硝态氮标准曲线工作表
植物中硝态氮的测定方法
硝态氮是植物最主要的氮源。
植物体内硝态氮含量往往能反映土壤中硝态氮供应情况，因此可作为土壤肥氮肥的指标。
测定植物体内的硝态氮含量，不仅能够反映出植物的氮素营养情况，而且对鉴定蔬菜和植物为原料的加工制品的品质也有重要的意义。
（一）原理在浓酸条件下，NO3-与水杨酸反应，生成硝基水杨酸，硝基水杨酸在碱性条件下（PH>12）呈黄色，在一定范围内，其颜色深浅与含量成正比，可直接比色测定。
（二）仪器与用具（1）722型分光光度计1台；（2）电子顶载天平1台（感量1/万）；（3）刻度试管20ml26支；（4）刻度吸管0.1ml. 0.5ml. 5ml. 10ml各1支；（5）容量瓶50ml8个；（6）容量瓶25ml3个；（7）小漏斗（∮5cm）3个；（8）玻棒1根；（9）洗耳球1个；（10）电炉1个；（11）铝锅1个；（12）玻璃塞；（13）定量滤纸7cm。
试剂：500ppmNO3-标准溶液精确称取烘至恒重的KNO3 0.7221克溶于无离水中，定容至200ml。
5%水杨酸一硫酸溶液称取5克水杨酸溶于100ml,浓硫酸中（密度为1. 84），搅拌溶解后，贮于棕色瓶中。
置冰箱保存一周有效。
8%氢氧化纳溶液称取10克氢氧化纳溶于1dm3无离子水中即可。
（三）实验步骤1. 标准曲线的制作（1）吸取500ppmNO3-标准溶液1ml. 2ml. 3ml. 4ml. 6ml. 8ml. 10ml. 12ml分别放入501ml容量瓶中，用无离子定至刻度，使之成10. 20、30、40、60、80、100、120、ppm的系列标准溶液。
（2）吸收上述系列标准溶液0.11ml，分别放入刻度试管中，以0.11ml无离子水代替标准溶液作空白，再分别加入0.4ml水杨酸一硫酸溶液，摇匀，在室温下放置20分钟后再加入8%NaOH溶液9. 51ml摇匀冷却至室温，显色液总体积为101ml。
（3）以空白作参比，在410nm波长下测定吸光度。
土壤硝态氮铵态氮的测定
（二）土壤硝态氮的测定1、酚二磺酸比色法1）方法原理土壤用饱和CaSO4 2H2O溶液浸提，在微碱性条件下蒸发至干，土壤浸提液中的NO3－—N在无水的条件下能与酚二磺酸试剂作用，生成硝基酚二磺酸。
C6H3OH(HSO3)2+HNO3→C6H2OH(HSO3)2 NO2+H2O2，4-酚二磺酸6-硝基酚-2，4-二磺酸此反应必须在无水条件下才能迅速完成，反应产物在酸性介质中无色，碱化后则为稳定的黄色溶液，黄色的深浅与NO3－—N含量在一定范围内成正相关，可在400～425nm处（或用蓝色滤光片）比色测定。
酚二磺酸法的灵敏度很高，可测出溶液中0.1mg•L-1 NO3－—N，测定范围为0.1～2mg•L-1。
2）主要仪器分光光度计、水浴锅、瓷蒸发皿。
3）试剂（1）酚二磺酸试剂：称取白色苯酚（C6H5OH，分析纯）25.0g置于500mL三角瓶中，以150mL纯浓H2SO4溶解，再加入发烟H2SO475mL并置于沸水中加热2h，可得酚二磺酸溶液，储于棕色瓶中保存。
使用时须注意其强烈的腐蚀性。
如无发烟H2SO4，可用酚25.0g，加浓H2SO4225mL，沸水加热6h配成。
试剂冷后可能析出结晶，用时须重新加热溶解，但不可加水，试剂必须贮于密闭的玻塞棕色瓶中，严防吸湿。
（2）10µg•mL-1 NO3－—N标准溶液：准确称取KNO3（二级）0.7221g溶于水，定容1L，此为100µg•mL-1 NO3－—N 溶液，将此液准确稀释10倍，即为10µg•mL-1 NO3－—N标准溶液。
（3）CaSO4•2H2O（分析纯、粉状）、（4）CaCO3（分析纯、粉状）、（5）1:1 NH4OH、（6）活性碳（不含NO3－），用以除去有机质的颜色。
（7）Ag2SO4（分析纯、粉状）、Ca(OH)2（分析纯、粉状）和MgCO3（分析纯、粉状），用以消除Cl-1的干扰。
4）操作步骤（1）浸提：称取新鲜土样（注1）50g（风干土样25g）放在500mL三角瓶中，加入CaSO4•2H2O 0.5g（注2）[凝聚剂的作用，使滤液不混浊而澄清]和250.00mL蒸馏水，盖塞后，用振荡机振荡10min。
