引物设计实例分析
干货：引物设计有妙招，有图有真相
干货：引物设计有妙招，有图有真相PCR现在已经成为分子实验室的标配，无论是基因检测、基因定量、分子克隆、组装、突变、测序等等，都离不开PCR技术。
在PCR 过程中，引物设计是非常重要的一环，特别是qPCR的引物设计，决定了我们扩增效率是否达标和扩增产物是否特异。
今天小编为大家举个例子，设计一对qPCR引物。
qPCR引物设计，通常要留意以下几点：GC含量50%-60%Tm值50℃-65℃上下游引物尽量接近引物末端最好是G或C避开二级结构复杂区域引物尽量在目的基因的3’ 端引物尽量跨越内含子目的基因是否有不同的剪切变体……这么多要注意的怎么办？！Primer-blast相信很多小伙伴们都用过，只要输入序列设置条件就可以设计得到理想的引物序列了。
但是很多情况下，我们的要求往往不仅于此。
下面，我们以人的EGFP （Epidermal growth factor receptor，表皮生长受体因子）基因为例，设计一对可以同时扩增其不同剪切变体的qPCR引物！1. 查询基因结构之前小编已经为大家介绍了如何利用NCBI查询基因结构了（错过了可以戳这里），首先查询Homo EGFP的基因结构：2. 确定设计引物位置可以看到，这个基因有多种不同的转录本，而前8个外显子区域是完全一致的（绿色小竖线）。
我们的目的是将不同的转录本都扩增出来，那将反向引物设在第8个外显子之前就可以实现了。
3. 找到mRNA的序列号，进入GenBank在该页面里继续往下拉，找到mRNA和蛋白质的GenBank序列号。
点击mRNA的序列号，进入GenBank。
借助Highlight Sequence Features，我们可以快速确定第8个外显子的位置。
4. 确定下游引物设计位置点击Highlight Sequence Features后，浏览器的下方就会出现选项，选择查看Exon，找到第8个外显子，这样就能快速定位了。
我们确定了第8个外显子到下游至1236bp为止。
pcr引物设计序列例题
PCR引物设计序列例题简介P C R（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，通过扩增DN A 分子可用于基因克隆、检测等多个领域。
而P CR引物则是PCR反应中的关键组成部分，它们的设计直接影响P CR反应的成功与否。
本文为您提供一些关于P CR引物设计序列的例题，希望对您在实验和研究中的引物设计有所帮助。
例题一：引物序列设计为了扩增目标基因的特定片段，我们需要设计一对引物，以下是目标基因的序列，请根据该序列设计两个引物，使其具有以下要求：-引物长度在18-25个碱基对之间-引物的3'端碱基G或C-引物的理论Tm在55-65℃之间目标基因序列：A G TC GA TC GA TT AG CGA T CG AG TC GA TC GA TCG G CT AC GA TC GA解答：根据目标基因的序列，我们可以设计如下两对引物：引物1：5'-A GT CG AT CG AT TAG C GA TC-3'引物1满足引物长度在18-25个碱基对之间的要求，同时3'端碱基为C，符合要求。
接下来我们计算一下该引物的理论T m。
根据以下两个规则计算引物的理论Tm：-A与T之间的配对带来的热能释放为-2.2k J/mo l-C与G之间的配对带来的热能释放为-3.8k J/mo l根据以上规则，我们可以计算每个碱基的贡献：-A-T配对:-2.2k J/m o l-C-G配对:-3.8k J/m o l-G-C配对:-3.8k J/m o l-T-A配对:-2.2k J/m o l引物1的理论T m计算如下：(-3.8×4)+(-2.2×10)=-15.2+-22=-37.2k J/mo l该引物的理论Tm为37.2℃，低于所需的要求。
引物2：5'-C GA TC GA TC GA TCG G CT AC G-3'引物2满足引物长度在18-25个碱基对之间的要求，同时3'端碱基为G，符合要求。
实例图解简并引物设计 共25页
碱M
基B
代 码
D N
碱基 代码 A, G Y G, T S A, C W G, C, T V A, G, T H A, G, C, T
碱基 C, T G, C A, T A, G, C A, C, T
3. 质量评估
•（1）参数评估
将初步得到的引物序列，粘贴入Oligo Calc 的文本框内， 按下“Calculate”按钮，得到引物的相关参数，如：长 度、GC 含量、Tm 值等信息。
马铃薯Y 病毒（Potato virus Y，PVY）是侵染马铃薯、
烟草、辣椒等茄科作物并造成严重危害的病毒之一，广 泛分布全球各马铃薯种植区。RT-PCR 技术具有高度的特 异性和灵敏性等特点，已经成为 PVY 检测最常见的方法。 但由于PVY 株系分化严重，不断有新的重组株系产生， 单一的特异性引物无法适应PVY 不同株系的检测需求， 需要设计一对简并引物以能够满足生产上的检测需求。
八、详细图解
1. 序列准备： •（1）GenBank 下载PVY 全基因组序列； •（2）由于基因序列比较大，且数量多，推荐用MAFFT 多重序列比对； •（3）扩增片段区域选择，CP 基因长度及位置如下图所示：
• 先将光标定位在第一条序列任意位置，然后在左下角"Site"处直接输 入 CP 基 因 上 游 分 界 点 位 置 （ 8391 ） 后 回 车 。 接 着 点 击 “Speicaes/Abbrv”和8391 那一列的交界点时按下键盘上“Shift” 不放，移动光标到“1”那一列，此时点击鼠标右键“Delete”删除 冗余序列。
• PS ： 是 否 位 于 密
码子的第3 位，可
以
通
过
“ Tranlated
基因工程作业(引物设计)讲解
口腔鳞癌组织中肿瘤转移相关基因1（MTA1）一、选择原因及应用口腔鳞癌组织中肿瘤转移相关基因1（MTA1）在蛋白和mRNA的表达水平，揭示其与口腔鳞癌（OSCC）发生、发展的关系。
方法采用免疫组织化学法和原位杂交技术检测46例OSCC标本、15例口腔黏膜白斑与20例正常口腔黏膜标本中MTAl 基因的表达水平，并分析其与OSCC临床病理学参数的关系。
结果MTA1蛋白和MTA1mRNA在OSCC组织中的表达水平显著高于口腔黏膜白斑和正常口腔黏膜（P 〈0．05），口腔黏膜白斑中MTA1蛋白和MTA1mRNA表达水平显著高于口腔正常黏膜（P〈0．01），MTA1蛋白和MTA1mRNA表达与肿瘤浸润深度和淋巴结转移密切相关（P〈0．05）。
结论MTA1基因在蛋白和mRNA的表达水平在OSCC发生、发展及浸润转移过程中起一定促进作用，有望成为判断OSCC预后及选择治疗方案的一个新肿瘤标志物。
