利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法在结核病中的应用

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基因芯片检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药性

ＴｈｓｆｇｎｈｐｉｅｅｔｇｍｙｏａｔｒｍｎｔｂｒｕｏｉｅｉａｃｏｒｆｍｐｎａｄｉｏｉｚｄＺＨＮＧＲｕ — ｉｅｕｅｏｅｅｃｉｎｄｔｃｉｃｂｃｅｉｕｅｃｌｓｒｓｓｎｅｔｉｎｓｔａｉｎｓｎａｉＡｉｍｅＩ
ｃｅｔｅｐｌｍｏｐｉｍｓａｄ１ｔｔｎｎ４ｇｎｓａｓｃａｅｔＰａｄＩＨｅｉａｃ．ｈｔｔｎｎｍｙｏａｔｒｍｌｏｉｏｙｒｈｓｎｍｕａｉｓｏｅｅｓｏｉｔｄｗｉＲＦｎＮｒｓｓｎｅＴｅｍｕａｉｓｉｅｂｅｅｉｄ１ｏｈｔｏｕ
【摘要】目的研究基因芯片在检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药性中的应用。方法根据与利福平和
异烟肼耐药相关的４条基因上的１１个位点和３０种单核苷酸多态性设计制作芯片，用芯片检测结核分枝杆菌的基因
突变，而判断其耐药性。结果用基因芯片在ｌＯ株异烟肼耐药株中检测出８（３３）在３从１５侏７．％，Ｏ株异烟肼敏感株中检测出２２株（３３）在９７．％，４株利福平耐药株中检测出７７株（１９，４８．％）在６株利福平敏感株中检测出４Ｏ株
ｗｔｏｆｔｅｓｑｅｃｎｏｍａｉｎＣｏｃｕｉｎＴｅｇｎ — ｈｐｔｃｎｌｇ－ａｔｄｔｃｉｎｗｔｉｈａｃｒｃ，ｐｃｆｉｉｓｍｅｏｅｕｎｅｉｆｒｔ．ｎｌｓｏｈｅｅｃｉｅｈｏｏｙａｆｓｅｅｔｉｈｇｃｕａｙｓｅｉｃｔｈｈｏｏｈｉｙａｄｓｎｉｖｔ。ｓｓｏｎｏｒｓｕｙｉｐｏｓｎｎｔｅｃｉｉａｅｅｔｎｏｃｂｃｅｕｔｂｒｕｏｉｒｓｓａｃｏＩｎｅｓｔｉａｈｗｎｉｕｔｄ。ｓｒｍｉｉｇｉｈｌｃｌｄｔｃｉｆｍｙｏａｔｒｍｕｅｃｓｓｅｉｔｎｅｔＮＨｉｙｎｏｉｌ

快速方法检测耐利福平结核分枝杆菌基因突变的研究

ＤＡ聚合酶（／１各ｕｅ５，ｆ２探Ｎ１Ｕ）ｌｌ模板２ｌ双蒸水补足到２ｌ，，５。扩增条件：４９
５０株结核分枝杆菌均来自２００５
ｏｍｉ，４℃ ３，０ｏ０Ｓ７Ｃ３，４Ｃ４ｎ９０ｓ６３，２ｏ０ｓ共０个Ｃ
利福平（Ｆ）临床主要抗结核药物之一，ＲＰ是结
核分枝杆菌对ＲＰ耐药是结核化疗失败的主要原Ｆ因之一。当结核菌株对ＲＰ产生耐药时较易出现Ｆ
备：菌株培养物经０９氯化钠注射液３次离心洗．％
溶于ＴＥ缓冲液（羟甲基氨基甲烷盐酸和乙二胺三
杆菌对ＲＰ耐药与其ＤＡ依赖性ＲＡ聚合酶ＢＦＮＮ亚单位编码基因（ｐＢ突变有关Ｊｒ）ｏ。传统的检测药物敏感性的方法需要２—３个月时间，不利于疾病
的及时诊治。随着分子生物学的发展，ＮＤＡ测序、
多；ＮＤＡ芯片技术虽然可以一次对大量位点进行
特异性探针（见表１。引物及探针由上海生工有限）
公司合成。③实时ＰＲ检测：引物与探针用双蒸Ｃ将水溶解，终浓度为１ｍｏＬ使０Ｉｌ。按照每个反应管ｘ／检测１个标本１突变位点来配制ＰＲ反应液，个Ｃ即每个反应管里都有１结核杆菌特异性探针和１条条
１材料和方法

结核分支杆菌两种耐药基因的快速检测

结核分支杆菌两种耐药基因的快速检测近年来，全球结核病呈现死灰复燃的趋势，其主要原因是耐药(DR-TB)和耐多药(MDR-TB)结核病的广泛分布和迅速传播。

作为一线抗结核药物，INH和RFP 结核病的预防、治疗方面起着重要作用。

但由于单药化疗和不规则化疗，其耐药情况越来越严重。

有研究表明结核分杆菌耐异烟肼的产生与过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变有关；而利福平耐药则与RNA聚合酶的p亚基的编码基因rpoB突变有关。

我们在用PCR-SSCP方法单独检测KatG 和rpoB基因突变时，发现在非变性聚丙烯酰胺凝胶中，这两种基因的迁移率不同，且差异很大。

因此，我们在一个反应中同时扩增KatG和rpoB基因。

再根据其SSCP图谱进行分析，这样就可以同时检测异烟肼和利福平耐药性。

我们采用PCR-SSCP银染法直接检测临床分离株和临床痰标本中结核分支杆菌rpoB基因和KatG基因突变，现将结果报告如下。

1 资料与方法1.1 标本来源107株临床分离株和39例肺结核病患者涂阳痰标本均来自吉林市结核病防治研究所。

107株临床分离株按结核病诊断细菌学规程进行菌种鉴定及药敏实验证实为结核分支杆菌，其中63例耐RFP，55例耐INH，49例耐SM。

65例肺结核病患者涂阳痰标本根据临床症状、涂片结果、胸部X线和培养结果确诊，其中33例耐RFP，27例耐INH，28例耐SM。

1.2 引物序列为1.3 方法1.3.1 dNA的提取用传统酚／氯仿抽提法提取标本中DNA。

1.3.2 PCR扩增采用25 μl反应体系，4xdNTPs终浓度为0.2 mmol／L，引物终浓度为0.2 μmol／L，扩增程序为94℃变性1 min，61℃退火1 min，72℃延伸1 min，循环30次，最后72℃延伸10 min。

扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳。

紫外检测rPOB出现258bp条带、KatG出现282bp条带即为扩增阳性。

利福平和异烟肼抗结核分支杆菌耐药基因的研究

利福平和异烟肼抗结核分支杆菌耐药基因的研究【摘要】耐药结核病是全世界结核病疫情第三次回升的重要原因，结核病耐多药菌株的出现增加了结核病治疗的难度，目前，用于结核病治疗的一线要主要是利福平和异烟肼。

