基因文库的构建
一代基因测序实验步骤
一代基因测序实验步骤
引言
一代基因测序是研究基因组结构和功能的重要手段之一。本文将介绍一代基因测序的实验步骤，包括DNA提取、文库构建、测序仪运行和数据分析等关键步骤。通过这些步骤，科研人员可以获取基因组的序列信息，从而进一步深入研究基因的功能和变异等信息。
一、DNA提取
DNA提取是一代基因测序的第一步，目的是从样本中提取出高质量的DNA。常用的DNA提取方法有酚-氯仿法、盐法和商业化提取试剂盒法等。首先，将样本细胞破碎，使DNA释放出来。然后，通过一系列的溶解、沉淀和洗涤步骤，去除杂质并纯化DNA。最后，使用适当的缓冲液溶解DNA，使其可用于后续的实验步骤。
二、文库构建
文库构建是一代基因测序的关键步骤，其目的是将DNA样本转化为适合测序的文库。文库构建包括DNA片段的剪切、连接、扩增和纯化等步骤。首先，将DNA样本通过限制性内切酶或超声波等方法剪切成适当大小的片段。然后，将DNA片段连接到适当的载体上，形成文库。接着，通过PCR扩增文库，使其含有足够数量的DNA分子。最后，通过凝胶电泳等方法，纯化文库，去除杂质。
三、测序仪运行
文库构建完成后，需要将文库装入测序仪中进行测序。测序仪是一种高通量测序设备，能够快速、准确地测定DNA分子的序列。测序仪根据不同的技术原理，如Sanger测序、Illumina测序、Ion Torrent测序等，进行测序反应。在测序反应中，测序仪会读取DNA分子上的碱基信息，并将其转化为电信号。最后，通过计算机软件将电信号转化为DNA序列。
四、数据分析
测序仪运行完成后，会生成大量的原始测序数据。为了获取有意义的信息，需要进行数据分析。数据分析包括质量控制、数据预处理、序列比对、变异检测和功能注释等步骤。首先，对测序数据进行质量控制，去除低质量的测序片段。然后，对测序数据进行预处理，包括去除接头序列、剪切低质量碱基等。接着，将预处理后的序列与参考基因组进行比对，寻找序列的起源和位置。最后，通过比对结果进行变异检测和功能注释，挖掘序列中的重要信息。
cdna基因文库构建的基本路线
cdna基因文库构建的基本路线
以cdna基因文库构建的基本路线为标题的文章
概述
CDNA基因文库是基因组学研究中的一个重要工具，可以用于克隆和表达特定基因。本文将介绍构建cdna基因文库的基本路线，包括RNA提取、逆转录、cDNA合成、文库构建和筛选等步骤。
第一步：RNA提取
构建cdna基因文库的第一步是从所研究的生物样品中提取总RNA。这可以通过使用商业化的RNA提取试剂盒或经典的酚-氯仿法等方法来实现。在提取RNA的过程中，需要注意样品的保存和处理，以确保所提取的RNA完整无损。
第二步：逆转录
逆转录是将RNA转化为相应的cDNA的过程。逆转录反应通常使用逆转录酶（Reverse Transcriptase）进行，该酶能够将RNA模板上的信息转录成DNA。在逆转录反应中，需要加入随机引物、dNTPs和逆转录酶，以及适当的缓冲液。逆转录反应的温度和时间也需要根据具体的逆转录酶和反应体系进行优化。
第三步：cDNA合成
在逆转录反应完成后，需要对产生的cDNA进行纯化。一种常用的方法是通过酶切和连接反应，将cDNA连接到载体上，形成重组
DNA，再通过转化等方法将其导入到大肠杆菌等宿主中。在cDNA 合成的过程中，需要注意对cDNA的纯化和测序质量的控制，以确保所获得的cDNA具有高质量和完整性。
第四步：文库构建
文库构建是指将cDNA插入到合适的载体中，形成cdna基因文库。常用的载体包括质粒和噬菌体等。在文库构建的过程中，需要对cDNA和载体进行受限酶切，然后使用DNA连接酶将其连接起来。连接后的DNA需要进行转化，将其导入到适当的宿主细胞中，形成文库。不同的文库构建方法有所差异，可以根据实验需求选择合适的方法。
怎样构建基因组文库
第四章
基因文库的建立
基因文库(gene library) 基因组文库(genomic library) cDNA文库(cDNA library)
第一节
基因组文库的构建
定义:
含有某种生物全部遗传信息的重组DNA分子的克隆总和。
一. 基因组文库的规模
N= ln（1-P） ln（1-f）
N—基因组文库克隆总数 P—所需机率 f—插入片段与基因组DNA长度之比
载体DNA XhoI or SalI酶切 补CT 连接 重组DNA 供体DNA Sau3AI部分酶切 补AG
4. 采用文库快速构建法以避免扩增文库时DNA丢失
H Ori
H Ori
COS
利 用 单 质 粒 载 体 文 库
B cos
B cos
Ap r Ap r
Hind Cos
H
S
H
S1 Cos
S
BamH I 大片段 Cos
5. 基因组文库的扩增
包装的λ颗粒 感染E.coli 培养 分离λ颗粒 -70℃保存
五. 利用COS质粒载体构建基因组文库
构建过程与λ载体构建过程相似: 两臂DNA片段的制备, 供体DNA片段的制备，两DNA的连接和重组DAN分子的包 装。单COS质粒载体和双COS质粒载体构建基因组文库。
基因组文库构建