二、2查阅NCBI得到MTA1相关信息并获得目的基因PREDICTED: Gorilla gorilla gorilla metastasis associated 1 (MTA1), mRNANCBI Reference Sequence: XM_004055801.1FASTA GraphicsLOCUS XM_004055801 2872 bp mRNA linear PRI 03-DEC-2012DEFINITION PREDICTED: Gorilla gorilla gorilla metastasis associated 1 (MTA1),mRNA.ACCESSION XM_004055801VERSION XM_004055801.1 GI:426378238KEYWORDS .SOURCE Gorilla gorilla gorilla (western lowland gorilla) ORGANISM Gorilla gorilla gorillaEukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;Mammalia; Eutheria; Euarchontoglires; Primates; Haplorrhini;Catarrhini; Hominidae; Gorilla.COMMENT MODEL REFSEQ: This record is predicted by automated computationalanalysis. This record is derived from a genomic sequence(NW_004005914) annotated using gene prediction method: GNOMON,supported by mRNA and EST evidence.Also see:Documentation of NCBI's Annotation Process##Genome-Annotation-Data-START##Annotation Provider :: NCBIAnnotation Status :: Full annotationAnnotation Version :: Gorilla gorilla Annotation Release 100Annotation Pipeline :: NCBI eukaryotic genome annotation pipelineAnnotation Method :: Best-placed RefSeq; Gnomon Features Annotated :: Gene; mRNA; CDS; ncRNA##Genome-Annotation-Data-END##FEATURES Location/Qualifierssource 1..2872/organism="Gorilla gorilla gorilla"/mol_type="mRNA"/sub_species="gorilla"/db_xref="taxon:9595"/chromosome="14"gene 1..2872/gene="MTA1"/note="Derived by automated computational analysis usinggene prediction method: GNOMON. Supporting evidence/codon_start=1/product="metastasis-associated protein MTA1"/protein_id="XP_004055849.1"/db_xref="GI:426378239"/db_xref="GeneID:101134898"/translation="MAANMYRVGDYVYFENSSSNPYLIRRIEELNKTANGNVEAKVVC FYRRRDISSTLIALADKHATLSVCYKAGPGADNGEEGEIEEEMENPEMVDLPEKLKHQ LRHRELFLSRQLESLPATHIRGKCSVTLLNETESLKSYLEREDFFFYSLVYDPQQKTL LADKGEIRVGNRYQADITDLLKEGEEDGRDQSKLETKVWEAHNPLTDKQIDQFLVVAR SVGTFARALDCSSSVRQPSLHMSAAAASRDITLFHAMDTLHKNIYDISKAISALVPQG GPVLCRDEMEEWSASEANLFEEALEKYGKDFTDIQQDFLPWKSLTSIIEYYYMWKTTD RYVQQKRLKAAEAESKLKQVYIPNYNKPNPNQISVNNVKAGVVNGTGAPGQSPGAGRA CESCYTTQSYQWYSWGPPNMQCRLCASCWTYWKKYGGLKMPTRLDGERPGPNRSNMSP HGLPARSSGSPKFAMKTRQAFYLHTTKLTRIARRLCREILRPWHAARHPYLPINSAAI KAECTARLPEASQSPLVLKQAVRKPLEAVLRYLETHPRPPKPDPVKSVSSVLSSLTPA KVAPVINNGSPTILGKRSYEQHNGVDGNMKKRLLMPSRGLANHGQTRHMGPSRNLLLN GKSYPTKVRLIRGGSLPPVKRRRMNWIDAPDDVFYMATEETRKIRKLLSSSETKRAAR RPYKPIALRQSQALPLRPPPPAPVNDEPIVIED" ORIGIN1 tcctcctctt cctctcccgc ccgcgccgcg gccctcccgt ccctgcgcgg cctcggcggc61 ctcggcggcg gcggcggcgg cggcggcagc agcgcggccc ctttaaacgc ctgcggcgccgcgccgagcg ccgcgcccgcaacatgtaca gggtcggaga241 ctacgtctac tttgagaact cctccagcaa cccatacctg atccggagga tcgaggagct301 caacaagacg gccaatggga acgtggaggc caaagtggtg tgcttctacc ggaggcggga361 catctccagc accctcatcg ccctggccga caagcacgca accctgtcag tctgctataa421 ggccggaccg ggggcggaca acggcgagga aggggaaata gaagaggaaa tggagaatcc481 ggaaatggtg gacctgcccg