土壤硝态氮铵态氮的测定
（二）土壤硝态氮的测定1、酚二磺酸比色法1）方法原理土壤用饱和CaSO4 2H2O溶液浸提，在微碱性条件下蒸发至干，土壤浸提液中的NO3－—N在无水的条件下能与酚二磺酸试剂作用，生成硝基酚二磺酸。
C6H3OH(HSO3)2+HNO3→C6H2OH(HSO3)2 NO2+H2O2，4-酚二磺酸6-硝基酚-2，4-二磺酸此反应必须在无水条件下才能迅速完成，反应产物在酸性介质中无色，碱化后则为稳定的黄色溶液，黄色的深浅与NO3－—N含量在一定范围内成正相关，可在400～425nm处（或用蓝色滤光片）比色测定。
酚二磺酸法的灵敏度很高，可测出溶液中0.1mg•L-1 NO3－—N，测定范围为0.1～2mg•L-1。
2）主要仪器分光光度计、水浴锅、瓷蒸发皿。
3）试剂（1）酚二磺酸试剂：称取白色苯酚（C6H5OH，分析纯）25.0g置于500mL三角瓶中，以150mL 纯浓H2SO4溶解，再加入发烟H2SO475mL并置于沸水中加热2h，可得酚二磺酸溶液，储于棕色瓶中保存。
使用时须注意其强烈的腐蚀性。
如无发烟H2SO4，可用酚25.0g，加浓H2SO4225mL，沸水加热6h配成。
试剂冷后可能析出结晶，用时须重新加热溶解，但不可加水，试剂必须贮于密闭的玻塞棕色瓶中，严防吸湿。
（2）10µg•mL-1 NO3－—N标准溶液：准确称取KNO3（二级）0.7221g溶于水，定容1L，此为100µg•mL-1 NO3－—N溶液，将此液准确稀释10倍，即为10µg•mL-1 NO3－—N标准溶液。
（3）CaSO4•2H2O（分析纯、粉状）、（4）CaCO3（分析纯、粉状）、（5）1:1 NH4OH、（6）活性碳（不含NO3－），用以除去有机质的颜色。
（7）Ag2SO4（分析纯、粉状）、Ca(OH)2（分析纯、粉状）和MgCO3（分析纯、粉状），用以消除Cl-1的干扰。
4）操作步骤（1）浸提：称取新鲜土样（注1）50g（风干土样25g）放在500mL三角瓶中，加入CaSO4•2H2O 0.5g（注2）[凝聚剂的作用，使滤液不混浊而澄清]和250.00mL蒸馏水，盖塞后，用振荡机振荡10min。
水质中硝态氮和亚硝态氮测定
水质中的硝态氮测定(紫外分光光度法)原理:利用硝酸盐在220nm 波长具有紫外吸收和在275nm 波长不具吸收的性质进行测定,于275nm 波长测出有机物的吸收值在测定结果中校正.试剂:1.无硝酸盐纯水:采用重蒸馏或者蒸馏--- 去离子法制备,用于配制试剂及稀释样品.2.盐酸溶液(1+11).3.硝酸盐氮标准储备溶液[p(N03---N)=100ug/mL]:称取经105'C烤箱干燥2h的硝酸钾(KN03) 0.7218g,溶于纯水中并定容至1000mL,每升中加入2mL 三氯甲烷,至少可稳定6 个月.4.硝酸盐氮标准使用溶液[p(N03---N)=10ug/mL].仪器:1.紫外分光光度计以及石英比色皿.2. 具有比色管:50mL分析步骤:1.水预样处理:吸收50mL 水样于50mL 比色管中加1mL 盐酸溶液酸化.2.标准系列制备:分别吸收硝酸盐氮标准使用溶液0mL/L~7mg/L 硝酸盐氮标准系列，用纯水稀释到50mL,各加1mL盐酸溶液.3.用纯水调节仪器吸光度为0，分别在220nm和275nm波长测量吸光度.计算:在标准样品的220nm 波长吸光度中减去2倍于275nm 波长的吸光度,绘制标准曲线和在曲线上直接读出样品中的硝酸盐氮的质量浓度.注:若275nm波长吸光度的2倍大于220nm波长吸光度的10%时，本标准将不能适用.水质中亚硝态氮的测定(重氮偶合分光光度法)原理:在pH1.7 以下,水中亚硝酸盐与对氨基苯磺酰胺氮化,再与盐酸N-(1- 萘)-乙二胺产生偶合反应,生成紫红色的偶氮染料,比色定量.试剂:1.氢氧化铝悬浮液2.对氨基苯磺酰胺溶液3. 盐酸N-(1- 萘)-乙二胺溶液4. 亚硝酸盐氮标准储备液[p(NO2 —N)=50ug/mL]: 称取0.2463g 在玻璃干燥器内放置24h 的亚硝酸钠(NaNO2), 溶于纯水中,并定容至1000mL. 