(1)细菌人工染色体(bacterial artificial chromosomes, BACs, fosmids) 基础：大肠杆菌F质粒 导入宿主：电转化 载体筛选：显性选择标记重组筛选：插入片段 大小供体DNA大小：>300kbp主要应用：大基因 组分析评论：低频率的重排和嵌合分子。载体 在每个细胞中维持一个或两个拷贝，产生少量 供体DNA。
PAC(P1 人工染色体 ) BAC( 细菌人工染色体 ) MACs( 哺乳类人工染色 体)
细菌噬菌体 P1 F 质粒 基于 Epstein-Barr 病 毒的游离载体
100 ～300kb 300kb >300kb
人类人工游离染色体 (human artificial episomal chromosome,HAEC)是一类发展 中的 MACs, 它来自于 Epstein-Barr 病毒
真 核 基 因 组 DNA
λ 取 代 型 λ 噬 菌 体 载 体
COS C h a ro n 4 A 机 械 剪 切 E coR I E coR I 酶 切 加 人 工 接 头 酶 切
连 接
cos
体 外 包 装
cos
转 染 E .c o li
三.质粒载体构建cDNA文库
双 链 质 粒 DNA 5’ pB R322 5’ 3’ RT 酶 限 制 酶 用 N aO H 降 解 m R N A 用 K le n o w 酶 合 成 第 二 链 3’ A A A AA An 加 锚 定 引 物 (寡 聚 T ) 3’ AA A A An 5’ TTTT
基因文库的构建与使用
基因文库的构建与使用
在生物科学领域，基因文库的构建和使用是研究基因功能和生物多样性的重要工具。基因文库是指包含某种生物全部基因的克隆文库，它可以为我们提供深入了解该生物基因组的信息。本文将详细介绍基因文库的构建与使用，包括基因文库的基本概念、构建方法、使用方法以及优势和展望。
一、基因文库的基本概念和作用
基因文库是包含某种生物全部基因的克隆文库，它为我们提供了该生物基因组的全面信息。构建基因文库的目的是为了方便研究者们筛选、分析和研究基因的功能以及多样性。基因文库可以用于寻找基因的新颖功能、发现新的药物靶点以及为基因组编辑和改造提供资源。
二、构建基因文库的方法
构建基因文库主要包括以下步骤：
1、基因组文库的构建：首先需要获得该生物的基因组，然后将基因
组进行分解，形成一系列重叠的DNA片段。这些片段经过纯化、扩增和克隆到特定的载体中，形成基因组文库。
2、表达文库的构建：为了筛选出具有特定功能的基因，还需要构建表达文库。表达文库中的基因需要在特定的细胞或组织中表达，以便研究者们能够确定基因的功能。
在构建基因文库时，需要考虑到基因的种类、基因表达水平以及克隆载体的选择等因素。这些因素都会影响到基因文库的质量和实用性。
三、基因文库的使用方法
使用基因文库可以方便地筛选和研究基因的功能。以下是如何使用基因文库的一般步骤：
1、选择相应的基因文库：首先需要选择包含所需基因的文库。如果研究目标是寻找特定功能的基因，可以选择包含该功能基因的文库。
2、筛选候选基因：根据研究目标，可以在文库中进行筛查，挑选出可能具有所需功能的候选基因。
基因文库的构建
*
*
放射性标记的DNA
*
凝胶电泳
* B* * ** *
B
A
C
细胞蛋白质提取物
* 蛋白质与DNA结
合
DNA-蛋白质结 合物电泳迁移缓
慢
放射自显 影
滞后带表明DNA与 蛋白质结合
凝胶阻滞实验的基本原理图
放射性标记的DNA由于同一种细胞蛋白质B结合，于是在凝胶 电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带
衔接头：一端为平头，一端为粘末端。
（2）cDNA与载体相连
cDNA与一个载体在T4连接酶作用下以粘末端 互相连接，即为重组DNA 分子。
（3）导入宿主细胞 重组体在一定条件下导入宿主细胞培
养或保存。 宿主细胞必须是来自一个细胞的克隆
体，以保证它们的遗传性状相同。
筛选目的基因
⑴ 核酸杂交法 特殊标记的寡核苷酸链为 探针
（a）没有加入竞争DNA的正常的凝胶阻滞实验，探针DNA与特异蛋白质结合， 出现阻滞条带；（b）加入的超量竞争DNA与探针DNA竞争结合同一种蛋白质， 阻滞条带消失；（c）竞争DNA与探针DNA分别结合不同的蛋白质，出现同（a ）一样的阻滞条带。
凝胶阻滞实验能揭示在体内发生的DNA与蛋 白质之间的相互作用的有关信息，但无法确 定两者结合的准确部位。而DNaseⅠ足迹 实验可以解决这个问题
提示语
基因文库的构建
染色体走读法（chromosome walking）
亚克隆旁测序列
走读的起点克隆片段 探针标记
第一轮杂交 第二轮杂交
第二轮杂交
阳性克隆
阳性克隆
染色体走读法（chromosome walking）
走读的起点克隆片段
基因文库的构建程序
从基因文库中筛选目的基因
密集铺板（1-10万）
目的重组克隆
杂
挖
铺
铺
交
取
板பைடு நூலகம்
板
基因文库的构建程序
基因文库构建的技术性问题