agaaactaaa gcaccagctg cggcatcggg agctgttcct541 ctcccggcag ctggagtctc tgcccgccac gcacatcagg ggcaagtgca gcgtcaccct601 gctcaacgag accgagtcgc tcaagtccta cctggagcgg gaggatttct tcttctattc661 tctagtctac gacccacagc agaagaccct gctggcagat aaaggagaga ttcgagtagg721 aaaccggtac caggcagaca tcaccgactt gttaaaagaa ggcgaggagg atggccgaga781 ccagtccaag ttggagacca aggtgtggga ggcgcacaac ccactcacag acaagcagat841 cgaccagttc ctggtggtgg cccgctctgt gggcaccttc gcacgggccc tggactgcag901 cagctccgtc cgacagccca gcctgcacat gagcgccgca gctgcctccc gagacatcac961 gctgttccac gccatggata ctctccacaa gaacatctat gacatctcca aggccatctc1021 ggcactggtg ccgcagggcg ggcccgtgct ctgcagggac gagatggagg agtggtctgc1081 atcagaggcc aaccttttcg aggaagccct ggaaaaatat gggaaggatt tcacggacat1141 tcagcaagat tttctcccgt ggaagtcgct gaccagcatc attgagtact actacatgtg1201 gaagaccacc gacagatacg tgcagcagaa acgcttgaaa gcagctgaag ctgagagcaa1261 gttaaagcaa gtttatattc ccaactataa caagccaaat ccgaaccaaa tcagtgtcaa1321 caacgtcaag gccggtgtgg tgaatggcac gggggcgccg ggccagagcc ctggggctgg1381 ccgggcctgc gagagctgtt acaccacaca gtcttaccag tggtattctt ggggtccccc1441 taacatgcag tgtcgtctct gcgcatcttg ttggacatat tggaagaaat atggtggctt1501 gaaaatgcca acccggttag atggagagag gccaggacca aaccgcagta acatgagtcc1561 ccacggcctc ccagcccgga gcagcgggag ccccaagttt gccatgaaga ccaggcaggc1621 tttctatctg cacacgacga agctgacgcg gatcgcccgg cgcctgtgcc gtgagatcct1681 gcgcccgtgg cacgctgcgc ggcaccccta cctgcccatc aacagtgcgg ccatcaaggc1741 cgagtgcacg gcgcggctgc ccgaagcctc ccagagcccg ctggtgctga agcaggcggt1801 acgcaagccg ctggaagccg tgcttcggta tcttgagacc cacccccgtc cccccaagcc1861 tgaccccgtg aaaagcgtgt ccagcgtgct cagcagcctg acgcccgcca aggtggcccc1921 cgtcatcaac aacggctccc ccaccatcct gggcaagcgc agctacgagc agcacaacgg1981 ggtggacggc aacatgaaga agcgcctctt gatgcccagt aggggtctgg caaaccacgg2041 acagaccagg cacatgggac caagccggaa cctcctgctc aacgggaagt cctaccccac2101 caaagtgcgc ctgatccggg ggggctccct gcccccagtc aagcggcggc ggatgaactg2161 gatcgacgcc ccggatgacg tgttctacat ggccacagag gagaccagga agatccgcaa2221 gctgctctca tcctcggaaa ccaagcgtgc tgcccgccgg ccctacaagc ccatcgccctgcgcccgtca acgacgagccgccccccgcc cctcgcccgc2401 ccacacggcc ccttcccagc cagcccgccg cccgcccctc agtttggtag tgccccacct2461 cccgccctca cctgcagaga aacgcgctcc ttggcggaca ctgagggagg agaggaagaa2521 gcgcggctaa cttattccga gaatgccgag gagttgtcgt ttttagcttt gtgtttactt2581 tttggctgga gcggagatga ggggccaccc cgtgcccctg tgctgcgggg ccttttgccc2641 ggaggccggg ccctaaggtt ttgttgtgtt ctgttgaagg tgccgtttta aattttattt2701 ttattacttt ttttgtagat gaacttgagc tctgtaactt acacctggaa tgttaggatc2761 gtgcggccgc ggccggccga gctgcctggc ggggttggcc cttgtctttt caagtaattt2821 tcatattaaa caaaaacaaa gaaaaaaatc ttataaaaag gaaaaaaacc aa//三、表达载体的选择我所选用的原核表达载体为质粒pBR322；pBR322 是一种常用的E. coli 克隆载体（1），为4,361 bp 的环状双链DNA（2）。
设计引物的实验报告
一、实验目的1. 掌握引物设计的原理和方法。
2. 学习利用生物信息学工具进行引物设计。
3. 了解引物在PCR实验中的应用。
二、实验原理引物是一段单链DNA或RNA，作为PCR反应的起始模板，与模板DNA链互补结合，从而在PCR反应中引导DNA的复制。