异烟肼耐药机制非常复杂，与之耐药相关的基因较多，如：katg，inha，aphc，kasa，ndh等。

其中最主要的耐药基因为katg 、inha 基因。

利福平相关耐药基因研究较为明确，目前认为rpob基因的突变是mdr-mtb菌株的标志。

迄今为止，对利福平和异烟肼抗结核分支杆菌耐药性的检测方法有多种，实际工作中需要将多种检测方法同时运用，以使检测结果真实可信，及时为临床治疗提供有效的依据。

【关键词】耐药结核病；利福平，异烟肼；耐药基因；检测方法肺结核是世界上主要的公共卫生问题，是严重危害人类身体健康的传染性疾病之一。

二十世纪五、六十年代人们便期望找到一种有效的方法来控制肺结核的传染，最后达到治愈结核病的目的，但目前肺结核仍是一个全球性的流行病，成为全球性的公共卫生问题，每年大概有2-3百万的人死于这种疾病。

近年来，肺结核在艾滋病患者中的广泛传播再一次引起了公众的关注1，耐药结核杆菌尤其是耐多药结核杆菌的出现和传播是导致结核病发病率升高的重要原因。

本文就结核杆菌对利福平和异烟肼产生耐药性的相关基因，以及耐药性检测的方法做一综述2。

1 异烟肼异烟肼（isoniazid，inh），是抗结核病的常用一线药物，在结核病的治疗中一直起着重要的作用。

但大多数结核病患者如果长期用药易产生耐药性，这主要是由于长期使用inh可诱导细菌产生基因突变，从而使细菌对inh的耐药性增强。

有研究表明。

1.1 katg 基因是过氧化氢酶‐过氧化物酶的编码基因，katg基因全长2223个核苷酸，上游与相隔44个碱基的fura基因（一种结核杆菌铁调控蛋白编码基因，可能为katg基因的启动子，并调控其表达）相连，下游与相隔2794个碱基的embc基因相连。

基因芯片法快速检测复治肺结核耐药性

以传统药敏检测为标准，芯片法检测异烟肼耐药、利福平耐药和多耐药的灵敏度分别为
例样本提取细菌基因组ＤＮＡ后进行异烟肼、利福平耐药基因的基因芯片法检测，同时对各样本进行结核分枝杆菌分离
培养和传统药敏试验。结果
８９．２％、９Ｏ．３％和９１．０％，特异度均为１００．０％，假阳性率均为０．０％，假阴性率分别为１０．８％、９．７％和９．Ｏ％，符合率分别为９２．Ｏ％、９１．Ｏ％和９４．０％。结论基因芯片法能快速筛查复治肺结核的耐药和耐多药情况，与传统罗氏培养药敏试验相比，具有简便、快速、灵敏度高、特异性强的优点，值得在临床中推广应用。
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｉｔｖｅＴｏｒａｐｉｄｌｙｄｅｔｅｃｔｔｈｅｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｗｉｔｈｔｈｅｇｅｎｅｃｈｉｐｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ＳＯａｓｔｏ
ｐｒｏｖｉｄｅｓｃｉｅｎｔｉｉｃｆｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｍａｋｉｎｇｒａｔｉｏｎａｌｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙｓｃｈｅｍｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１００ｓａｍｐｌｅｓｗｈｉｃｈｗｅｒｅａｃｉｄ—ｆａｓｔｐｏｓｉｔｉｖｅ

结核分枝杆菌(MTB)耐药突变基因检测在结核检测中的应用

结核分枝杆菌 (MTB)耐药突变基因检测在结核检测中的应用摘要：目的：研究在结核分枝杆菌（MTB）耐药突变基因检测在结核患者中的检测效果。

方法：选取2019年4月～2020年4月在我院治疗的肺结核患者562例，分别进行Xpert MTB/RIF系统结合利福平耐药性检测、液体培养法、直接涂片三种检测方法，将临床诊断作为金标准。

结果：MTB/RIF系统结合利福平耐药性检测的准确度、灵敏度、特异度均高于液体培养法与直接涂片法，P＜0.05。

结论：在结核病的检测中，采用MTB/RIF系统结合利福平耐药性检测具有较高的诊断价值。

关键词：结核分枝杆菌；耐药突变基因；结核病结核病是常见的感染病，是由结核分枝杆菌（MTB）引起的强烈的慢性疾病，最常见的为肺结核，是导致人类死亡的主要原因之一。

据有关统计学报道，我国每年新发的结核患者可多达上百万里，仅次于印度及印度尼西亚。

我国对结核病的防治规划是在2030年之前，争取将结核病的发病率降低80％，为了实现这个目标，对结核病患者的早期诊疗及耐药性检测就非常重要了[1]。

当前结核病的诊断依然依赖传统的涂片及培养法，培养周期长，生物安全性高，检出率较低。

近些年开始推荐Xpert MTB/RIF系统结合利福平耐药性检测，具有快速便捷的作用[2]。

本文就Xpert MTB/RIF系统结合利福平对可疑肺结核患者进行检测，评价此检测方式在耐药突变基因中的检测价值进行研究，现汇报如下。

1.资料及方法1.1一般资料选取我院收治的562例疑似肺结核患者，均于2019年4月～2020年4月期间收治，男369例，女193例，年龄：18-75岁，平均年龄（42.45±9.81）岁。

临床诊断结果显示562例疑似结合患者中，MTB阳性424例、阴性138例。

1.2方法所有患者均采用美国BD公司生产的BACTECMGIT960系统、MGIT管及利福平药粉；采用美国Cepheid公司生产的Xpert MTB/RIF设备及试剂盒以及贝索公司生产的抗酸染液。