在基因组文库的构建过程中，最应引起重视的问题是： 严禁外源DNA片段之间的连接！！！ 为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合：
将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离 用碱性磷酸单酯酶除去DNA片段的末端磷酸基团 用TdT酶在DNA片段的末端上增补同聚尾末端
基因组文库（含有全部基因） cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）
基因文库的基本概念
基因文库构建的基本战略
用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体DNA 用cDNA法构建cDNA文库，材料来自mRNA
在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA 种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库 一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA 文库等。很显然， cDNA文库的信息量远小于基因组文库
文库构建
优点
酵母细胞比大肠杆菌对不稳定的、重复的和极端的 DNA 有更强的容忍性。
6. BAC文库
指一种以F质粒（F-plasmid）为基础建构而成的细 菌染色体克隆载体，常用来克隆150kb左右大小的DNA片 段，最多可保存300kb个碱基对。
YAC 载体中最常用的是 pYAC4
为了方便制备YAC载体， YAC 载体以环状的方式存在， 并增加了普通大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记， 以便保存和增殖。
YAC 载体的复制元件
·端粒重复序列（telomeric repeat ， TEL）：定位于 染色体末端一段序列，用于保护线状的 DNA 不被胞内的核 酸酶降解，以形成稳定的结构。
(五)构建双杂交体系的穿梭质粒
1. 穿梭质粒（shuttle plasmid） 既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母 菌中复制和表达的质粒。
2. 双杂交体系需要两种穿梭质粒 分别携带已知的靶蛋白基因和携带 未知基因序列。
（1）BD-plasmid 靶基因按正确的读码结构和取向克隆在 GAL4的BD之后。
N DNA binding domain
Active domain C
结合
结合
激活转录
上游激活序列（UAS） 转录机 GAL4效应基因
实验发现：
构建cdna文库的基本步骤
构建cdna文库的基本步骤
《构建cDNA文库的基本步骤》
引言：
cDNA文库的构建是基因组研究中重要的实验技术之一，它可以利用转录酶逆转录RNA为cDNA，然后将其插入适当的载体中，最终形成一个具有表达能力的基因文库。本文将介绍构
建cDNA文库的基本步骤。
一、总RNA的提取
首先，需要从细胞或组织中提取总RNA，并保证RNA的完整性和纯度。常用的提取方法包括
酚/氯仿法、硅胶柱法等。提取得到的总RNA可以用琼脂糖凝胶电泳进行分离和检测。
二、逆转录反应
逆转录反应是将RNA逆转录为cDNA的过程。在逆转录反应中，需使用逆转录酶、引物和核
苷酸等。逆转录酶能合成第一链cDNA，引物通常采用寡聚dT引物或随机引物。
三、DNA合成和连接
在逆转录反应后，需要使用DNA聚合酶和核苷酸进行第二链cDNA的合成。然后，将合成的cDNA连接到选择的载体上，常见的载体有质粒、噬菌体等。连接过程一般采用连接酶催化反应。
四、转化和筛选
将连接好的载体转化到合适的宿主细胞中，可以通过热冲击法、电穿孔法等方法进行转化。之后，将转化后的细胞涂在筛选板上，并在含有抗生素的培养基上筛选，筛选出含有目标基因的
克隆。
五、鉴定和分析
最后，对构建好的cDNA文库进行鉴定和分析。可以利用限制性内切酶等方法进行单克隆检测和鉴定，也可以通过PCR扩增目标基因进行进一步分析。
结论：
构建cDNA文库是一项关键的技术，它为基因组研究提供了丰富的资源。通过提取总RNA、
逆转录反应、DNA合成和连接、转化和筛选，最终可以得到一个具有表达能力的cDNA文库。这些步骤的顺利进行和准确操作，对于后续的基因组研究具有重要意义。
基因文库构建的过程、原理及方法
基因⽂库构建的过程、原理及⽅法
基因⽂库构建的过程、原理及⽅法
1 cDNA ⽂库的构建
1.1 cDNA ⽂库构建的基本原理与⽅法
cDNA ⽂库是指某⽣物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA ⽚段与某种载体连接⽽形成的克隆的集合。经典 cDNA ⽂库构建的基本原理是⽤ Oligo(dT) 作逆转录引物，或者⽤随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得⽂库。
