11.9303 11.6598 0.3825 0.0712 C1 STANDARD 15.3292 14.9668 0.5126 0.0712 C2 STANDARD 14.6043 14.9668 0.5126 0.0712 D1 STANDARD 19.4912 19.3080 0.2590 100000 0.0712 D2 STANDARD 19.1249 19.3080 0.2590 100000 0.0712 E1 STANDARD 22.5385 22.4196 0.1681 10000 0.0712 E2 STANDARD 22.3007 22.4196 0.1681 10000 0.0712 F1 UNKNOWN 8.9370 8.9691 0.0454 *******.625 0.0712 F2 UNKNOWN 9.0012 8.9691 0.0454 *******.625 0.0712 G1 NTC 32.5329 0.0712 G2 NTC 32.9549 0.0712 其中,A-E为标准样品,F为位置样品,G为阴性对照。每个样品做两个平行。
通过软件分析,由标准曲线得到的未知样品的定量结果约为5.83×107。
(2)、扩增曲线
从扩增曲线中可以看出,样品均经历了良好的扩增过程。
(3)、标准曲线
从标准曲线中可以看出,R2值较好,标准曲线可以使用。但扩增效率一般。其中106和107的两个平行样的CT偏差较大,这一现象可以从(1)表中看出,其SD分别为0.5126和0.3825,相比其他点较大,一般认为SD大于0.5不理想。(4)、融解曲线
图中,可以看出每条曲线均为单峰且在一个合理的温度范围内(82~86℃),所以扩增是正常的,不存在非特异性扩增。
2、实验过程中需要注意些什么细节?
答:(1)、操作过程中尽量不要说话,以避免污染;
(2)、用微量移液器加样品时应保证枪头深入液面以下,这样样品不会留在管壁上;
(3)、不能在定量PCR管做标记,裸手不可以接触定量PCR管,操作时应戴手套。
(4)、8联定量PCR管加完样后,可先将盖子放上,等放到振荡机上再把盖子盖紧。
3、通过这个实验你有什么收获?这个实验对你今后开展相关实验研究是否有帮助?
答:通过实验我加深了对定量PCR的理论认识,熟悉了实时荧光定量PCR的操作流程。这一实验对我今后研究环境问题的微生物活动方面是有帮助的。
六、思考题
如果你自己的试验过程中,发现扩增效率是0.76、1.52或0.99, 实验结果能用吗?如果结果不能用,请说明原因,怎么样改变实验来解决这个问题?
答:扩增效率的有效值分两个范围,宽范围在0.8-1.2之间,窄范围在0.9-1.1之间。如题,若实验得到的扩增效率为0.76或1.52,均在宽范围之外吗,则说明扩增不太理想,数据不能直接用。可以通过删除某些偏差较大的点来提高扩增效率,若还不行,则需要重新实验。若扩增效率为0.99,则表明扩增较好,结果可以使用。
在实验中,可以使用购买特定公司配好的mix溶液,来提高扩增效率。若扩增效率太低,可能存在非特异性扩增,应排查一下反应体系,根据融解曲线是否单峰,并结合扩增曲线CT值进行综合分析。