基因芯片技术快速检测结核分枝杆菌异烟肼、利福平耐药性

ｓｔｎｅｏ２ｃｉｉａｓｌｔｓｏＢｕｉｇｔｅｇｎｈｐｔｃｎｌｇｆｏａｅｔｅｒｓｌｓｏｏｖｎｉｎｒｐｒｏｔｏ．ｉａｃｆ６ｌｎｃｉｏａｅｆＭＴｓｅｅｃｉｅｈｏｏｙｗｅｅｃｍｐｒｄｗｉｔｅｕｔｆｃｎｅｔｏａｐｏｔｎｍｅｈｄｓｌｎｈｈｈｌｏｉ
ｆｔｅｔｇｔＩｎａｉＩＨ）ａｄＲｆｉｎ（Ｆａｓｎｏｉｚｓｔｉｏｓｄ（ＮｎｉｍｐｃＲＰ）ｉｃｂｃｅｕｂｒｕｏｉＭＴ．ＭｅｈｄＴｅｄｔｆＮｄＲＰｒ— ａｉｎＭｙｏａｔｉｍｔｅｃｓｒｕｌｓ（Ｂ）ｔｏｓｈａｏＨａＦａＩｎｅ
ＲｅｕｔＴｈｅｕｔｆｅｓｔｉ，ｓｃｆｃｔ，ｐｓｔｖｒｄｃｉｅｖｕ，ｎｇｔｅｐｅｉｔｖａｕ，ａｄａｃｒｃｂｍｎｄｕｉｇｔｅｇｎｓｌｓｅｒｓｌｏｎｉｖｔｐｅｉｉｓｓｉｙｉｙｏｉｅｐｅｉｔａｅｅａｉｒｄｃｉｅｖｅｎｃｕａｙｏｔｅｓｎｅｅｉｖｌｖｌｈ
ｒｍｂｒｕｏｉＸＥＳｉ，ｉｔｅｃｌｓＩｈｄｕｕｓａ
Ｊａｇｕ２１０ｉｎｓ２０４
Ｃｅｇｏｇ，ＨＮｅｇｈ，ＥｕｅＸｚｏｆｃｏｓＤｓｓｏｉｌｈｎｙｎＺＡＧＦｎｃｉＰＮＧＳｚｎｕｈｕＩｅｔｕｉａｅＨｓｔ，ｈｎｉｅｐａ
ｃｉｃｎｌｙｎｃｍｐｒｏｔｈｏｖｎｏａｐｏｒｏｅｏ，ｗｒａＨｗ：ｆｒＩｎａｉｈｅｅｅ７％（２１，ｈｐｔｈｏｏ．ｉｏａｓｎｗｉｔｅｃｎｅｔｎｒｐｔｎｍｔｄｅｅｓｆｏｓｏｓｉｄ，ｔｙｗｒ５ｅｇｉｈｉｌｏｉｈｏｏｚ１／６）７．％（６４）４５（２２）０（６４，７．％（８６）ｅｐｃｖｌ；ｒＲｆｉｎｔｅｅｅ８．％（５１，８３３／６，５．％１／２，９％３／０）７４４／２，ｒｓｅｉｅｆｉｍｐｃｈｙｗｒ３３ｔｙｏａｉ１／８）８．％（８４）７．％（５２）９．％（８４）５５（３６，ｓｅｔｅ．ＣｎｌｓｎＴｅｅｔｔｅＭｙｏａｔｉｍｔ— ６４３／，１４１／１，２７３／１，８．％５／２）ｒｐｃｉｌｅｖｙｏｃｕｉｏｄｔｃｈｃｂｃｒｕｏｅｕ

噬菌体生物扩增法快速测定结核分枝杆菌对异烟肼和利福平的药物敏感性应用价值

ｔｔｌ１７ｔｉｓｗｅｅｕｔｒｄｏｏｗｎｔｉ—ｅｅｃｈｒｍｅｉｍｎｄｎｉｅＭｙｏａｔｒｕｅｃｌｓｏａ６ｓａｎｒｃｕｅｎＬ — ｅｅｎＪｎｎｕｕｅｄｕａｄｉｅｔｄａｒｌｓｓｆｓｃｂｃｅｕｔｂｒｕｏｉｉｍｓ
Ｓｘｙｎｎｓｒｉｓｏｅｂｃｅｉｍｔｂｒｕｏｉｓｒｉｓｉｔ— ｉｅｔａｎｆＭｙｏａｔｒｕｕｅｃｓｓｔａｎｗｅｅｂａｎｄｆｏｈｅｐｕｌｒｏｔｉｅｒｍｔｓｕｔｍｏｅｒｍａｙｕｍｏａｙｆｔｐｈｉｒｐｌｎｒ
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ｔｂｒｕｏｉｃｓｓｕｅｃｌｓａｅ．Ｎｉｅｙｅｇｔｔｉｓｗｅｅｏｔｉｅｏｔｅｓｕｕｏｅｒｐａｅｕｍｏａｙｔｂｒｕｏｉｅｅ．田ｓｎｔ－ｉｈｒｎｒｂａｎｄｆｍｈｐｔｍｆｈｅｅｔｄｐｓａｒｔｌｎｒｅｃｓａｓｕｌｓｓ
ｂｏｏｉａｌｓａＰａｉｌｇｃｙａｓｙ（ｈＢ）ｉｅｄｔｃｉｎｏｏｉｚｄａｄｒａｉｅｉａｃｎＭｙｏａｔｒｍｕｅｃｌｓ．Ｍｅｈｄｌｎｔｅｅｔｆｉｎａｉｆｍｐｎｒｓｓｎｅｉｅｂｅｅｕｔｂｒｕｏｉｈｏｓｎｉｔｉｓｔｏｓ

一种同时检测结核分枝杆菌利福平与异烟肼耐药基因点突变的方法及

专利名称：一种同时检测结核分枝杆菌利福平与异烟肼耐药基因点突变的方法及其试剂盒
专利类型：发明专利
发明人：刘利成,王华贵,邹弈君,陈璐
申请号：CN201811064273.7
申请日：20180912
公开号：CN109112226A
公开日：
20190101
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供一种同时检测结核分枝杆菌利福平与异烟肼耐药基因点突变的方法及其试剂，所述方法基于ARMS荧光定量PCR方法，在相同的反应体系中，分别使用针对所述耐药基因突变位点的突变型模板的ARMS引物和针对野生型模板的ARMS引物及它们共用的上游或下游引物，用突变型反应管与野生型反应管共两个反应管对同一份待测样本进行检测，通过各个点突变在两个反应管中的荧光PCR的Ct值和ΔCt值的大小判定样本的基因型。

本发明的方法操作简便，可在短时间内通过多重检测，检出结核一线药物的主要耐药位点。

申请人：江苏宏微特斯医药科技有限公司,北京宏微特斯生物科技有限公司
地址：226400 江苏省南通市如东县掘港街道珠江路888号(如东高新区生命健康产业园)
国籍：CN
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结核分枝杆菌利福平、异烟肼耐药检测对比研究