其基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取⽅法的选择主要根据不同的样品⽽定)，要构建⼀个⾼质量的 cDNA ⽂库，获得⾼质量的 mRNA 是⾄关重要的，所以处理 mRNA 样品时必须仔细⼩⼼。由于RNA 酶存在所有的⽣物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建⽴⼀个⽆ RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。在获得⾼质量的 mRNA 后，⽤反转录酶 Oligo(dT) 引导下合成 cDNA 第1链， cDNA 第2链的合成(⽤ RNA 酶 H 和⼤肠杆菌 DNA 聚合酶 I，同时包括使⽤ T4 噬菌体多核苷酸酶和⼤肠杆菌 DNA 连接酶进⾏的修复反应)，合成接头的加⼊、将双链DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插⼊⽚断，扩增 cDNA ⽂库、对建⽴的 cDNA ⽂库进⾏鉴定。这⾥强调的是对载体的选择，常规⽤的是λ噬菌体，这是因为λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可⽤来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳⼤⽚段的外源 DNA。
基因组文库与cdna二课的区别
基因组文库与cdna二课的区别
基因组文库与cDNA文库是两种常用的DNA文库构建方法，在基因组学和转录组学研究中扮演着重要的角色。本文将从构建方法、应用领域和优缺点三个方面对两者进行比较。
一、构建方法
1. 基因组文库构建方法：基因组文库是由整个基因组DNA片段组成的文库。构建基因组文库的关键步骤包括DNA提取、DNA片段切割、连接到载体、转化到宿主细胞等。其中，DNA片段切割通常使用限制性内切酶，将基因组DNA切割成特定大小的片段，然后将片段连接到载体上，最后转化到宿主细胞中。
2. cDNA文库构建方法：cDNA文库是由转录本（mRNA）反转录合成的互补DNA（cDNA）片段组成的文库。构建cDNA文库的关键步骤包括RNA提取、反转录、合成第一链、合成第二链、连接到载体、转化到宿主细胞等。其中，反转录是将mRNA作为模板，使用逆转录酶合成cDNA的过程，合成的cDNA片段具有转录本的特异性。
二、应用领域
1. 基因组文库的应用领域：基因组文库广泛应用于基因组测序、基因定位、基因组结构和功能研究等。通过对基因组文库进行测序，可以获取到整个基因组的序列信息，进而进行基因组注释、基因定位、重测序等研究。此外，基因组文库还可用于构建比较基因组文库，用于不同物种之间的基因演化和功能保守性研究。
2. cDNA文库的应用领域：cDNA文库主要应用于转录组学研究，可以用于测定不同组织、不同生长阶段或不同环境条件下基因的表达情况。通过对cDNA文库进行测序，可以获取到转录组的信息，进而进行基因表达差异分析、功能注释、代谢途径分析等研究。此外，cDNA文库还可用于筛选和克隆特定基因。
基因组文库构建的程序
基因组文库构建的程序
基因组文库构建程序
基因组文库构建是基因组学研究中的重要步骤之一，它是将DNA 分子切割成小片段，并将这些小片段插入到载体DNA中，形成文库。文库构建的成功与否直接影响到后续的测序结果和分析结果。因此，开发高效、准确的基因组文库构建程序对于基因组学研究具有重要意义。
基因组文库构建程序的主要步骤包括DNA片段切割、文库构建、文库质量控制等。其中，DNA片段切割是文库构建的关键步骤之一。DNA片段切割的方法有多种，如限制性内切酶切割、超声波切割、化学切割等。不同的切割方法适用于不同的样品类型和研究目的。例如，限制性内切酶切割适用于较小的基因组，而超声波切割适用于大型基因组。
文库构建是基因组文库构建程序的核心步骤之一。文库构建的方法有多种，如插入式文库构建、接头式文库构建等。插入式文库构建是将DNA片段直接插入到载体DNA中，而接头式文库构建则是在DNA片段的两端加上接头序列，再将其插入到载体DNA中。接头式文库构建相对于插入式文库构建具有更高的文库构建效率和更低的文库构建偏差。
文库质量控制是基因组文库构建程序的最后一步。文库质量控制的
目的是检测文库的质量和纯度，以保证后续的测序结果和分析结果的准确性。文库质量控制的方法有多种，如琼脂糖凝胶电泳、荧光定量、质量评估等。其中，质量评估是文库质量控制的重要步骤之一，它可以评估文库的质量和纯度，并确定文库的适用范围和测序深度。
基因组文库构建程序是基因组学研究中不可或缺的步骤之一。开发高效、准确的基因组文库构建程序对于基因组学研究具有重要意义。未来，随着基因组学研究的不断深入，基因组文库构建程序的研究和开发将会越来越重要。
第7章 基因文库的构建
cDNA第一链的合成
cDNA第二链的合成
cDNA第二链的合成
cDNA第二链的合成
cDNA文库构建时载体的选择：
由于绝大多数真核生物的mRNA小于
10 kb，因此用于cDNA文库构建的载体
一个基因文库应该包含的克隆数目与该生物基因 组的大小和被克隆DNA的长度有关。