引物设计是PCR实验成功的关键因素之一。
三、实验材料1. 生物信息学工具：Primer Premier 5.0、Primer BLAST、OligoCalc等。
2. 实验样品：待扩增的DNA模板。
3. 其他：PCR试剂、DNA序列、引物合成等。
四、实验步骤1. 选择目标基因序列根据实验目的，选择合适的基因序列。
在本实验中，以某基因的cDNA序列为模板。
2. 利用生物信息学工具进行引物设计（1）打开Primer Premier 5.0软件，输入基因序列。
（2）设置引物设计参数，如：引物长度、Tm值、GC含量、引物间距离等。
（3）进行引物设计，得到多个引物序列。
（4）利用Primer BLAST和OligoCalc等工具对设计出的引物进行筛选，排除同源序列和二级结构。
3. 引物合成将筛选出的引物序列提交给引物合成公司，合成引物。
4. PCR实验（1）配制PCR反应体系，包括：引物、模板DNA、dNTPs、DNA聚合酶等。
（2）设置PCR反应程序，如：预变性、变性、退火、延伸等。
（3）进行PCR反应，观察扩增结果。
五、实验结果与分析1. 引物设计结果根据实验目的，设计出以下引物：上游引物：5'-ATCGTACGCTAGGCTG-3'下游引物：5'-CGTCTGACGACGTCAGT-3'2. PCR扩增结果通过PCR实验，成功扩增出目标基因片段。
六、实验结论1. 通过生物信息学工具进行引物设计，可提高引物设计的准确性和效率。
2. 合适的引物是PCR实验成功的关键，设计引物时需考虑多种因素。
3. 本实验成功设计并合成引物，为后续的PCR实验奠定了基础。
引物设计实例分析(多图)
引物设计基本原则引物长度（primer length）产物长度（product length）序列Tm值（melting temperature）G+C含量（composition）引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）阅读框1. 引物的长度一般为15-30bp,常用的是18-27bp,但不能大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度2. 产物的长度扩增片段长度为100~600碱基对。
3. Tm值引物的Tm值一般控制在55-60度，尽可能保证上下游引物的Tm值一致，一般不超过2度。
如果引物中的G+C含量相对偏低，则可以使引物长度稍长，而保证一定的退火温度。
Tm=2（A+T）+4（C+G）4. 引物的GC含量有效引物中（G+C）的比例为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
5. 引物自身引物间3‘端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败任务用绿色荧光蛋白（GFP）标记蛋白NR1引物要求PCR扩增GFPGFP两边添加BamHI酶切位点保证NR1的阅读框不改变第一步：扩增GFP基本序列第二步：GC比值；Tm值第三步：酶切位点第四步：阅读框第五步保护序列Primer1: 5' GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA Primer2: 5' GCGCggatccctCTTGTACAGCTCGTCCA TGCC记得当初写本科论文，感到不知道讨论什么问题好。
愣是写了一大段的PCR条件摸索的讨论。
后来PCR成为实验最基本的一步了，但是发现在PCR中还是有许多需要注意的地方。
PCR的第一步就是引物设计了。
引物设计需要注意的地方很多，在大多数情况下，我们都是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的。
在某些情况比如构建文库的时候也会在不知道模板序列的情况下进行设计。
这个时候随机核苷酸序列就与模板不是完全匹配。
PCR引物设计及测序结果分析
PCR技术原理
以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与 模板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引 物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机 制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这 一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。
基本原则：
引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体
或发夹结构 引物不能在模板的非目的位点引发DNA
聚合反应(即错配)。
一般原则：
1. 引物的长度：配对引物的长度一般在1530bp之间比较合适。
尽可能使用两条引物的Tm值相同（最好相差不要超过 5℃）
Tm值的计算：一般的公式：Tm = 4 (G+C) + 2(A+T)
正义链
反义链
基本分子生物学研究手段
PCR PCR反应液体的成分:
PCR循环的程序: PCR原理：
基本分子生物学研究手段
RT-PCR
反转录PCR mRNA---cDNA-----PCR
基本分子生物学研究手段
Cutting by enzymes
基本分子生物学研究手段
Southern Blot
基本分子生物学研究手段
生物软件网下载 安装后，用文本编辑器打开WIN.INI，将vspace=DU
改为vspace=PU便可以使用全部功能。
Oligo primer 3 The Primer Generator NetPrimer
如何使用Primer Premier 5.0
LAMP引物设计实例
推荐LAMP最佳引物设计和分析流程：1、首选确定好需要检测的目的基因及序列（最好大于2kb，这一步的目的是增加在最佳参数下产生设计结果的可能）2、将荣研第四版LAMP引物设计软件设软件的各项参数均设为最佳参数(1)如果没有结果产生，则稍微调整或放宽CG比(2)还没有结果产生，再适当放宽Tm值(3)还没有结果产生，再适当调整或放宽引物间距(4)还没有结果产生，返回步骤(1)继续放宽CG比，让后在放宽Tm，按照上述步骤进行循环。
直至产生结果。