结核分枝杆菌利福平、异烟肼耐药检测对比研究赵艳馨;穆成;白大鹏;尹林峰;曹志亮;李清泉;王春花;李丽【摘要】目的:应用比例法和GenoType MTBDRplus方法,对结核分枝杆菌利福平、异烟肼耐药性进行对比研究,分析GenoType MTBDRplus方法在结核病防治所开展的有效性.方法:同一份改良罗氏培养阳性标本进行比例法药敏试验和GenoType MTBDRplus方法检测利福平、异烟肼耐药性.结果:50份结核病患者的痰液标本,改良罗氏培养结果为阳性,进行比例法药敏试验和GenoType MTBDRplus方法检测,将比例法药敏试验结果作为评定标准,用GenoType MTBDRpuls方法的检测结果与之对比分析,利福平耐药性的敏感度为100％,特异度为97.9％,异烟肼耐药性的敏感度为83.3％,特异度为97.7％.结论:采用GenoType MTBDRpuls方法检测利福平和异烟肼的耐药性,可为临床诊断治疗耐药结核病提供快速有效的科学依据,对结核病防治所结核分枝杆菌的耐药检测和临床耐药患者的合理治疗方案确定有重要意义.【期刊名称】《药品评价》【年(卷),期】2018(015)014【总页数】3页(P24-26)【关键词】结核分枝杆菌;基因检测;利福平;异烟肼;耐药结核病【作者】赵艳馨;穆成;白大鹏;尹林峰;曹志亮;李清泉;王春花;李丽【作者单位】天津市滨海新区塘沽结核病防治所,天津 300450;天津市疾病预防控制中心,天津 300070;天津市海河医院,天津 300070;天津市滨海新区塘沽结核病防治所,天津 300450;天津市滨海新区塘沽结核病防治所,天津 300450;天津市滨海新区塘沽结核病防治所,天津 300450;天津市疾病预防控制中心,天津 300070;天津市海河医院,天津 300070【正文语种】中文【中图分类】R974根据《全球结核病控制2010年报》的估算[1]，我国结核病年发病患者例数居世界第二位，仅次于印度，而耐药结核病患者居世界首位。

结核分枝杆菌中利福平和异烟肼耐药相关基因突变与耐药水平的相关性研究

• 248 •中国防痨杂志2021 年3 月第43 卷第3 期Chin J Am itnberc，March 2021，V〇1. 43，No. 3 .论著•结核分枝杆菌中利福平和异烟肼耐药相关基因突变与耐药水平的相关性研究王希江谭云洪贺文从欧喜超刘东鑫赵雁林【摘要】目的探究结核分枝杆菌中利福平和异烟肼耐药基因突变谱的分布，为研发更为精准的耐药分子诊断技术和临床决策提供依据。

方法收集国家耐药监测点新疆维吾尔自治区柯坪县、岳普湖县和疏勒县193株和湖南省怀化市、永顺县、祁东县、桃江县和耒阳市592株结核分枝杆菌。

采用微孔板法测定菌株的最小抑菌浓度(m in im u m in h ib ito ry c o n c e n tr a tio n，M IC)。

根据药物敏感性试验（简称“药敏试验”)结果选取利福平和异烟肼耐药菌株，经C T A B/N a C l法提取核酸后进行全基因组测序（w h o le g e n o m e s e q u e n c in g,W G S〉，将所得基因组原始序列过滤后上传至T B p r o f il e r分析工具以确定耐药基因型。

结果785株结核分枝杆菌中，124株（15.80%)为利福平和(或)异烟肼耐药，包括利福平耐药74株，异烟肼耐药111株，耐多药61株(7. 77%)。

97. 22%(70/72)利福平耐药菌株检测出中出基因位点突变，其中98.57%(69/70)的突变位于利福平耐药决定区（R R I)R)，1株检测出R R D R区以外的与利福平耐药相关的罕见突变I49I F。

利福平耐药突变主要位于450、;'/^/} 445及rpoB 435 密码子，占8L43%(57/70),其中i'/wB S450L突变出现的频率最高（45. 71%，32/70),中必450位点突变对应高浓度利福平耐药452位点突变主要对应低浓度利福平耐药（M I C=2吨/m l)。

荧光PCR熔解曲线法在检测临床标本结核分枝杆菌及其耐药性中的应用

354Chin J Lab Diagn,March.2021 ,Vol 25«No.3文章编号：1007 — 4287(2021)03 — 0354 —03荧光PCR熔解曲线法在检测临床标本结核分枝杆菌及其耐药性中的应用张汇征\李桓2,张珍'李俊刚、王静1，廖传玉1，周刚、陈耀凯1,严晓峰罗明^ (重庆市公共卫生医疗救治中心1.中心实验室；2.感染科；3.药剂科；4.结核科，重庆400036)摘要：目的评价荧光Pt’R熔解曲线法检测临床标本结核分枝杆菌及其对利福平和异烟肼敏感性的性能。

方法收集重庆市公共卫生医疗救治中心2016年7月至2018年7月进行过荧光P C R熔解曲线法结核检测的病例，分别与结核菌培养和Gen e x p e r t比较检测结核菌的灵敏度，与比例法药敏比较药敏结果。

结果在结核菌检测上，荧光P C R熔解曲线法阳性率与结核菌培养相近，低于Genexpert:与比例法药敏相比，检测利福平药敏的灵敏度为93.2%,特异度为80. 2%,符合率为84. 3%;检测异烟肼药敏的灵敏度为92. 6%,特异度为86. 3%,符合率为88. 6%。

结论荧光P C R熔解曲线法可以高灵敏地直接对临床样本快速检测结核菌及其耐药性。

关键词：焚光P C K熔解曲线法；结核分枝杆菌；耐药性；临床样丰中图分类号：R378.91 文献标识码：AApplication of fluorescence PCR melting curve assay to detect mycobacterium tuberculosis and its drug-resistance in clinical specimens Z H A N G H u i-z h e n g^L l H uan Z H A N G Zhen n et a l. (.Central Lab ^ Chongqing Public H ealth M edical Center •Chongqing A00036 ,Chi?iu)Abstract ：Objective To evaluate the ability of fluorescence PC'R melting curve assay in detection of mycobacterium tuberculosis in clinical samples. Methods The cases tested fluorescence quantitative PCR melting curve assay in C'hongqing public health medical center during Jul. 2016 to Jul. 2018 were collected. The sensitivities of fluorescence PCR melting curve assay were compared with MTB culture and Genexpert respectively. The results of rifampin and iso- niazid drug susceptibility of fluorescence PCR melting curve assay were compared with that of standard proportion method. Results The positive detection rate of MTB of fluorescence cjuantitative PCR melting curve assay was close to MTB culture，but lower than that of Genexpert; Compared with the proportion method, the sensitivity, specificity and concordance rates of rifampicin were 93. 2% ,80. 2%and 84. 3% respectively ； The sensitivity * specificity and concordance rates of isoniazid were 92. 6% ,86. 3%and 88. 6% respectively. Conclusion Fluorescence cjuantitative PCR melting curve assay can be u.sed to detect MTB and its drug-resistance directly in clinical samples with high sensitivity.Key words：fluorescence quantitative PCR melting curve assay；mycobacterium tuberculosis；drug-resistance；clinical specimen(Chiti J Lab,2021,25 ：0354)结核病（TB)是由结核分枝杆菌（MTB)引起的慢性传染病。