基因组越大，所需克隆数就越多。克隆时每一个 载体中允许容纳外源DNA片段越长，则所需克隆数越 少。
克隆片段 2×106（细菌） 的平均 大小（bp） 理论数 实际数
5×103 10× 103 20× 103 40× 103 400 200 100 50 1831 919 458 278 基因组的大小（bp） 2×107 （真菌） 3×109 （动物） 理论数 实际数 理论数 实际数 4000 2000 1000 500 18 418 9 208 4 603 2 300 600 000 27 631 109 300 000 1 381 550 150 000 690 774 75 000 354 386
一、基因组文库的构建
外源基因组的获得及DNA大片段的制备 用于构建基因文库载体的制备 载体与外源DNA片段的连接 体外包装及基因组DNA文库的扩增
第三章基因文库的构建
22
第三节：克隆DNA序列的体外诱变
四、引物延伸：单引物法（不依赖PCR反 应）
1、原理 利用一段人工合成的，与互补的序列有一个
碱基错配的寡核苷酸片段（7~20碱基）, 并由该寡核苷酸引导DNA的体外合成。
23
Single-stranded M13 recombinant
A、所需要的重组子少（即文库中包含的 克隆数目较少）。
B、目标基因相对比较完整。
9
第二节 亚克隆
概念：对已经获得的目的DNA片段进程重 新克隆，目的是对目的DNA进行进一步分 析，或进行重组改造等。
过程：1）目的DNA片段和载体制备；2） 目的DNA片段与载体相连；3）连接产物 的转化；4)重组子的筛选
三、定点诱变的PCR方法
根据靶DNA序列设计一对互补的内侧引物c和b’(c和b互 补)，他们在相同的位点具有同样的碱基突变；
分别以左侧引物ac和右侧引物bd进行两轮PCR扩增； 除去未参入的多余引物，由于具有重叠序列，故经变性
和退火形成异源双链分子 其中只有具3’凹陷末端的双链分子可通过TaqDNA聚合
★
G
Chemically synthesized
oligonucleotide
★
Anneal
基因文库的构建
当把大片段DNA片段克隆到高拷贝的载体时，克隆DNA会发生重组，从而影响克隆序列的保真性和稳定性;而单拷贝载体的低产量DNA是高通量分析的瓶颈。这个矛盾常常困扰着研究者。
而EPICENTRE’s CopyControlTM克隆系统是对这些困难的最好的解决方案。CopyControlTM技术整合了单拷贝载体与多拷贝载体的优点。单拷贝载体能提高插入片段的稳定性，而且拷贝载体能在诱导剂的作用下，即时扩增出高拷贝数的克隆而获得高产量的DNA。
N = ln (1 - 0.99) / ln (1 - [106bp / 3 x 109 bp]) = -4.61 / -3.33 x 10-6 = 138,298
六、文库克隆数的确定
基因组DNA文库需要包含足够多的克隆，来保证文库的代表性。一般使用如下的经验公式来确定：
N = ln (1-P ) / ln (1-f ) P是希望得到的覆盖率，f是插入片段大小与基因组DNA大小的比值，N是所需的克隆数。
举例来说，用BAC载体构建人类基因组文库，人类基因组大小为3 x 109 bp,插入片段大小为100kb，希望覆盖率99%，那么所需要的BAC克隆数为
需要注意：
(1)电泳时，要选用合适的DNA Ladder，以保证电泳后可以准确定位所需分子量的DNA。用Epicentre试剂盒构建黏粒文库时，就可以直接采用文库试剂盒内的Control Insert DNA来做marker，既方便又准确。
DNA文库的构建和目的基因ppt课件
30
1、mRNA的制备: 动物细胞或植物细胞mRNA的制备
2、mRNA的来源: 选用mRNA含量高的组织材料，或通过药物等方
法提高mRNA的含量。 3、mRNA完整性的检测
1)mRNA分子的大小：哺乳动物mRNA长度为5008000bp，大部分mRNA位于1.5-2.0kb之间.
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（二）基因组DNA的不完全酶切 1、根据实验需要选择合适的限制性内切 酶 2、分离目的酶切片段大小的确定
a) 克隆单个基因：< 10 kb b) 克隆基因族：< 20kb 3、DNA不完全酶切条件的确定 a) 确定限制酶用量，改变酶切时间 b) 固定酶切时间，改变限制酶的用量
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（三）酶切片段与克隆载体连接
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一、基因文库的筛选 1 表型筛选法
(1)抗药性筛选:这是利用载体DNA分子上 的抗药性选择标记进行的筛选方法。
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(2)插入失活筛选法 经过上述抗药性筛选获得的大量转