（详见下页图表）3、导出设计结果4、标记出5-10套最符合3’、5’的ΔG符合要求的引物(F1C和B1C引物的5’和其他引物的3’尽可能的比-4小)(这一步的目的是首先要控制反应能够特异的发生)5、在上述5-10套引物中，选择荣研软件计算得出二聚体发生趋势最小的5套（或5套以内）引物(这一步的目的是在反应能够特异性发生的基础上控制引物自身扩增形成二聚体的可能)6、分析这5对引物的Tm值，选择尽可能接近要求(60℃和65℃)的引物2-3套7、分析CG比，选择尽可能接近要求(50-60%)的引物1-2套(上述两步是在保证引物的特异性，控制假阳性的基础上进一步对引物进行优化)8、对确定好的1-2套引物用OLIGO软件进行引物分析，最终确定1套最佳引物引物设计软件参数调整流程6110第一套引物总体评价●从设计结果来看，引物3’和5’ ΔG是比较容易满足的●由于CG比例和目的序列有关，但可以通过输入较长的目的片段(>1Kb)，而相对容易满足●该套引物的Tm值是根据PCR引物设计原则（不同引物之间Tm值最好能够接近）为标准从设计结果中选择的，所以和最佳Tm存在一定偏差，但是可以在设计结果选择中加以改善。
●引物二聚体和发夹结构是比较难避免的，需要通过引物设计软件primer 5和oligo进行两两匹配分析，由于需要针对3对，一共6条引物之间和引物本身进行错配分析，一套引物共需要进行21次分析，所以较为耗时，而且比较难以选择最佳结果。
实验2 引物设计与测序结果分析
学院：______ 班级:_______ 学号:_________ 姓名:__________ 成绩：______ 实验二引物设计及测序结果分析目的：1、掌握常规引物设计的原则及操作流程。
2、熟悉简并引物设计的原理及操作方法。
3、熟悉引物设计软件及在线引物设计工具的操作方法。
4、掌握使用相关软件及在线工具分析测序结果的方法。
内容：1、使用Primer Premier、Oligo、BLAST等软件及在线工具进行常规引物设计，并对引物扩增效率、特异性进行评价。
2、使用DNAMAN软件进行常规引物快速设计。
3、使用NCBI中的在线引物设计工具Primer-BLAST快速设计引物。
4、使用在线工具CODEHOP设计简并引物。
5、使用Chromas、BioEdit软件查阅测序结果峰图文件。
6、使用DNAMAN软件对测序序列进行编辑，进行序列拼接。
软硬件要求：联网计算机，预装Windows 7操作系统，预装IE或Chrome浏览器、英汉电子词典（有道词典或金山词霸），预装DNAMAN7、Primer Premier5、Oligo7、Chromas、BioEdit等生物信息学分析软件。
操作及问题：一、Primer Premier5、Oligo7、BLAST常规引物设计本部分操作将使用Primer Premier5、Oligo7、BLAST等软件及工具设计拟南芥AtBADH基因编码区全长特异引物。
（参考“第四章引物设计及测序结果分析”课件）（一）使用Primer Premier5搜索引物1、在NCBI数据中查找登录号为NM_001198470的序列记录，查阅相关信息，并下载序列将其保存为fasta格式文件。
问题1：该序列是什么类型的序列？该序列编码区在什么位置？2、打开Primer premier5软件，点击键ctrl+V将上一步中下载的序列粘贴入弹出的GeneTank窗口中（或者点击。
3、点击GeneTank窗口中左上角的Primer premier窗口中点击Search Criteria窗口中根据要求选择合适选项及参数，选定后，点击Search Progress窗口中有Search Results窗口；如没有出现数重新搜索引物。
生物信息学PCR引物设计
一般原则
4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高 或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC含量不能相差太大。 不同的算法推荐45-55%或50-60%
一般原则
5. ∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由能， 该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳 定性。应当选用3’端∆G 值较低（绝对值不 超过9），而5’端和中间∆G 值相对较高的 引物。引物的3’端的∆G 值过高，容易在错 配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应 。（能值越高越容易结合）
可以在5’端前添加G或C以提 高Tm值，或加入酶切位点， 然后再做Analyze。
决定后，将该引物选中，Ctrl+C、Ctrl+V粘贴： GCCAGTTCTGATATTTACACC
同理，编辑并保存下游引物
下游引物：AATGAAATCCAGTACGCTTC，方向默认是5’→3’
4.6 引物的二次筛选
3’ΔG的绝对值不要超过9，否则会在错配点形成双链
接下来进行引物具体分析。 点击Analyze
分析二聚体和发夹结构 点击Analyze – Duplex Formation – Forward Primer
上游引物间形成二聚体 要求ΔG小于4.5，配对碱基对不超过3
发夹结构 要求ΔG小于4.5，配对碱基对不超过3
会弹出一个页面有10秒钟的 更新提示
图形示意结果
带有genbank的链接，点击可以进入 相应的genbank序列 匹配序列描述
具体匹配情况
将四条序列保存在一个txt文档中 匹配情况，分值，e值
24
4.3 DNAMAN 同源序列比对获取保守区域
4.4 Primer Primier引物设计与筛选
三、引物设计流程
基因工程选引物的典型例题及解析
基因工程选引物的典型例题及解析基因工程是一门前沿的生物学技术，它涉及到对生物体的基因进行改造和调控。
在基因工程中，选取合适的引物是至关重要的一步，因为引物的选择直接影响到基因工程的成功与否。
下面我们将以典型例题及解析的方式来讨论基因工程选引物的重要性和方法。
典型例题：假设你需要在实验室中进行一项基因工程实验，要求你设计引物来扩增目标基因。
目标基因的序列如下：5'-ATGCTAGCTAGCTAGCATG-3'。
请设计适合的引物序列。
解析：在设计引物时，需要考虑引物的长度、GC含量、配对性和特异性。
在这个例题中，我们需要设计一对引物来扩增目标基因。
首先，我们需要选择两个合适长度的引物序列，通常引物的长度在18-25个碱基对之间。
其次，引物的GC含量应该在40-60%之间，以确保引物的稳定性和特异性。
最后，引物的配对性和特异性也是非常重要的，避免引物与非目标序列产生杂交反应。
根据上述要求，我们可以设计如下两个引物序列：引物1，5'-ATGCTAGCTAGCTAGC-3'。
引物2，5'-CATGCTAGCTAGCTAGC-3'。