应用基因芯片方法检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼的耐药性

应用基因芯片方法检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼的耐药性张俊仙;吴雪琼;阳幼荣;梁艳【期刊名称】《中国防痨杂志》【年(卷),期】2011(033)010【摘要】目的应用基因芯片方法检测结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)对利福平和异烟肼的耐受性,评价其临床应用价值.方法应用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增一基因芯片杂交的方法检测经常规药敏实验证实的30株Mtb利福平和异烟肼敏感株和5.株耐利福平和异烟肼分离株的堆rB基因及katG和inhA基因突变,同时以PCR-直接测序法为对照.结果应用PCR-基因芯片与基因测序方法检测30株Mtb利福平敏感株咖B基因和异烟肼敏感株katG基因和inhA基因均为野生型.50株Mtb利福平耐药株中,PCR-基因芯片与基因测序分析3株rpoB基因均为野生型,41株均为突变型;6株PCR-基因芯片与基因测序结果不一致.50株Mtb异烟肼耐药株中,PCR-基因芯片与基因测序分析16株katG基因和30株inhA基因均为野生型,31株katG基因均为315位密码子突变,7株inhA基因均为-15位突变型,其中2株为katG和inhA双重突变,3株katG和13株inhA PCR-基因芯片与基因测序结果不一致.结论应用PCR-基因芯片方法可快速、有效地检出大多数Mtb耐多药分离株,指导临床用药.【总页数】6页(P680-685)【作者】张俊仙;吴雪琼;阳幼荣;梁艳【作者单位】100091,北京,解放军第三O九医院全军结核病研究所军队结核病防治重点实验室;100091,北京,解放军第三O九医院全军结核病研究所军队结核病防治重点实验室;100091,北京,解放军第三O九医院全军结核病研究所军队结核病防治重点实验室;100091,北京,解放军第三O九医院全军结核病研究所军队结核病防治重点实验室【正文语种】中文【相关文献】1.长春地区基因芯片法和比例法检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药性的比较研究 [J], 赵淑杰;2.基因芯片和比例法药物敏感性试验检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药性的比较研究 [J], 欧维正;骆科文;王燕;秦万;蒙俊;张廷梅3.基因芯片技术检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药性临床应用评价 [J], 许榕青;李丹;林银霞;黄明翔;陈新朝4.基因芯片检测临床标本结核分枝杆菌异烟肼和利福平耐药性的研究 [J], 熊敏;骆科文;周忠;欧维正5.基因芯片技术对结核分枝杆菌利福平及异烟肼的耐药性检测研究 [J], 孙桂英; 赵刚; 沈燕; 徐密琴; 高胜利; 俞净; 钮志林因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

对利福平与异烟肼多个基因耐药初治结核病1例报告

对利福平与异烟肼多个基因耐药初治结核病1例报告秦万;欧维正;蒙俊;罗志颖;骆科文;王燕【期刊名称】《贵州医药》【年(卷),期】2015(039)012【总页数】2页(P1138-1139)【关键词】初治结核患者;利福平;异烟肼;耐药基因【作者】秦万;欧维正;蒙俊;罗志颖;骆科文;王燕【作者单位】贵阳市公共卫生救治中心检验科,贵州贵阳550006;贵阳市公共卫生救治中心检验科,贵州贵阳550006;贵阳市公共卫生救治中心检验科,贵州贵阳550006;贵阳市公共卫生救治中心检验科,贵州贵阳550006;贵阳市公共卫生救治中心检验科,贵州贵阳550006;贵阳市公共卫生救治中心检验科,贵州贵阳550006【正文语种】中文【中图分类】R52结核耐药机制十分复杂，包括结核菌细胞壁结构与组成变化、结核菌自身的药物外排泵系统、结构药物靶编码基因发生突变［1］。

随着分子生物学检测技术的快速发展，对药物基因检测试验不断进步，药敏检测的时间大大缩短，而且还可精确到某个基因。

我院首次发现1例初治结核患者对利福平（RFP）与异烟肼（INH）的3个耐药相关基因rpoB基因、katG基因及inhA基因都有耐药性。

现报告如下。

1 资料与方法1.1 临床资料患者，男，42岁，无业。

既往史，10年前因“胆结石”行“胆囊切除术”（具体不详），个人史，生长于原籍，否认疫区久居史，吸烟20＋年，每天20支，饮酒20＋年，2～3次／周，每次500g左右。

于2014年11月10日门诊入院，2014年11月13日出院，住院号，1408258；入院前治疗情况，2014年4月予抗痨治疗至今。

但治疗情况较差，患者仍有咳嗽、呕血、体质量减轻等临床症状。

入院后检查项目及结果：胸部CT示双肺弥漫条射、斑点影、右上叶多发不规则空洞影、大部分病灶边缘清晰、右上叶部分支气管狭窄闭塞、肺门纵膈未见肿大淋巴结、右侧局部胸膜反应增厚、双侧未见胸腔积液。

痰抗酸染色示阳性；痰分支杆菌核酸检测示阳性；基因芯片法药敏试验示RFP与INH均耐药；比例法药敏提示利福平、异烟肼、乙胺丁醇和链霉素均耐药，氧氟沙星与卡拉霉素敏感。