每升中加2mL 三氯甲烷保存.5. 亚硝酸盐氮标准使用溶液[p(NO2 —N)=0.10ug/mL]仪器:1.具塞比色管:50mL.2.分光光度计.分析步骤:1. 若水样浑浊或色度较深,可先取100mL, 加入2mL 氢氧化铝悬浮液,搅拌后静置数分钟,过滤.2.先将水样或处理后的水样用酸或碱调近中性.取50.0mL 置于比色管中.3.另取50mL 比色管8 支, 分别加入亚硝酸盐氮标准液0,0.50,1.00,2.50,5.00,7.50,10.00 和12.50mL, 用纯水稀释至50mL.4.向水样以及标准色列管分别加入1mL 对氨基苯磺酰胺溶液,摇匀后放置2min~8min.加入I.OmL盐酸N-(1-萘)-乙二胺溶液，立刻混匀.5.于540nm波长，用1cm比色皿，以纯水作参比，在10min至2h内,测定吸光度.如亚硝酸盐氮浓度低于4ug/L 时,改用3cm 比色皿.6.绘制曲线,查出亚硝态氮含量.计算:水样中亚硝态氮质量浓度计算见式:P(NO2-N)= m / VP(NO2-N):mg/L, 亚硝酸氮质量浓度M:从标准曲线上查的样品管中亚硝酸盐氮的质量，单位为微克(ug)V: 水样体积,mL。
植物体内硝态氮含量的测定
二、植物体内硝态氮含量的测定硝态氮是植物最主要的氮源。
植物体内硝态氮含量往往能反映土壤中硝态氮供应情况，因此可作为土壤肥氮肥的指标。
测定植物体内的硝态氮含量，不仅能够反映出植物的氮素营养情况，而且对鉴定蔬菜和植物为原料的加工制品的品质也有重要的意义。
（一）原理在浓酸条件下，NO3-与水杨酸反应，生成硝基水杨酸，硝基水杨酸在碱性条件下（PH>12）呈黄色，在一定范围内，其颜色深浅与含量成正比，可直接比色测定。
（二）仪器与用具（1）722型分子光光度计1台；（2）电子顶载天平1台（感量1/万）；（3）刻度试管20cm326支；（4）刻度吸管. . 5cm3. 10cm3各1支；（5）容量瓶50cm38个；（6）容量瓶25cm33个；（7）小漏斗（∮5cm）3个；（8）玻棒1根；（9）洗耳球1个；（10）电炉1个；（11）铝锅1个；（12）玻璃塞；（13）定量滤纸7cm。
试剂：500ppmNO3-标准溶液精确称取烘至恒重的KNO3克溶于无离水中，定容至200cm3。
5%水杨酸一硫酸溶液称取5克水杨酸溶于100cm3,浓硫酸中（密度为1. 84），搅拌溶解后，贮于棕色瓶中。
置冰箱保存一周有效。
8%氢氧化纳溶液称取10克氢氧化纳溶于1dm3无离子水中即可。
（三）实验步骤1. 标准曲线的制作（1）吸取500ppmNO3-标准溶液1cm3. 2cm3. 3cm3. 4cm3. 6cm3. 8cm3. 10cm3. 12cm3分别放入501cm3容量瓶中，用无离子定至刻度，使之成10. 20、30、40、60、80、100、120、ppm的系列标准溶液。
（2）吸收上述系列标准溶液，分别放入刻度试管中，以无离子水代替标准溶液作空白，再分别加入水杨酸一硫酸溶液，摇匀，在室温下放置20分钟后再加入8%NaOH溶液9. 51cm3摇匀冷却至室温，显色液总体积为101cm3。
（3）以空白作参比，在410nm波长下测定吸光度。
铵态氮和硝态氮测定方法!!!---副本
铵态氮和硝态氮测定方法---副本铵态氮测量方法（2mol•L-1KCl浸提—靛酚蓝比色法）1）方法原理2mol•L-1KCl溶液浸提土壤，把吸附在土壤胶体上的NH4+及水溶性NH4+浸提出来。
土壤浸提液中的铵态氮在强碱性介质中与次氯酸盐和苯酚作用，生成水溶性染料靛酚蓝，溶液的颜色很稳定。
在含氮0.05～0.5mol•L-1的范围内，吸光度与铵态氮含量成正比，可用比色法测定。
2）试剂（1）2mol•L-1KCl溶液称取149.1g氯化钾（KCl，化学纯）溶于水中，稀释至1L。
（2）苯酚溶液称取苯酚（C6H5OH，化学纯）10g和硝基铁氰化钠[Na2Fe(CN)5NO2H2O]100mg稀释至1L。
此试剂不稳定，须贮于棕色瓶中，在4℃冰箱中保存。