化子中既包括需要的重组子，也含有不 需要的非重组子。为了进一步筛选出重 组子，可利用质粒载体的双抗药性进行 再次筛选。
56
(
18
（四）重组ＤＮＡ转化受体细胞 １、根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞 常见的宿主细胞： DH5: 与pUC编码的－半乳糖苷酶氨基端实现互
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基因文库的质量标准
除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：
重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力 载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序 克隆片段易于从载体分子上完整卸下 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选
基因文库的构建程序
基因文库的构建
基因文库的基本概念 基因文库的构建程序（基因组文库和cDNA文库） 基因文库的鉴定和筛选
基因文库的基本概念
基因文库的类别
基因文库（gene library） 从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式 存在（人工构建）。根据基因类型的不同，基因文库分为： 基因组文库（genomic library） 含有全部基因 cDNA文库（cDNA library）含有全部蛋白质编码的结构基因
基因文库的构建程序
cDNA文库的构建流程
随机引物引导的 cDNA 合成是采用 6－10 个随机 碱基的寡核苷酸短片段来锚定 mRNA 并作为反转录的 起点。 由于随机引物可能在一条 mRNA 链上有多个结合 位点而从多个位点同时发生反转录，比较容易合成特 长的 mRNA 分子的 5‘端序列。 随机引物 cDNA 合成的方法不适合构建 cDNA 文 库，一般用于克隆特定 mRNA 的 5' 末端，如 RTPCR 和 5'-RACE 。
4、在考虑把λ噬菌体臂和插入DNA片段连接过程中有两个重要 参数：λ噬菌臂和潜在插入片段的比例、基因组DNA的浓度和 纯度。大约10pgλ噬菌臂和4μgDNA能产生有效地包装。对一 个典型的基因组，要产生一个可表达文库，重组子数一般要 大于1×106~6×l06。 5、包装抽提物的包装效率贮存于液氮中可保持1年多。而在70℃中只能保存几星期，而且包装效率还会降低。由于包装 抽提物的质量是一个关键性因素，商业性包装抽提物，例如 Gigapack（Stratagene），都已有商售。这种包装提取物质量 高，且在体外包装λ噬菌体DNA和插入片段过程能产生大量的 噬菌斑。
基因文库的基本概念
基因文库的类别
用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体DNA
用cDNA法构建cDNA文库，材料来自mRNA
在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA
种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库 一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA 文库等。很显然， cDNA文库的信息量远小于基因组文库。
基因文库的构建程序
cDNA文库的构建流程
Oligo（dT）引导的 cDNA 合成是指 Oligo（dT）引 物与 mRNA 3' 末端的 poly（A）配对，引导反转录酶以 mRNA 为模板合成第一链 cDNA 。 这种 cDNA 合成的方法在 cDNA 文库构建中应用极为 普遍，其缺点是由于 cDNA 末端存在较长的 poly（A） 而影响 cDNA 测序。
基因文库的基本概念
基因文库的类别
根据基因文库的功能不同把基因文库分为克隆文库和表达文库。 克隆文库：克隆载体 表达文库：表达载体（融合蛋白和天然蛋白表达载体） 蛋白质表达文库
基因文库的基本概念
基因文库的类别
根据载体的不同把基因文库分为质粒文库 噬菌体文库 黏粒文库 人工染色体文库 不同的载体适于构建不同的文库！
基因文库的构建流程
组织
mRNA
cDNA 载体
DNA
部分酶解 DNA DNA长度分级 可克隆之DNA DNA与载体连接 引入宿主细胞
双链cDNA
筛选出所需 要的克隆
鉴定文库的完备性
扩增后供长 期储存
基因组文库和cDNA文库的比较
基因组文库
信息供体 载体 连接前 连接 筛选 DNA 噬菌体，黏粒，人工染色体 部分酶切，分级分离 粘端连接，人工接头 核酸探针
3‘ HO
G 5‘ppp’5 G
3‘ HOCCCCCCC 3‘ HOCCCCCCC
退火
3‘ HOCCCCCCC 5‘ pGGGGGGG TTTTTp 5’ Klenow dNTPs
3‘ HOCCCCCCC 5‘ pGGGGGGG