这两个引物序列分别位于目标基因的起始和终止序列上，长度适当，GC含量合适，并且具有良好的特异性和配对性。
在基因工程实验中，选取合适的引物是成功的关键之一。
通过合理的引物设计，可以有效地扩增目标基因，为基因工程实验的顺利进行提供了重要保障。
总结：基因工程中选取合适的引物是至关重要的一步，它直接影响到基因工程实验的成功与否。
在设计引物时，需要考虑引物的长度、GC含量、配对性和特异性等因素，并且要根据目标基因的序列特点来进行合理的选择和设计。
只有通过精心设计的引物才能确保基因工程实验的顺利进行，为相关研究和应用提供坚实的基础。
PCR引物设计实验
PCR引物设计实验PCR（聚合酶链式反应）是一种体外体温聚合酶链式反应，用于扩增DNA序列。
PCR引物是扩增特定DNA片段所需的短DNA序列，它们在PCR反应中与模板DNA序列特异性结合，并在DNA复制过程中提供扩增起始点。
因此，PCR引物设计的优劣直接影响PCR扩增的特异性和效率。
1.目标DNA序列选择和分析：首先，需要选择并分析目标DNA序列。
这可以通过参考已知序列数据库或使用DNA测序实验获得。
2.引物长度和理化性质选择：PCR引物的长度通常在18-30个碱基对之间，最好是20-25个碱基对。
引物长度的选择应考虑到特异性和扩增效率等因素。
此外，引物的理化性质也需要考虑，如GC含量、熔解温度和互补性等。
3.引物设计原则：引物一般分为前导引物和反导引物。
其设计应符合一定的原则，如：-引物长度相似：前导引物和反导引物的长度应相似，以提高扩增的特异性和效率。
-避免或最小化引物自身或引物间的互补性：互补性会导致非特异性扩增或导致自身产生二聚体。
-避免引物末端的非特异性：尽量避免或减少末端碱基对的非特异性，以提高特异性和扩增效率。
-避免引物末端的重复序列：重复序列容易导致非特异性扩增和有害的寡聚物形成。
4.引物序列分析和验证：设计好的引物序列需要进行一系列的分析和验证。
包括序列比对和互补性分析，以确定引物与目标DNA的特异性。
此外，还可以使用特定的软件工具进行引物性能和二聚体预测等分析。
5.引物合成和质量控制：设计好的引物需要通过化学合成获得。
合成后，需要进行质量控制以确保引物的纯度和质量。
6.引物应用实验：设计好和验证过的引物可用于PCR实验。
在PCR反应中，需要优化引物浓度、引物与模板DNA的比例、反应条件等因素，以获得最佳的PCR扩增效果。
总之，PCR引物设计是PCR实验的重要一步。
良好设计的引物具有特异性和高效性，可以提高PCR扩增的成功率和特异性。
因此，在设计PCR 引物时，需要考虑引物长度、互补性、特异性和理化性质等因素，并结合实验验证进行优化。
引物设计实验报告
引物设计实验报告引言引物设计是分子生物学和遗传学研究中的关键步骤之一。
引物是一段特定序列的DNA或RNA片段，用于在聚合酶链式反应（PCR）等实验中定向放大或检测特定的目标序列。
本实验旨在通过合理的引物设计，实现目标序列的选择性扩增，为后续实验与研究提供基础。
实验目的本实验的目的是通过学习引物设计的基本原理和方法，掌握引物的设计步骤，实现对目标序列的选择性扩增。
实验材料与方法实验材料•目标序列：通过测序技术获得的待扩增的DNA序列。
•引物设计软件：如Primer3等提供的引物设计工具。
实验方法1.获取目标序列：使用测序技术获取待扩增的DNA序列，并记录下来。
2.引物设计软件：选择一款合适的引物设计软件，如Primer3等。
3.引物设计参数设置：根据实验需求，设置引物设计的参数，如引物长度、GC含量、Tm值等。
4.引物设计：根据目标序列，在引物设计软件中输入相关信息进行引物设计，生成合适的引物序列。
5.引物评估：使用引物评估软件（如OligoAnalyzer等）评估所设计引物的性能，包括互补性、二聚体形成等。
6.引物合成：将合适的引物序列提交给合成公司进行引物合成。
7.引物验证：使用PCR等技术验证所设计的引物是否能成功扩增目标序列。
实验结果与讨论通过以上的实验方法，我们成功地设计了一对合适的引物，并利用PCR技术进行了验证。
我们发现，所设计的引物能够选择性地扩增目标序列，而不会引起非特异性扩增。
在引物设计过程中，我们需要注意以下几点：- 引物长度：引物的长度应适中，通常选择15-25个碱基对。
- GC含量：引物中GC含量的选择对扩增效果有重要影响，一般控制在40-60%之间。
- Tm值：引物的熔解温度（Tm值）应相近，避免引物间的二聚体形成。
- 引物特异性：通过引物评估软件进行评估，确保引物与非目标序列无或低互补性。
- 引物合成：选择可靠的引物合成公司进行合成，确保引物的质量。
引物设计的成功与否对后续实验的可靠性和准确性具有重要影响。
引物设计实例分析DJ
第一步：检索DJ-1mRNA基本序列
LOCUS NM_057143
1097 bp mRNA linear ROD
1 gtgccgagca cagttactgg aaggcttaac caaagttttg atgcctggga accgcgcagg 61 aaaaacacgc ggaacgtgct tcacagtggc ggctaactgc tctcgttcgc tgtgcagagc 121 cgtctggcag ggttgacctc ctaaagggat attccatctt tattaatcat tagtagtgtg 181 gtcagagact tagcaccatt ggtctccccc aacctggtcc agacatttca gcagtttatc 241 ggaacagcaa caacagcaac aaaaccttca aaatttacaa gtctttaaga aatagaaatg 301 gcatccaaaa gagctctggt catcctagcc aaaggagcag aggagatgga gacagtgatt 361 cctgtggaca tcatgcggcg agctgggatt aaagtcaccg ttgcaggctt ggctgggaag 421 gaccccgtgc agtgtagccg tgatgtagtg atttgtccgg ataccagtct ggaagaagca 481 aaaacacagg gaccatacga tgtggttgtt cttccaggag gaaatctggg tgcacagaac 541 ttatctgagt cggctttggt gaaggagatc ctcaaggagc aggagaacag gaagggcctc 601 atagctgcca tctgtgcggg tcctacggcc ctgctggctc acgaagtagg ctttggatgc 661 aaggttacat cgcacccatt