研究生基因分子生物学课程

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示例 ：
5’…p A p C p T p G p C p AOH…３’ 3’… Tp G p 5’
}外切核酸酶活性
Mg2+ [-32P]dCTP T4噬菌体DNA聚合酶
5’…p A p *C 3OH’ 3’…Tp G p 5’
5’…p A p *C OH3’ 3’…Tp G p 5’
5’→3’DNA聚合酶 3’→5’外切核酸酶
将dNTP的单核苷酸残基加到RNA 或DNA引物的3’羟基端。这些末端
由双链DNA中的切口或裂缝以及与
单链DNA分子碱基配对的RNA或 DNA短片断组成。
切割3’羟基端的核苷酸残基，产生 3’凹端
5’→3’外切核酸酶 碱基配对的5’端寡核苷酸的切割
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主要用途－1〕补平限制酶切割DNA产生的3’凹端，可用
[32P]dNTP进行DNA片段末端标记。 2〕在cDNA克隆中，用于合成cDNA第二链。 3〕用于DNA测序以及聚合酶链式反应。
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示例：
５’…p Cp Cp GOH … 3’
3’… Gp Gp Cp Tp Ap Cp Gp Ap …5
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1大肠杆菌DNA聚合酶 I（全酶〕： 由单一多肽链组成（Mr约103 000），由大肠杆菌polA基因 编码，可通过三个明确的功能域执行三种酶反应。
结构域
活性
生化功能
羧基端结构域 （543～928位，约
46kDa)
中间结构域 （336～542位，约
22kDa) 氨基端结构域 （1～325位）
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3 T4噬菌体DNA聚合酶：
(来源于噬菌体感染的大肠杆菌）
特点是具有很强的3’→5’外切核酸酶的活性，比 Klenow片
段强200倍，对单链DNA的作用比对双链DNA更强。
主要用途－1〕对于带有3’突出端的DNA分子进行标记，首
选T4噬菌体DNA聚合酶。首先利用3’→5’外 切核酸酶活性切除DNA 3’突出尾，产生3’凹 端，然后在高浓度的某一种放射性标记的dNTP 存在下，外切降解反应与dNTP掺入3’端的反 应达到平衡。 2〕将双链DNA的末端转化成平端。
Mg2+ dNTP
大肠杆菌DNA 聚合酶 I Klenow 片段
5’…p C p C p G pA pTp Gp CpTOH…３’
3’…Gp Gp Cp Tp Ap Cp Gp Ap…5’
用 Klenow DNA聚合酶补平DNA片断的3’凹端
注：标记反应中含有三种为标记的dNTP及一种标记的dNTP，根据 DNA末端的序列进行选择。
二 分子克隆中常用的其它酶
使用好工具酶应注意：
1〕保持反应混合液中蛋白质的浓度不小于0.1mg/ml, 对维 持酶在反应混合液中的稳定性十分重要。牛血清白蛋白（ 组分V〕是一种很好的可加入酶反应液中的中性蛋白质，它 的使用终浓度应为0.1mg/ml。 2〕提供合适浓度的底物，酶反应才能有效地进行。应尽量
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外切核酸酶的校对工作方式就像电脑键盘上的“delete key”, 只纠正最近的一个错误。这种校对功能极大地增加了DNA 合成的准确性。 DNA聚合酶掺入错误碱基的几率≈1/105 外切核酸酶的校对功能降低了掺入错误碱基的几率≈1/107 事实上一个细胞中发生突变的几率≈1/1010
•反转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶〕 •末端脱氧核苷酸转移酶
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Substrates required for DNA synthesis
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Diagram of the mechanism of DNA synthesis
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Fra Baidu bibliotek
过程中，dNTP不断掺入到正在增长的DNA链上，同时利用全酶的
5’→３’外切核酸研酶究活生基性因使分切子生口物沿学5课’→程３’ 方向平移。
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2 大肠杆菌DNA聚合酶 I大片段（Klenow片段〕： 用枯草芽孢杆菌蛋白酶温和处理后，DNA聚合酶I可被切 割成两个片断：较大的片断（包含326～928位残基）称为 Klenow片断，执行DNA聚合酶和3’ →5’外切核酸酶活性。 全酶的5’ → 3’ 外切核酸酶活性存在于较小的氨基端片断 （1～325位残基）。
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5’
3’
3’
5’
Mg2+
DNase I
5’
3’ 5’
3’ 5’
3’
3’
5’ 3’
5’
dATP
dCTP
大肠杆菌DNA聚合酶I
dGTP
(全酶〕
dTTP
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
在镁离子存在下，用低限量的DNA酶 I处理双链DNA，产生的切口
可作为大肠杆菌DNA聚合酶 I（全酶〕催化DNA合成的引物。合成
使反应在接近Km（使酶活性达最大值的一半时的底物浓度〕
的条件下进行。 3〕应尽量采用最佳的反应条件，包括特定的pH值、温度及 离子浓度。
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（一〕DNA聚合酶 最常用的依赖于DNA的DNA聚合酶有： •大肠杆菌DNA聚合酶 I（全酶〕 •大肠杆菌DNA聚合酶 I大片段（Klenow片段〕 •T4和T7噬菌体DNA聚合酶（来源于T4和T7噬菌体感染的大肠 杆菌〕 •经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶（测序酶〕 •热稳定D NA 依赖性 DNA聚合酶
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Illustration of the path of the template DNA through the DNApolymerase
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研B究a生se基t因au分t子om生物er学s课程
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Proofreading exonucleases removes bases from the 3’ end of mismatched DNA
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具有3种活性： 5’→３’ DNA聚合酶活性 5’→３’ 及３’→５’ 外切核酸酶活性
主要用途－用切口平移方法标记DNA，在所有聚合酶中
只有大肠杆菌DNA聚合酶 I能用于此反应，因为它具有 5’→３’外切核酸酶活性，可以在聚合酶沿DNA链推进之 前，从DNA链上去除核苷酸。 还可用于cDNA第二链的置换合成及对带有3’突出尾的 DNA分子进行末端标记。