（3）次氯酸钠碱性溶液称取氢氧化钠（化学纯）10g、磷酸氢二钠（Na2HPO4•7H2O，化学纯）7.06g、磷酸钠（Na3PO4•12H2O，化学纯）31.8g和52.5g•L-1次氯酸钠(NaOCl，化学纯，即含10%有效氯的漂白粉溶液)5mL溶于水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中，在4℃冰箱中保存。
（4）掩蔽剂将400g•L-1的酒石酸钾钠（KNaC4H4O6•4H2O，化学纯）与100g•L-1的EDTA二钠盐溶液等体积混合。
每100mL 混合液中加入10 mol•L-1氢氧化钠0.5mL。
（5）2.5µg•mL –1铵态氮（NH4+—N）标准溶液称取干燥的硫酸铵[(NH4)2SO4，分析纯0.4717g溶于水中，洗入容量瓶后定容至1L，制备成含铵态氮（N）100µg•mL –1的贮存溶液；使用前将其加水稀释40倍，即配制成含铵态氮（N）2.5µg•mL –1的标准溶液备用。
3）仪器与设备：往复式振荡机、分光光度计。
4）分析步骤（1）浸提称取相当于10.00g干土的新鲜土样（若是风干土，过10号筛）准确到0.01g，置于150mL三角瓶中，加入氯化钾溶液100mL，塞紧塞子，在振荡机上振荡1h。
氮素相关测定方法(精)
二.亚硝态氮、硝态氮、铵态氮、尿素测定1.硝态氮测定（紫外分光光度校正因数法）1.约测：吸取水样（土壤浸提液）注入1cm光径石英比色杯中，以浸提剂为参比，在210nm波长处约测吸收值。
根据约测结果，测定浸出液应予稀释的倍数，使吸收溶液吸收值在0.1~0.8之间。
2.测定：水样（浸出液）稀释一定倍数后，吸取25ml放入50ml三角瓶中，加入1.00ml 1：9硫酸溶液，摇匀。
装入1cm光径石英比色杯在紫外分光光度计上分别于210nm和275nm处测定吸光度A210和A275，以同样稀释酸化后的饱和硫酸钙溶液为参比溶液，调节仪器的零点。
3.工作曲线绘制：吸取10mg/LNO3—N标准溶液0.00、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00ml于50ml容量瓶中，（加一定体积浸提剂）定容。
即得0.00、0.20、0.40、0.80、1.20、1.60mg/LNO3—N标准溶液。
各取25.00mL于50ml三角瓶中，加1.00ml1：9硫酸溶液，摇匀。
装入1cm光径石英比色杯在紫外分光光度计上分别于210nm和275nm处测定吸光度A210和A275。
4.结果计算：ΔA= A210-A275f其中f为校正因数，在土壤有机质含量小于50g/kg时，f可取2.2，若大于土壤有机质含量大于50g/kg，需重新测定。
硝态氮含量（mg/kg）=c*V*D/m其中c为溶液中硝态氮浓度（mg/L），V为浸提液体积（mL），m为烘干土样质量（g），D为浸出液稀释倍数，不稀释时为1。
2.亚硝酸根的测定（重氮化耦合分光光度法）吸取50mL水样于100mL容量瓶中，加4mL对氨基苯磺酸显色剂及4mLa-萘胺显色剂，加蒸馏水至刻度摇匀。
放置20min后在分光光度计上用530nm波长进行比色，读取透光度。
绘制标准曲线：吸取亚硝酸盐标准溶液0、0.5、1、3、5mL，分别放入100mL容量瓶中，此标准系列含亚硝酸根分别为0、0.05、0.1、0.3、0.5mg/L，与待测水样同样条件进行比色，绘制标准曲线。
土壤中氨氮、硝氮、速磷测定
硝态氮用30分钟后，提取液中硝氮测定同水中硝氮测定。
♦主要试剂：(1)0.100mg/ml硝酸盐氮标准储备液(购置或自配)：称取0．7218g硝酸钾(经105—110℃烘4小时)溶于水中，移至1000毫升容量瓶中用水稀释至标线。
(2)盐酸溶液：C (HCl) =lmol／L(盐酸系优级纯)♦标准曲线的绘制向6支100ml0、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00ml，用新鲜去离子水稀释到、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mg／L)。