TTTTTp 5’ AAAAAOH 3’
cDNA法克隆目的基因的基本战略
用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌
基因文库的构建程序
②基因组DNA的制备
为了最大限度保证基因在克隆过程中的完整性， 用于基因组 文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的
DNA分子量越大（至少是插入片断大小的3－5倍），文库的重组率
和完备性也就越高。 用常规方法制备的染色体 DNA的长度一般在100 kb左右 如果先将细胞固定在低融点凝 胶中，然后置入含有SDS、蛋
基因组文库的构建流程 cDNA文库的构建流程
基因文库的构建程序
基因组文库的构建流程 ① 载体的选择和制备； ② 高纯度、大分子量基因组 DNA 的提取； ③ 基因组 DNA 的部分酶切与分级分离； ④ 载体与DNA片段的连接； ⑤ 转化或侵染宿主细胞。
基因文库的构建程序
①载体和受体的选择
出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的 l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体 由于绝大多数真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文库构建的载体 通常选质粒或l-DNA 上述几种载体的最大装载量如下： 质粒 l-DNA 考斯质粒 BAC YAC 15 kb 25 kb 45 kb 300 kb 400 kb
基Leabharlann Baidu文库的构建程序
cDNA文库的构建流程
① 细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离； ② 第一链 cDNA 合成； ③ 第二链 cDNA 合成； ④ 双链 cDNA 克隆到载体并导入宿主细胞中繁殖。
基因文库的构建程序
cDNA文库的标准流程
Total RNA的提取 mRNA的分离 cDNA双链的合成 载体的制备 cDNA双链和载体的连接 转化或转染 快速鉴定 pBlueScript cDNA库扩增
OH
5’
3’
Klenow
dNTPs TTTTTTTTTTTTTTp 5’ AAAAAAAAAAAAAAOH 3’
S1 TTTTTTTTTTTTTT AAAAAAAAAAAAAA
cDNA第二链的合成
置换合成法：获得的双链cDNA 5’端也会有几对碱基缺 失 5‘ppp’5 G G
RNaseH AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp DNApol dNTPs AAAATTTOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ 5’ 5’
5’
AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ T4-DNA ligase AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’
5’ 3’
cDNA第二链的合成
引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5’端序列
G 5‘ppp’5 G
AAAAAOH 3’ TTTTTp 5’ TdT dCTP AAAAACCCCCCCOH 3’ TTTTTp 5’ NaOH TTTTTp 5’
A A A A
白酶K、RNaseA的缓冲液中浸泡，可获得 >100 kb大小的DNA片段
基因文库的构建程序
③基因组DNA的切割
用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和 限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：
第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区
第二，保证DNA片段大小均一 超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头
方法一：粘末端连接
方法二：人工接头法
基因文库的构建程序
⑤ 转化或侵染宿主细胞
在基因组文库的构建过程中，最好选择转化效率高的
进口感受态细胞和质量稳定的进口包装蛋白！
基因组文库的构建程序
基因文库的构建程序
基因组文库构建的技术性问题
在基因组文库的构建过程中，最应引起重视的问题是：
严禁外源DNA片段之间的连接！！！
为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合：
将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离 用碱性磷酸单酯酶除去DNA片段的末端磷酸基团 在DNA片段的末端添加人工接头