国产试剂检测结核分枝杆菌对异烟肼、利福平耐药基因临床价值的探讨

国产试剂检测结核分枝杆菌对异烟肼、利福平耐药基因临床价值的探讨张启全;侯远沛;刘成永【摘要】目的比较进口试剂和国产试剂在检测结核分枝杆菌对利福平、异烟肼耐药基因差异 ,探讨国产试剂的临床使用价值方法 152株经罗氏培养阳性的菌株,分别用德国Hain life science GmbH生产的Geno Type?MTBDRplus、亚能生物技术(深圳)有限公司生产的基因探针试剂检测利福平、异烟肼耐药基因,并与传统的药敏结果作比较.结果 152例菌株中有148株纳入比较,其中进口试剂、国产试剂和罗氏培养法对利福平、异烟肼耐药的检出率分别为47.30%(70/148),43.24%(64/148);50%(74/148),41.89(62/148);48.65%(72/148 ),47.30%(70/148),国产试剂与进口试剂、罗氏培养法相比,对利福平、异烟肼耐药检出率均无统计学差异(P>0.05).以罗氏培养的药敏结果为金标准,国产试剂和进口试剂对利福平、异烟肼耐药的检出敏感性和特异性均无统计学差异(P>0.05).结论国产试剂检测异烟肼和利福平耐药的敏感性与特异性与进口试剂相接近,且操作简便,价格便宜,适合基层医院对结核分枝杆菌耐药性的快速检测.%Objective To compare the differences of domestic and imported reagents on detecting drug resistance gene of Mycobacterium tuberculosis against isoniazid and rifampin.Methods Drug resistance was detected by reagent with Germany Hain life science GmbH production MTBDRplus and Yaneng Biological Technology Co.(Shenzhen) analysis in 152 strains with L-J culture-positive, and the results of L-J culture were compared.Results 148 strains were compared in 152 cases.The rates of drug resistance against rifampin and isoniazid were 47.30% (70/148) Vs 43.24% (64/148), 50% (74/148) Vs 41.89%(62/148) and 48.65% (72/148) Vs 47.30% (70/148) by imported reagents, domestic reagents and L-J culture respectively.The rates of drug resistance against rifampin and isoniazid showed no significant difference among imported reagents, domestic reagents and L-J culture (P>0.05).The sensitivity and specificity had no significant difference in detecting drug resistance against isoniazid and rifampin between imported and domestic reagents as the gold standard of l-J susceptibility (P>0.05).Conclusion The sensitivity and specificity about domestic reagent for detecting isoniazid and rifampicin are closer to imported reagents.Domestic reagents fit for basic hospital on detecting drug resistance of Mycobacterium tuberculosis rapidly, because it is simple and cheap.【期刊名称】《临床肺科杂志》【年(卷),期】2017(022)006【总页数】4页(P980-983)【关键词】分枝杆菌;结核;异烟肼;利福平;耐药【作者】张启全;侯远沛;刘成永【作者单位】221004 江苏徐州 ,徐州市传染病医院检验科;221004 江苏徐州 ,徐州市传染病医院检验科;221004 江苏徐州 ,徐州市传染病医院检验科【正文语种】中文根据近年来国家以及地方对结核分枝杆菌的耐药调查，均提示结核分枝杆菌的耐药情况并未得到有效的控制[1-3]，与2000年第四次全国结核病流行病学抽样调查相比, 结核分枝杆菌初、复治耐药率都有所增加[4]，尤其是西部欠发达地区，增加更为明显[5]。

基因芯片技术检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药性临床应用评价

基因芯片技术检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药性临床应用评价许榕青;李丹;林银霞;黄明翔;陈新朝【摘要】We evaluated clinical application effect of gene chip for detection of rifampin (RFP) and isoniazid (INH) resistance in Mycobacterium tuberculosis (MTB).Rifampin and isoniazid drug-resistance gene loci were detected by gene chip with sputum specimens from smear-positive tuberculosis patients and clinical strains,comparing the results of detection.BACTEC MGIT 960 drug susceptibility test results were used as control to evaluate the detection performance of gene chip.The sequences of the polymerase chain reaction products of the rpoB,katG and inhA genes from 999 strains identified as Mycobacterium tuberculosis were determined to confirm the mutations by DNA sequencing.Results showed that 100 cases were identified as nontuberculous mycobacteria by gene chip in the 1 108 cases of smear-positive samples.Among the rest 1 008 samples,there were only 9 cases of microarray results different from BACTEC MGIT960 culture-positive strains,achieving the coincidences of 99.1％.Compared with BACTEC MGIT 960 drug susceptibility testresults,the gene chip method displayed a concordance of 98.1 ％ and 94.5 ％for RFP and INH respectively in the 999 pared with the DNA sequencing method,the accuracy of gene chip method was 99.6％ for rifampin resistance and 99.8％ for isoniazid resistance.It's concluded that the gene chip technology can quickly and accurately detect rifampin andisoniazid resistance in MTB and can be used directly for the detection of sputum samples.%目的评价基因芯片技术检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药性的临床应用效果.方法利用基因芯片技术对涂阳肺结核患者的痰标本和临床分离株进行利福平和异烟肼耐药基因位点检测,比较痰标本与菌株检测结果的差异;并以BACTEC MGIT 960药敏试验结果为对照评价基因芯片的检测性能.另外,通过对999株鉴定为结核分枝杆菌的临床分离菌株进行rpoB、katG和inhA基因耐药相关区域扩增产物测序,以验证基因芯片对核酸序列检测的准确性.结果在涂阳的1 108例标本中有100例经基因芯片菌种鉴定为非结核分枝杆菌.其余的1 008例痰标本基因芯片结果与BACTEC MGIT960培养阳性的菌株基因芯片结果比较仅有9例结果不一致,符合率为99.1％.以BACTEC MGIT960培养法药敏结果为对照,999株菌株基因芯片法检测利福平耐药性的符合率为98.1％,异烟肼的耐药性的符合率为94.5％.与DNA测序法相比,基因芯片法检测利福平和异烟肼耐药性的准确率分别为99.6％和99.8％.结论基因芯片技术能够快速、准确地进行结核分枝杆菌利福平和异烟肼的耐药性检测,并能直接用于痰标本检测.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2017(033)001【总页数】6页(P43-48)【关键词】结核分枝杆菌;利福平;异烟肼;耐药性;基因芯片【作者】许榕青;李丹;林银霞;黄明翔;陈新朝【作者单位】福建省福州肺科医院检验科,福建医科大学临床教学医院,福州350008;福建省福州肺科医院检验科,福建医科大学临床教学医院,福州 350008;福建省福州肺科医院检验科,福建医科大学临床教学医院,福州 350008;福建省福州肺科医院检验科,福建医科大学临床教学医院,福州 350008;福建省福州肺科医院检验科,福建医科大学临床教学医院,福州 350008【正文语种】中文【中图分类】R378.91Supported by the Young Research Program of Department of Public Health of Fujian Province (No. 2013-2-77) Corresponding author: Huang Ming-xiang,Email:**************结核病是全世界范围内严重威胁公共健康的传染病。

MPT64在MTB利福平和异烟肼耐药性检测方法中的应用

MPT64在MTB利福平和异烟肼耐药性检测方法中的应用作者：杨瑜李华邓丽雷杰王楠谢贝吴玲刘志辉孟繁荣来源：《新医学》2021年第03期【摘要】目的建立一种以MPT64为指标的结核分枝杆菌（MTB）耐药性检测的快速方法，探讨MPT64在MTB利福平（RFP）和异烟肼（INH）耐药性检测中的应用。

方法應用胶体金免疫层析法（GICA）分别检测MTB敏感株和耐多药株在含（观察组）与不含（对照组）RFP、INH的Middlebrook 7H9液体培养基上培养3、7、10 d的培养液中的MPT64，通过凝胶成像仪白光源拍照进行条带灰度分析（Image Jab Software 3.0），比较敏感株和耐多药株间的灰度比值的差异，依据受试者工作特征（ROC）曲线下面积（AUC）分析确定RFP、INH耐药的灰度比值界值;以比例法检测结果为金标准，评价新建方法的准确度、灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值。

结果对照组中，随着培养时间的延长，12株MTB敏感株和11株耐多药株的灰度比值增大;观察组中，敏感株在不同的培养时间的灰度比值没有显著变化，而耐多药株则明显增大。