ggctaaggac aaaatgatga acggcagtca ctacagctac 721 tcagagagcc gtgtggagaa ggacggcctc atcctcacca gccgtgggcc tgggaccagc 781 ttcgagtttg cgctggccat tgtggaggca ctcagtggca aggacatggc taaccaagtg 841 aaggccccgc ttgttctcaa agactagaga gcccaagccc tggaccctgg acccccaggc 901 tgagcaggca ttggaagccc actagtgtgt ccacagccca gtgaacctgg cattggaagc 961 ccactagtgt gtccacagcc cagtgaacct caggaactaa cgtgtgaagt agcccgctgc 1021 tcaggaatct cgccctggct ctgtactatt ctgagccttg ctagtagaat aaacagttcc
PCR引物设计范文
PCR引物设计范文PCR（聚合酶链反应）是一种快速、敏感和精确的基因扩增技术，已在分子生物学领域得到广泛应用。
PCR引物设计是PCR实验的关键步骤之一，合理设计的引物可以确保特异性扩增目标序列，并提高PCR的效率和成功率。
本文将讨论PCR引物设计的原理、策略和工具。
PCR引物设计的基本原理是通过寻找目标序列特异性区域，设计长度约为20-30个核苷酸的引物对，以特异性地扩增目标序列。
引物设计过程中需要考虑以下几个方面的因素：引物长度、GC含量、引物二聚体和自相互二聚体、特异性和特征序列。
首先，引物长度应在20-30个核苷酸左右，一般选择长度为18-25个核苷酸。
引物过短可能导致非特异性扩增，引物过长可能会影响PCR扩增效率。
其次，GC含量是指引物中GC碱基的百分比。
引物中的GC含量应在40-60%之间，GC含量过高或过低都可能导致非特异性扩增或低扩增效率。
高GC含量引物有助于引物与目标序列的稳定结合，但也容易引起引物二聚体形成。
低GC含量引物则增加了引物的特异性和稳定性。
引物二聚体和自相互二聚体是指引物之间或引物自身形成的二聚体结构。
这些结构会影响PCR扩增效率和特异性。
引物设计时需要避免引物二聚体和自相互二聚体的形成。
一种常用的方法是使用在线工具进行计算和分析。
特异性是指引物能够特异性地与目标序列结合并扩增，不与非目标序列结合。
特异性验证是引物设计的关键步骤之一、可以通过BLAST分析，在数据库中比对引物序列，以确保引物特异性。
此外，还可以进行聚合酶链反应的温度梯度试验来检查引物特异性。
在PCR引物设计中，还可以使用一些在线工具和软件来辅助引物设计。
一些常用的工具包括Primer3、OligoAnalyzer等。
这些工具可以根据输入的目标序列自动设计引物，并同时提供一系列引物参数的分析和评估。
对于复杂的目标序列设计，还可以使用引物库策略。
引物库是一种引物设计的集合，可以提高目标序列扩增的成功率。
引物设计方法与分析
引物设计方法与分析查找基因相关信息在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。
2.4.2 用Primer Premier5搜索引物(1) 打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内(选择As)，此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。
点击Primer，进入引物窗口。
(2) 此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。
在Search Parameters里面，可以设定相应参数。
一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择 300～500bp。
(3) 点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分(Rating)排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。
82(4) 对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。
此窗口中需要着重查看的包括：Tm应该在55～70度之间，GC%应该在45%～55%间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。
该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。
若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。
最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。
引物设计实验报告
引物设计实验报告引物设计实验报告引物设计是分子生物学和遗传学研究中的重要环节，它的质量直接影响到实验结果的准确性和可靠性。
本实验旨在通过引物设计和合成，验证其在PCR扩增反应中的效果，并探讨引物设计的相关原则和方法。
一、引物设计原则引物设计的原则主要包括以下几个方面：1. 引物长度：引物的长度通常在18-30个碱基对之间，过短的引物可能导致扩增特异性降低，而过长的引物则可能影响扩增效率。
2. 引物的GC含量：引物的GC含量应控制在40-60%之间，过高或过低的GC 含量可能影响引物的特异性和扩增效率。
3. 引物的熔解温度：引物的熔解温度应在55-65摄氏度之间，以保证引物与模板DNA的特异性结合。
4. 引物序列的特异性：引物序列应与目标DNA序列的特异性高度匹配，以避免非特异性扩增。
二、引物设计方法本实验采用了两种常用的引物设计方法：基于序列比对和基于引物设计软件。
1. 基于序列比对的引物设计首先，通过数据库检索和文献研究，获取目标DNA序列及其相关信息。
然后，利用序列比对软件将目标DNA序列与已知引物序列进行比对，寻找与目标DNA序列高度匹配的引物序列。
最后，根据引物设计原则，选择合适的引物序列进行合成。
2. 基于引物设计软件的引物设计引物设计软件可以根据输入的目标DNA序列，自动设计合适的引物序列。
其中，常用的引物设计软件包括Primer3、Primer-BLAST等。
通过输入目标DNA序列，设置相关参数（如引物长度、GC含量等），软件会自动生成合适的引物序列。