按水样测定相同步骤测量吸光度。
根据220nm与二倍275nm波长吸光度值之差对浓度作图，绘制标准曲线。
♦1cm石英比色皿在紫外分光光度计上，用新鲜去离子水50ml加220nm及275nm波长处的吸光度。
♦结果计算校正吸光度计算：Ar=A220nm -2A275nm式中：Ar——校正吸光度；A220nm——220nm波长处测得的吸光度；A275nm——275nm波长处测得的吸光度由标准曲线算出相应水样硝态氮含量。
氨态氮2 mol·L-1KCl浸提—蒸馏法方法原理用2mol·L-1KCl浸提土壤，把吸附在土壤胶体上的NH4+及水溶性NH4+浸提出来。
取一份浸出液在半微量定氮蒸馏器中加MgO（MgO是弱碱，有防止浸出液中酰铵有机氮水解的可能）蒸馏。
蒸出的氨以H3BO3吸收，用标准酸溶液滴定，计算土壤中的NH4+—N含量。
主要仪器振荡器、半微量定氮蒸馏器、半微量滴定管（5mL）。
试剂（1）20g·L -1硼酸—指示剂。
20gH3BO3（化学纯）溶于1L水中，每升H3BO3溶液中加入甲基红—溴甲酚绿混合指示剂5mL并用稀酸或稀碱调节至微紫红色，此时该溶液的pH为4.8。
指示剂用前与硼酸混合，此试剂宜现配，不宜久放。
（2）0.005 mol·L-11/2H2SO4标准液。
量取H2SO4（化学纯）2.83mL，加蒸馏水稀释至5000mL，然后用标准碱或硼酸标定之，此为0.0200 mol·L-1 (1/2H2SO4)标准溶液，再将此标准液准确地稀释4 -1（注1）（4）120g·L MgO悬浊液MgO12g经500～600℃灼烧2h，冷却，放入100mL水中摇匀。
试验八植物体内硝态氮含量的测定-安徽建筑大学
《环境生物学实验》实验指导书洪桂云鲍立宁王莉编写适用专业：环境生态工程安徽建筑大学环境与能源工程学院2017 年6 月前言《环境生物学实验》是环境生态工程专业的必修课。
本课程是培养学生基本技能、训练实践技能的一个重要教学环节，通过实验使学生对环境生态工程中的生物学原理有一个深入的认识，从而更深刻地理解和掌握专业基本理论和基本知识，并且为日后深入研究污水监测、修复技术提供一种实践技能。
通过本课程学习使学生掌握微生物和植物学实验的基本原理、基本知识和基本实验技能；掌握显微镜的使用、保养，水质生物学检测，微生物的基本形态认识及微生物的培养、分离、染色、计数等基本技能，培养学生独立操作能力；树立理论联系实际的基本思想，养成良好的动手能力，增强创新能力。
本课程共设10个实验，其中显微镜的使用及放线菌、真菌、藻类等微生物形态的观察，水中浮游动物的观察和数量的测定，培养基的制备及灭菌，植物叶绿素提取，植物体内硝态氮含量的测定为验证性试验；空气中微生物的计数，水中细菌总数的检测及水质量评价，植物种子发芽毒性检测，植物体内过氧化物酶对污染物的测定，有机物的微生物降解为综合性实验。
实验技术课的主旨和要求1.1实验技术的主旨任何科学知识和理论都来源于实际的观察和科学实验，这一点对于环境科学更是如此。
实验技术课程是大多数课程的重要组成部分，在实验课上培养起来的科研素质和实验技能，不仅对学生完成学业而且对从事创新性课题研究都具有重要而深远的意义。
实验技能的培养包括：①设计实验，在了解实验原理和目的基础上，逐渐学会自己设计实验；②观察与测量，这是实验过程的主要内容；③实验记录，真实准确地记录实验中每一个数据、每一个细节并且及时进行整理；④分析和解释数据，是处理实验数据的基本功；⑤写作实验报告，是对实验技术过程和实验结果的总结，同时也是提升综合科研素质和实验能力的重要一环。
1.2实验技术课的基本要求1.2.1课前充分准备课前务必做到如下准备①预先仔细阅读实验讲义内容，明确实验目的和实验技术。
转氨酶、硝态氮、铵态氮等测定方法
六、氮含量〔硝酸盐、亚硝酸盐、游离氨基酸、铵态氮等〕的测定：〔2g〕样品提取液的提取: 称取新颖植物组织2g，参加15ml无离子水研磨成匀浆，置于45℃振荡机中摇动浸提〔或超声波〕lh后用5ml无离子水冲洗干净，然后离心或过滤(如含色素需用活性炭脱色)，滤液备用。