3、7、10 d敏感菌与耐多药菌在药物培养基中MPT64检测灰度比值差异均有统计学意义（P均< 0.05）。

依据观察组灰度比值分别绘制以MPT64指示的RFP和INH 耐药性检测的ROC曲线，两者的3 dAUC分别为0.84和0.77，灰度比值界值均为0.05;7、10 d AUC均为1.00，7 d的灰度比值界值分别为0.23与0.20;10 d的灰度比值界值分别为0.49和0.48。

GICA检测MPT64用于34株MTB的RFP、INH耐药性鉴定的准确度分别为97%和94%，灵敏度分别为93%和86%，特异度均为100%，阳性预测值均为100%，阴性预测值分别为95%和91%。

结论 GICA检测MPT64于MTB培养7 d时能准确检测抗结核药物RFP、INH耐药性，MPT64可作为MTB药敏试验的有效检测指标。

快速检测结核分枝杆菌异烟肼和利福平耐药相关基因mPCR-SSCP建立及应用

快速检测结核分枝杆菌异烟肼和利福平耐药相关基因mPCR-SSCP建立及应用褚美芬;严杰;钟雅文;吴亦斐;王欢;孙爱华【期刊名称】《中华微生物学和免疫学杂志》【年(卷),期】2012(032)007【摘要】Objective To establish multi-PCR-single strand conformational polymorphism analysis (mPCR-SSCP) for rapid detection of isoniazid (INH) and rifampin (RIF) resistance associated katG,inhA and rpoB genes of Mycobacterium tuberculosis isolates.Methods The INH-and RFP-resistance of 134 isolates was determined by using drug susceptibility test.The primers were designed for detecting INH and RFP resistance-associated katG,inhA and rpoB gene in the isolates by mPCR-SSCP.PCR-DS technique was applied to detect the mutations in katG,inhA and rpoB genes.All the results from different assays were subsequently analyzed as well as compared.Results All of the 134 tested isolates had katG,inhA and rpoB genes.Of the 134 isolates,42 (31.3％) and 45 (33.6％) strains were INH-and RFP-resistant,respectively.The results of mPCR-SSCP and PCR-DS showed that all the 92 INH-susceptible isolates had no mutation in katG and inhA genes with 100％ specificity.In the 89 RFP-susceptible isolates,2 and 1 had mutation in rpoB genes confirmed by mPCR-SSCP and PCR-DS with 97.8％or 98.9％ specificity,respectively.Among the 42 INH-resistance isolates,33 and 36 strains had the mutations in katG and/or inhA genes due to theresults of mPCR-SSCP and PCR-DS with 78.6％ or 85.7％sensitivity,respectively.The results of mPCR-SSCP and PCR-DS also demonstrated that in the 45 RFP-resistance isolates,41 and 43 strains had the mutations in rpoB gene with 91.1％ or 95.6％sensitivity,respectively.Conclusion The mPCR-SSCP established in this study can be used to rapidly detect INH and RFP-resistance associated mutations in katG,inhA and rpoB genes of M.tuberculosis with convenience,specificity and sensitivity,which shows a good prospect for application in clinic.%目的建立快速检测结核分枝杆菌异烟肼(INH)和利福平(RFP)耐药相关基因katG、inhA和rpoB突变的多重聚合酶链反应-单链构象多态性(multi PCR-single strand conformational polymorphism analysis,mPCR-SSCP)方法.方法药敏试验检测134株结核分枝杆菌临床菌株对INH和RFP的耐药性.设计结核分枝杆菌INH和RFP耐药相关katG、inhA和rpoB基因PCR引物,建立mPCR-SSCP技术检测上述菌株katG、inhA和rpoB基因的突变,同时采用PCR直接测序技术(PCR-DS)检测上述基因片段突变情况,并对上述3种方法检测结果进行分析和比较.结果 134株临床菌株均含有katG、inhA和rpoB基因,其中42株(31.3％)对INH耐药、45株(33.6％)对RFP耐药.mPCR-SSCP和PCR-DS检测结果显示,92株INH敏感菌株katG和inhA基因均未发生突变,检测特异性均为100％；89株RFP敏感菌株中rpoB基因分别有2株和1株检测出突变,检测特异性分别为97.8％和98.9％；42株INH耐药菌株中分别有33株和36株katG和/或inhA基因突变,检测灵敏度分别为78.6％和85.7％；45株RFP耐药菌株中rpoB基因分别有41株和43株发生突变,检测灵敏度分别为91.1％和95.6％.结论本研究建立的mPCR-SSCP能快速、简便、特异,并有一定的敏感性检测结核分枝杆菌异烟肼和利福平耐药相关基因katG、inhA和rpoB突变,具有临床应用前景.【总页数】6页(P655-660)【作者】褚美芬;严杰;钟雅文;吴亦斐;王欢;孙爱华【作者单位】310053 杭州,浙江医学高等专科学校;310058 杭州,浙江大学医学院病原生物学系;310053 杭州,浙江医学高等专科学校;310058 杭州,浙江大学医学院病原生物学系;310058 杭州,浙江大学医学院病原生物学系;310053 杭州,浙江医学高等专科学校【正文语种】中文【相关文献】1.MTBDR plus方法快速检测北京地区临床结核分枝杆菌分离株利福平和异烟肼耐药性效果评价2.基因芯片技术快速检测结核分枝杆菌异烟肼、利福平耐药性3.探针熔解曲线法快速检测结核分枝杆菌利福平、异烟肼、乙胺丁醇及链霉素耐药突变4.结核分枝杆菌中利福平和异烟肼耐药相关基因突变与耐药水平的相关性研究5.结核分枝杆菌及利福平耐药快速检测技术在利福平耐药结核诊断中的应用价值因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

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利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法在结核病中的应用
作者：辛宝林于秀坤
来源：《中国实用医药》2016年第09期
【摘要】目的探讨利福平和异烟肼耐药基因突变采用PCR线性杂交酶显色法建立快速检测方法的应用价值。

方法 88份送检的结核病患者临床标本，得结核分枝杆菌分离株64株，采用PCR线性杂交酶显色法建立利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法进行检测，同时采用比例法检测，并以比例法为标准评价快速检测方法的诊断价值。

结果快速检测方法中对利福平耐药24份，仅对异烟肼耐药24份，对利福平和异烟肼均耐药22份，不耐药18份。

以耐药不耐药作为分割点，比例法药敏试验结果为参考标准，快速检测方法的灵敏度
100.0%，特异度90.0%，准确度97.7%；两种检验方法一致性好（P>0.05）。

结论 PCR线性杂交酶显色法建立快速检测方法可在12 h内对利福平和异烟肼耐药基因突变的作出判断，与比例法药敏试验一致性好，可信度高，值得临床推广。

【关键词】利福平；异烟肼；耐药；基因突变；结核分枝杆菌；快速检测
DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2016.09.115
利福平和异烟肼是结核病的最重要的一线抗结核药物[1]。