三、实验步骤1. 目标DNA序列的获取从数据库中获取目标DNA序列，或者通过实验室已有的DNA样本提取目标DNA。
2. 引物设计根据引物设计原则和方法，选择合适的引物序列。
可以通过基于序列比对或引物设计软件进行引物设计。
3. 引物合成将设计好的引物序列提交给合成公司进行引物合成。
4. PCR扩增反应利用合成的引物进行PCR扩增反应，根据实验需求选择相应的PCR条件。
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引物设计基本原则
• • • • • 引物长度（primer length） 产物长度（product length） 序列Tm值 (melting temperature) G+C含量（composition） 引物二聚体及发夹结构 （duplex formation and hairpin） • 阅读框
4. 引物的GC含量
有效引物中(G+C)的比 例为40-60%，过高或过低都 不利于引发反应。上下游引 物的GC含量不能相差太大。
5. 引物自身
引物间3’端的互补、二聚体 或发夹结构也可能导致PCR反应 失败
TGAGCGCGTTTGGATCTGCGAGGGCAATCGCTCAGATGTTCCCCTAACCCAAC CCGGGAACGGACCGGAGGGAACCGCAGCATGGGGAATGCCGCGTCTCGTCG CAAGGCTCATTTTTAGTTGTGGGTCATAGGGCGGGCAGCTTTATCTGATCAAG GGCCGGGGCACAAGGGTCCTGGTACTATCCAGGTGCGAAGAACCCCGGAGGT TACTGCAATGAGCAGAAATATTACTCACCGGCCTAAACGACGAGCAAACACTC GAACGTGAAAGCAAGGGATCGCCCAACCAATGGACGAGCCCGAGGCGGTAG GAGAGAGGGAGGCAAGAACCATACTTTCAGAGAAGTGGCGGTCCGAATCTTA TCTGAACTACGAGAATAACTTACTAAGCCGTGCCATAAGGGTCATTCTCCAAAC GGGACGGGGCCAAGCCTTTAGGTTCTTTAAGTAGGTTGGGTGACAGATCGGC CATAGGAGTACTCCGGGAGATAAACCAGGGCAACAAATGTCGAGCATACGACG ATGCCGCCCGTTTTCATTTCGTGGAAGTCCCCGGCAGAGGAAAGGGCTGTAG GTGATGGCGCGTTCCGCTTCTTATCTAGAGGGAGGCGCTGAAATCGTTCCTAT TGGGTCGTGCGTGGCAGCTGGTATAGATGAATAAAGGCGGGGCGCTTGAATG GAGCCTATTCTCTTAAGGCGGGAAAGCTTAATAGGAACGGGGCCGAGCTGAC TGATGAGTGCCTTTTTAGTTTTAGTCTTTAGAAAAAGGCTATCATGTGATGTCG GGCTAATACGGGTGGCTACATACAAGTATAGCCAAATCAAGATGAGACGGGAC GGACGGTCAGAGGCGGGACTACCATAAGGAAAGCCCGCCCCCGCTAGCTAAC ATAGAAAGAAATCTATTCCCGGATAGCAGAGTATCTATGTGAATCTCTTCCAGA TAGCCAGGCCGAATCGGGGCCACCCCTTGGGCTGGGGAATGGGCGCAGCCC ACATGCATCAATTTGATG
1. 引物的长度
一般为15-30bp，常用的是1827bp，但不能大于38，因为过长 会导致其延伸温度大于74℃，即 Taq酶的最适温度
2.产物的长度
扩增片段长度为100~600碱基对.
3. Tm值
引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一 般不超过2度. 如果引物中的G+C含量相 对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一 定的退火温度. Tm=2(A+T)+4(C+G)
•
Hale Waihona Puke CAGTGGAATGAGCCTTGGTATGGAACCTACCAAGTGATAACTTTCAAATTC AGAGAAACCCTGGAATTAAAAATGGGCAATCCTGAGCCAAATCCCGTTTTA TGAAAAGAAACAAGGGTTTCAGAACGCGAGAATAAATAAAGGATAGGTGC AGAGACTCAATGGAAGCTGTTCTAACAAATGGAGTTGGCTACATTATGTTC GTAAAGGAATCCTTCCATCGAAACTTCGGAAAGGATGAAAGGGAAACATAT ATCCATATGTATACTTCCTGAACTACTATCGCCAAATGATTAAAAATGATTA ATGACGACTCCAAGCGGTTCTATAATTTTTTTATATCTATGTTTATATGAAA AATAAAAGAATTTTTTTGAATCAATTCCAAATCAAAATTAAAAAAAAGAAT CAAATATTCATAGATCAAATCATCCACTCCATCATAGTCTGATAGATCTTTT TAAGAATTGATTAATCGGATAAGAATAAAGATAGAGTCCCGTTTTACATGT CAATATCGACAACAATGAAATTTATAGTAAGAGGAAAATCCGTCGACTTTA GAAATCGTGAGGGTTCAAGTCCCTCTATCCCCAAAAAGACCTGCTTGTCTCC CTAATTCTTTATCTTCTCATTTTGTTAGCAACTCCAAATTTGCTATGCTTCTT AAGTCATTCTCACCCTACTCTTTCACACTTTCACAAACACATTTTTTTTTCTT ATCCCACCACAAGTCTTGCGTGTGATATATATGATATATGTTCAAATGCAAA TGAACATCTTTGAACAATGTATTAAACTTAAATAATTAACAATCCATATGAT TATTTGTACTGTATTGTACAAAGTTTTCTTTTTGAAAATACAAGAAATTCTA ATGGAGCCCATATATTACTTTGTAATAGCTTTTAGTTTTTTTAATTGACATTG ACCCAAGTCCTCTATTAAAATAAACTAAATAAAGTGAGGATGATGCGTCAT GATGGTCGGGATAGCTCAGCTGGTAGAGCAGAGGACTGAAAATCCTCTACC CCCTTTCTCAATAAA