备注〔lg的经历〕：可溶性糖、可溶性蛋白质、VC等需要研磨提取的简单指标也可以使用此提取液按比例测定。
1硝态氮的测定：标准氮试剂：精称KNO3 0.9021g，溶于少量重蒸无离子水中，并定容至250ml，含N 量为500µgNO3一N／ml。
5％水杨酸一硫酸溶液：称取水杨酸5g，溶于100ml浓H2SO4(比重1．84)中，搅拌溶解后贮于棕色瓶内，冰箱中至多保存l周，最好现用现配。
2mol／L NaOH溶液：称取NaOH 80g放入500ml硬质烧杯中，参加重蒸无离子水200ml，溶解后定容至l000ml。
操作方法标准曲线制作取：50ml容量瓶6只(编号)，依次参加标准氮试剂5、l0、l5、20、25、30ml，用无离子水定容，那么成为50、100、l50、200、250、300 ug／ml 的氮系列标准溶液；再取干沽50ml三角瓶7只，分别装入上述系列溶液0．2ml，剩下的1只三角瓶参加无离水0.2ml(作为O 点)；然后分别参加5％水杨酸一硫酸溶液0.8ml，混匀静置20--30min(显色)；最后参加2mol／L NaOH溶液l9ml，混匀。
冷却后利用751分光光度计，于410nm下比色，记录光密度(OD)值；并以OD 值为纵座标，以标准氮(0、50、l00、150、200、250、300 ug)为横座标，绘制一条标准曲线(通过原点的直线)。
0.1ml滤液＋0.4ml 5％水杨酸一硫酸溶液，混匀静置20--30min(显色)；最后参加2mol／L NaOH溶液9.5ml，混匀。
冷却后利用751分光光度计，于410nm下比色，记录光密度(OD)值；结果计算按照公式A= CV1/(WV2) 计算。
植物体内硝态氮含量的测定
二、植物体内硝态氮含量的测定硝态氮是植物最主要的氮源。
植物体内硝态氮含量往往能反映土壤中硝态氮供应情况，因此可作为土壤肥氮肥的指标。
测定植物体内的硝态氮含量，不仅能够反映出植物的氮素营养情况，而且对鉴定蔬菜和植物为原料的加工制品的品质也有重要的意义。
（一）原理在浓酸条件下，NO3-与水杨酸反应，生成硝基水杨酸，硝基水杨酸在碱性条件下（PH>12）呈黄色，在一定范围内，其颜色深浅与含量成正比，可直接比色测定。
（二）仪器与用具（1）722型分子光光度计1台；（2）电子顶载天平1台（感量1/万）；（3）刻度试管20cm326支；（4）刻度吸管0.1cm3. 0.5cm3. 5cm3. 10cm3各1支；（5）容量瓶50cm38个；（6）容量瓶25cm33个；（7）小漏斗（∮5cm）3个；（8）玻棒1根；（9）洗耳球1个；（10）电炉1个；（11）铝锅1个；（12）玻璃塞；（13）定量滤纸7cm。
试剂：500ppmNO3-标准溶液精确称取烘至恒重的KNO3 0.7221克溶于无离水中，定容至200cm3。
5%水杨酸一硫酸溶液称取5克水杨酸溶于100cm3,浓硫酸中（密度为1. 84），搅拌溶解后，贮于棕色瓶中。
置冰箱保存一周有效。
8%氢氧化纳溶液称取10克氢氧化纳溶于1dm3无离子水中即可。
（三）实验步骤1. 标准曲线的制作（1）吸取500ppmNO3-标准溶液1cm3. 2cm3. 3cm3. 4cm3. 6cm3. 8cm3. 10cm3. 12cm3分别放入501cm3容量瓶中，用无离子定至刻度，使之成10. 20、30、40、60、80、100、120、ppm的系列标准溶液。
（2）吸收上述系列标准溶液0.11cm3，分别放入刻度试管中，以0.11cm3无离子水代替标准溶液作空白，再分别加入0.4cm3水杨酸一硫酸溶液，摇匀，在室温下放置20分钟后再加入8%NaOH 溶液9. 51cm3摇匀冷却至室温，显色液总体积为101cm3。
实验七 水体铵态氮、亚硝态氮和硝态氮的测定
仪器
瓷蒸发皿 水浴锅 玻璃漏斗 50 mL具塞比色管 分光光度计 比色皿等
试剂
♪ 酚二磺酸
♪ 氢氧化钠溶液
♪ 硝酸盐氮贮备标准溶液
♪ 硫酸银溶液
♪ EDTA二钠溶液
♪ 氢氧化铝混悬液等