近年来结核分枝杆菌基因突变发生耐药的情况也时有发生，世界卫生组织报道每年有新增48.9万例耐多药结核病，其总量占结核病患者的4.8%，而在我国则更为严重。

耐多药结核病的早期确诊有利于患者的病情控制，比例法药敏试验虽然结果可靠，且被公认为判断结核分枝杆菌耐药的金标准，但该方法需要细菌培养，耗时2～4个月，易贻误病情。

随着分子生物学的飞速发展，为结核分枝杆菌耐药性快速检测提供可能。

本中心采用PCR线性杂交酶显色法建立利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法对送检的疑似耐药结核病患者临床标本进行检测，并将结果与比例法药敏试验进行分析，现报告如下。

1 材料与方法
1. 1 材料取2013年10月～2015年5月送检的疑似耐药结核病患者临床标本88份，其中痰65份，肺泡灌洗23份。

1. 2 去污染处理将1～2倍于痰及肺泡灌洗液样本的4%NaOH放置于样本中，震荡混匀，静置20 min，再将pH=6.8的磷酸缓冲液加入样本中， 3000 r/min离心1 min，沉淀后去除上清液，将1 ml磷酸缓冲液加入其中，混匀，获得去污染样本。

1. 3 方法
1. 3. 1 比例法药敏试验取适量去污染样本在酸性固体罗氏培养基上接种，在37℃温度下培养7 d，菌群鉴定采用齐-尼氏染色法，共得结核分枝杆菌分离株64株。

制备10-2 g/L和10-4 g/L菌悬液，各取0.01 ml采用划线法接种在含药培养基及对照培养基表面， 37℃温度下培养4周，≤1%为敏感。

1. 3. 2 快速检测方法的建立采用PCR线性杂交酶显色法建立快速检测方法。

取去污染样本500 μl加入1.5 ml离心管，以5600 r/min的速度离心15 min后去上清液，加入去离子水500 μl，再次以5600 r/min的速度离心15 min，沸水浴20 min，超声裂解15 min，取上清液5 μl为DNA模板。

采用BLAST软件对katG、inhA和rpoB基因合适的扩增区域进行引物扩增，其中katG基因2个探针， inhA基因2个探针， rpoB基因11个探针。

PCR扩增体系（引物1 μl，
2.5 mmol/L三磷酸脱氧核糖核苷混合物4 μl， 10×PCR缓冲液5 μl，MgCl2 3 μl，DNA聚合酶5.0 U，去离子水3 μl，提取的DNA模板5 μl）进行PCR扩增。

扩增条件：第一阶段：95℃ 15 min， 95℃ 30 s， 58℃ 2 min， 10个循环；第二阶段：95℃ 25 s， 53℃ 40 s，70℃ 40 s， 30个循环；第三阶段：70℃ 8 min。

取20 μl PCR扩增产物加入杂交盘中，与20 μl 变性裂解液混匀，室温静置5 min后，加入1 ml杂交缓冲液，放入探针试条。

将杂交盘放入GTblot-20全自动杂交仪，杂交成功后取出试纸吸水纸干燥，判读。

1. 4 统计学方法采用SPSS19.0统计学软件处理数据。

计数资料以率（%）表示，采用χ2 检验。

P
2 结果
比例法药敏试验中仅对利福平耐药26份，仅对异烟肼耐药23份，对利福平和异烟肼均耐药19份，不耐药20份。

快速检测方法中对利福平耐药24份，仅对异烟肼耐药24份，对利福平和异烟肼均耐药22份，不耐药18份。

以耐药不耐药作为分割点，比例法药敏试验结果为参考标准，快速检测方法的灵敏度100.0%（68/68），特异度90.0%（18/20），准确度97.7%（86/88），两种检验方法一致性好（P=0.1573>0.05）。

3 讨论
目前，基于分子生物学研究的利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法包括实时PCR 单链构象多态性分析、实时PCR熔解曲线法、噬菌体法、基因芯片法及PCR线性杂交酶显色法等，后两种方法应用最为广泛。

这些方法预测耐药表型均基于结核分枝杆菌的rpoB、katG 和inhA基因特定区域或位点突变[2]。

约96%的利福平耐药性与rpoB突变相关， 30%～60%的异烟肼耐药性与katG基因突变相关，故上述基因区域可基本覆盖耐药基因突变情况，为检测技术的灵敏度和准确性提供保障。

PCR线性杂交酶显色法也可见于慢性乙型肝炎病毒拉米夫定耐药研究[3]。

该技术应用于结核分枝杆菌的检测时，通过多重聚合酶链反应结合反向杂交技术，与固定在硝化纤维条带上的特异基因杂交[4]，显色判读。

在此过程中PCR扩增效果不受细菌存活量的影响、杂交后化学信号放大，是PCR线性杂交酶显色法的灵敏度高的主要原因。

本研究结果显示快速检测方法的灵敏度100.0%，特异度90.0%，准确度97.7%，结果与
李大登等[5]报道一致。

本研究纳入为疑似耐药结核病患者，故耐药阳性检出率为77.27%（68/88），远高于其他报道的总耐药率29.14%[6]，符合事实。

此外，与比例法药敏试验相比， PCR线性杂交酶显色法成本更低，更利于在地市级结核病医院实验室应用[7]。

另外本研究中PCR线性杂交酶显色法整个操作过程≤6 h，可做到当天送检当天出结果，符合快速检测的要求。

综上所述，采用PCR线性杂交酶显色法建立利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法进行检测，与比例法药敏试验一致性好，可信度高，值得临床推广。

参考文献
[1] 欧维正，骆科文，王燕，等.基因芯片与比例法药敏性试验检测结核分支杆菌对利福平和异烟肼耐药性的比较研究.检验医学， 2013， 28（5）：404-407.
[2] 王峰，崔运勇，胡思玉，等.实时聚合酶链反应熔解曲线法快速检测耐多药结核分支杆菌.中华结核和呼吸杂志， 2011， 34（12）：888-893.
[3] 赖国旗，张文露，胡源，等.反向线性探针杂交技术检测慢性乙型肝炎病毒拉米夫定耐药研究.西南师范大学学报（自然科学版）， 2012， 37（3）：113-119.
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[6] 多丽娜，王婷婷，宋兴勃，等.分子线性探针技术分析四川地区结核分枝杆菌耐药情况.南方医科大学学报， 2011， 31（5）： 822-824.
[7] 李强，夏辉，欧喜超，等.应用线性探针技术与传统药敏试验检测耐药结核病的成本比较.中国防痨杂志， 2013， 35（3）：187-190.
[收稿日期：2015-11-09]。