基因文库的构建程序
构建基因组文库应注意的问题
1、构建一个文库，插入DNA和载体DNA的质量是成功与否的关键。基 因组DNA应当非常纯以适应DNA的酶解，而且基因组DNA也应足够 大（最好超过200kb）以获得两个末端的消化产物。 2、不论是载体DNA还是靶DNA不含外源片段是一个基本条件。污染少 量探针顺序或载体的基因组DNA将引起很大麻烦，这是因为在筛选过 程中它们将被鉴定为所要的克隆。 3、部分消化产品应当是一组覆盖整个基因组的随机片段。识别4个碱基 的限制酶要比识别6个碱基酶能产生更随机的插入片段。部分消化所 产生的片段应能连接到设定的载体上。限制酶和部分消化过程应事先 检查。一些批次的酶质量不够高而导致产生的DNA片段末端不能有效 地连接。如果预期结果没有出现，检查限制酶和DNA浓度及纯度。
四、双链 cDNA 连接到质粒或噬菌体载体并导入大肠杆菌中繁殖
同聚物加尾法、人工接头法
基因组文库和cDNA文库的比较
基因组文库
信息供体 载体 连接前 连接 筛选 DNA 噬菌体，黏粒，人工染色体 部分酶切，分级分离 粘端连接，人工接头 核酸探针
cDNA文库
mRNA 质粒，噬菌体 反转录合成cDNA双链 同聚物加尾，人工接头 核酸探针，免疫探针
双链cDNA的克隆
双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：
平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收 平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组 分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段 加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收
基因文库的构建程序
cDNA文库的构建流程
基因文库的构建程序
cDNA文库的构建流程 三、cDNA 第二链的合成 自身引导法 置换合成法 引导合成法
cDNA第二链的合成
自身引导法：获得的双链cDNA 5’端会有几对碱基缺 失
G 5‘ppp’5 G
AAAAAAAAAAAAAAOH 3’
TTTTTTTTTTTTTTp NaOH 煮沸 5’
TTTTTTTTTTTTTTp
基因文库的构建程序
cDNA文库的构建流程
利用PCR技术构建cDNA文库 ① 能够从极其有限的起始材料中构建cDNA文库。 ② 以总RNA为模板合成cDNA，无需mRNA的纯化，不 仅简化操作，而且避免了低丰度信息分子的丢失。 ③ 能够提高cDNA文库的完整性，获得那些低水平表达 的基因的cDNA克隆。此法对植物基因功能的研究，如对 某种外界因素作用后或不同发育阶段基因表达变化的研 究尤为适用。
部分酶切法一般选用4 碱基识别序列的限制性内切酶，如：
Sau3A或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控 连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级
分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！！！
基因文库的构建程序
④ 载体与DNA片段的连接
在基因组文库的构建过程中，大量体系连接前先使用 小体系连接来寻找最佳比例！
cDNA文库
mRNA 质粒，噬菌体 反转录合成cDNA双链 同聚物加尾，人工接头 核酸探针，免疫探针
基因文库的完备性
基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概 率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：
N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f )
其中： P = 任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率 f = 克隆片段的平均大小 / 生物基因组的大小 例如，人的单倍体DNA总长为2.9 x 109 bp，基因文库中克隆片段 的平均大小为15 kb，则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要 45万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180 万个克隆
基因文库的构建程序
cDNA文库的构建流程 一、 RNA 的分离 mRNA 的完整性 mRNA 的丰度 （丰度高用质粒，丰度 低用噬菌体） mRNA 的富集
基因文库的构建程序
cDNA文库的构建流程 二、cDNA 第一链的合成 反转录酶：AMV （来自禽成髓细胞瘤病毒）和 MMLV （来自 Moloey 鼠白血病病毒） 引物： Oligo（dT）和随机引物