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（四）主要操作步骤
样品预处理（凝聚法）
200 mL水样
2 mL氢氧化铝悬浮液
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（五）结果计算与分析
A
氨氮标准曲线（纳氏法）2005.04.20 责任人：×××
0.250 0.200 0.150 0.100 0.050
淡水 海水
测定条件： 22℃ 7230分光 420nm 10mm比色皿
海水 A = 0.1937ρ + 0.0028
R 2 = 0.9991 试剂空白A 0 = 0.008
管号
1
2
3
4
5
6
ρ/(mg/L) 0 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00
VS /mL 0 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00
冷却后加入
玻棒研磨
酚二磺酸试剂1.0 mL 放置片刻
再研磨一次 放置10 min
加10ml纯水
410 nm处比色
转移至比色管
定容至标线
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溶液呈黄色
VS /mL
0
0.50 1.00 2.00 4.00 V水样
分别加入1.0 mL磺胺溶液 混匀
分别加入1.0 mL 盐酸萘乙二胺溶液
混匀 显色15 min
543 nm处比色
14
溶液呈红色
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（五）结果分析与计算
2.植物硝态氮的比色测定
中国海洋大学实验报告2015年11月02号姓名：白杰专业年级： 2014级生物科学学号： 14050011001同组者：曹昱课程：植物生理学实验题目：植物硝态氮的比色测定一、实验目的学会硝态氮的测定方法，学会分光光度计的使用。
二、实验原理用蒸馏水将植物组织中的硝酸盐和亚硝酸盐提取出来，加入锌粉将硝酸根还原成亚硝酸根后，与对氨基苯磺酸生成重氮盐，再与α-萘胺结合生成玫瑰红色的偶氮染料，在520nm波长处有吸收峰，并且在一定范围内其颜色的深浅与溶液中硝态氮含量成正比，可以用分光光度法进行测定。
三、仪器试剂1、仪器及用品分光光度计，研钵，容量瓶，比色管（50ml），试管，移液管，烧杯，三角瓶（100ml）。
2、试剂（1）硝酸盐标准溶液：取恒重硝酸钠0.6071g溶于一升水中，配成100μg/ml硝态氮溶液储存于冰箱中（0ºC~5ºC）备用。
（2）20％冰醋酸溶液（V/V）：取20ml分析纯冰醋酸加80ml水。
（3）混合粉剂：含硫酸钡100g，α-萘胺2g，锌粉2g，对氨基苯磺酸4g，硫酸锰10g，柠檬酸75g。
3、实验材料：植物叶柄四、实验步骤1、标准曲线的绘制将硝酸盐标准溶液稀释成0μg/ml，4μg/ml , 8μg/ml，12μg/ml,16μg/ml,20μg/ml 浓度的硝态氮溶液各10ml，摇匀后分别吸取2ml转入到50ml比色管中，加冰醋酸溶液18ml，再加0.4g混合粉剂，剧烈摇动1分钟，静置10分钟，用双层滤纸过滤于洁净的试管中，以蒸馏水作对照，测定其520nm波长处的吸光光度值，以浓度为横坐标，标准样品的吸光度值为纵坐标绘制标准曲线或做出回归曲线。
2、植物组织中硝态氮的提取称取待测的植物功能叶柄0.5g左右，剪成1~2mm的碎片，置于干燥的100ml三角瓶中，加入蒸馏水20ml，加塞进行激烈振荡1~3分钟，放置10分钟。
澄清后，取上部清液2ml，按标准曲线的步骤进行显色和必比色，测定植物样品的吸光度值。
硝态氮测定---酚二磺酸比色法
硝态氮测定---酚二磺酸比色法1）方法原理土壤用饱和CaSO4 2H2O溶液浸提，在微碱性条件下蒸发至干，土壤浸提液中的NO3－—N在无水的条件下能与酚二磺酸试剂作用，生成硝基酚二磺酸。
