引物的原理

引物的原理
引物是短的寡核苷酸片段，充当DNA复制的起点。

因为几乎所有DNA聚合酶都不能从头合成，所以它们需要一个3’-羟基作为DNA合成的起始点。

这个3’-羟基由相配的引物提供。

在体内，由于DNA聚合酶的忠实性，不能从头合成DNA，因此只能由RNA聚合酶（称为引物酶）生成，采用RNA引物来延伸，在延伸过程中，RNA引物降解并由DNA 取代。

在体外PCR反应中所用到的DNA引物，是根据不同的要求及模板序列设计，然后用化学法人工合成的，与模板形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸；对于大多数PCR反应，决定整个反应成功与否的最重要因素是引物的序列和质量。

1. 不同实验要求的引物选择
在开始设计引物之前，必须弄清以下几点：
（1）明确PCR的目的（例如克隆、SNP检测、定量检测等）
（2）确定样品材料（基因组DNA、RNA、微小RNA）
（3）确定PCR的类型（普通的、定量PCR、RT-PCR、长片段PCR)，在查找序列的时候还需要考虑可能存在的问题（如假基因等）
2.引物设计的重要因素
有一些不同的软件工具可用于引物设计和引物分析。

引物设计的软件如Oligo 6.22 ，Premier 5.0，Primer Express 3。

引物分析常用Primer 5，Oligo 6.22，Primer-Blast。

目前生工生物给客户提供的引物设计服务引物用的是在线软件Primer 3 plus，
引物长度和专一性
•常见的引物长度为18-30个碱基。

短的引物（≤15碱基）能非常高效地结合, 但是它们的专一性不够。

较长的引物能提高专一性，然而退火效率低，从而导致PCR产量低下。

同时应避免编码单一序列和重复序列的引物。

平衡GC含量，避免GC-和AT-富集区域
•引物的GC含量应介于40%～60%之间。

应避免聚-（dC）-或聚（dG）-区域，因为它们会降低退火反应的专一性。

聚-（dA）-和聚（dT）-也应避免，因为这样会形成不稳定的引物-模板复合物，从而降低扩增效率。

3’-序列
•3’端为G-或C-核苷酸较好，因为能增加结合强度。

同时它将提高PCR效率，因为引物-模板符合物的开放将达到最小。

但是，超过3个G/C碱基将会具有负面效果，因为会降低反应的专一性。

避免互补的引物序列
•引物设计应避免引物自身序列的互补性超过3个碱基。

因为这容易使引物形成自身发夹结构。

上下游引物之间的互补配对也应避免，尤其在作为扩增起始点和关键区域的3’端。

因为这将导致强引物二聚体形成，后者将与所需要的PCR反应竞争资源，导致PCR效率降低，在极端情况下，甚至导致完全无特异性目的产物生成。

退火温度是基于引物的解链温度（Tm）------计算方法。

•最常用的解链温度计算公式如下三种：“2+4”法则，亦称华莱士法则，对于14个碱基以下引物有效，
另外，还有GC法则，适用于长于13个碱基的序列，这两种方法都相对不准确。

“盐调整”法相对准确一些，考虑到了反应缓冲液中的中的Na+离子浓度(50 mM Na+ ,pH 7.0)。

但是不管根据哪种方法计算出的解链温度，都可用于估算最佳退火温度，也都仅作为实验参
考温度。

•DNA的化学合成研究起始于上世纪50年代。

•1953年英国科学家James Watson和美国科学家Francis Crick依据伦敦国王学院的罗莎琳富兰克林所拍摄的X光绕射图及相关资料，共同提出了最早的DNA的双螺旋结构，自此以后，科学家们便开始尝试核酸的人工合成。

•1957～1965年H.G.科拉纳等人设计并合成了由一种、两种或3种脱氧核苷酸组成的重复顺序的脱氧寡核苷酸片段，并以此为模板进一步复制和转录，得到了相对应的互补顺序的人工长链(mRNA)，再用这种人工mRNA在无细胞体系中进行蛋白质合成。

通过分析这样得到的多肽产物的氨基酸顺序和与模板中核苷酸顺序的对应关系破译了遗传密码。

•1958年，英国剑桥大学Todd实验室于首先合成了具有3’→5’磷酸二酯键结构的TpT和pTpT。

•自从Kary Mullis博士于1983年发明的PCR技术之后，加之1976年耐高温的Taq DNA聚合酶的发现并被分离纯化，PCR技术已成为分子生物学中被研究最多，应用最广泛的技术之一，其中引物的设计和合成是实现PCR关键的一环。

•1972年H.G Khorana 等人应用磷酸二酯法合成了相当于酵母内丙氨酸tRNA结构基因的DNA双链。

•1979年完成了包括启动和调节顺序在内的共有207个碱基对的大肠杆菌酪氨酸校正tRNA 基因。

•1981年，中国生化学家王德宝完成了酵母丙氨酸tRNA的全合成，这
是世界上第一个人工合成的具有全部生物活性的RNA分子。

•1982年，美国PE公司应用生物系统部(原美国应用生物系统公司，ABl)推出了世界上第一台全自动DNA合成仪。

•2000年9月，ABI最新推出的3900 台式高通量DNA合成仪。

现在国内比较常见的高通量DNA合成仪是ABI3900，MM192和OLIGO192，前者一次可合成48条，后二者一次可以合成192条。

其中以ABI公司的仪器占我国及世界市场的80～90%。

生工生物现在用的是ABI3900高通量合成仪。