C6H3OH(HSO3)2+HNO3→C6H2OH(HSO3)2 NO2+H2O2，4-酚二磺酸6-硝基酚-2，4-二磺酸此反应必须在无水条件下才能迅速完成，反应产物在酸性介质中无色，碱化后则为稳定的黄色溶液，黄色的深浅与NO3－—N含量在一定范围内成正相关，可在400～425nm处（或用蓝色滤光片）比色测定。
酚二磺酸法的灵敏度很高，可测出溶液中0.1mg•L-1 NO3－—N，测定范围为0.1～2mg•L-1。
2）主要仪器分光光度计、水浴锅、瓷蒸发皿。
3）试剂（1）酚二磺酸试剂：称取白色苯酚（C6H5OH，分析纯）25.0g置于500mL三角瓶中，以150mL 纯浓H2SO4溶解，再加入发烟H2SO475mL并置于沸水中加热2h，可得酚二磺酸溶液，储于棕色瓶中保存。
使用时须注意其强烈的腐蚀性。
如无发烟H2SO4，可用酚25.0g，加浓H2SO4225mL，沸水加热6h配成。
试剂冷后可能析出结晶，用时须重新加热溶解，但不可加水，试剂必须贮于密闭的玻塞棕色瓶中，严防吸湿。
（2）10µg•mL-1 NO3－—N标准溶液：准确称取KNO3（二级）0.7221g溶于水，定容1L，此为100µg•mL-1 NO3－—N溶液，将此液准确稀释10倍，即为10µg•mL-1 NO3－—N标准溶液。
（3）CaSO4•2H2O（分析纯、粉状）、（4）CaCO3（分析纯、粉状）、（5）1:1 NH4OH、（6）活性碳（不含NO3－），用以除去有机质的颜色。
（7）Ag2SO4（分析纯、粉状）、Ca(OH)2（分析纯、粉状）和MgCO3（分析纯、粉状），用以消除Cl-1的干扰。
4）操作步骤测定（1）吸取B母液 50mL加入0.1g CaSO4•2H2O（注2）[凝聚剂的作用，使滤液不混浊而澄清]（含NO3－—N 20～150µg）震荡过滤，取25ml滤液于瓷蒸发皿中，加CaCO3约0.05g（注5）[调节pH，防止NO3－—N在酸性和中性条件下蒸干分解而损失]，在水浴上蒸干（注6），到达干燥时不应继续加热。
氮素相关测定方法(精)
二.亚硝态氮、硝态氮、铵态氮、尿素测定1.硝态氮测定（紫外分光光度校正因数法）1.约测：吸取水样（土壤浸提液）注入1cm光径石英比色杯中，以浸提剂为参比，在210nm波长处约测吸收值。
根据约测结果，测定浸出液应予稀释的倍数，使吸收溶液吸收值在0.1~0.8之间。
2.测定：水样（浸出液）稀释一定倍数后，吸取25ml放入50ml三角瓶中，加入1.00ml 1：9硫酸溶液，摇匀。
装入1cm光径石英比色杯在紫外分光光度计上分别于210nm和275nm处测定吸光度A210和A275，以同样稀释酸化后的饱和硫酸钙溶液为参比溶液，调节仪器的零点。
3.工作曲线绘制：吸取10mg/LNO3—N标准溶液0.00、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00ml于50ml容量瓶中，（加一定体积浸提剂）定容。
即得0.00、0.20、0.40、0.80、1.20、1.60mg/LNO3—N标准溶液。
各取25.00mL于50ml三角瓶中，加1.00ml1：9硫酸溶液，摇匀。
装入1cm光径石英比色杯在紫外分光光度计上分别于210nm和275nm处测定吸光度A210和A275。
4.结果计算：ΔA= A210-A275f其中f为校正因数，在土壤有机质含量小于50g/kg时，f可取2.2，若大于土壤有机质含量大于50g/kg，需重新测定。
硝态氮含量（mg/kg）=c*V*D/m其中c为溶液中硝态氮浓度（mg/L），V为浸提液体积（mL），m为烘干土样质量（g），D为浸出液稀释倍数，不稀释时为1。
2.亚硝酸根的测定（重氮化耦合分光光度法）吸取50mL水样于100mL容量瓶中，加4mL对氨基苯磺酸显色剂及4mLa-萘胺显色剂，加蒸馏水至刻度摇匀。
放置20min后在分光光度计上用530nm波长进行比色，读取透光度。
绘制标准曲线：吸取亚硝酸盐标准溶液0、0.5、1、3、5mL，分别放入100mL容量瓶中，此标准系列含亚硝酸根分别为0、0.05、0.1、0.3、0.5mg/L，与待测水样同样条件进行比色，绘制标准曲线。