引物的原理
引物设计原理
引物设计原理
引物设计原理是指利用一种叫做引物的化学物质来控制基因表达的原理。引物是一种小分子化合物，它可以与DNA或RNA结合，以激活或阻止基因表达。引物被用于多种应用，包括体外诊断、基因工程、生物技术和分子生物学等。引物设计是基因工程中一个重要的步骤，它涉及到精心设计、合成和测试引物，以使其能够灵活地与待检测的目标片段结合，并发挥所需的功能。
引物设计的基本原理是：精心设计和合成一种特定的化合物，使其特异性地与感兴趣的目标片段结合，并发挥所需的功能。引物的作用是将目标片段的复制过程定向激活或阻止，以便达到特定的研究目的。
精心设计引物的基本原理是合成一种适宜大小的化合物，使其能够与特定的目标片段特异性结合，从而激活或阻止特定的基因表达。要做到这一点，需要考虑三个重要的指标：引物的长度、基序和热稳定性。
引物的长度是指引物的氨基酸数，也就是引物的序列长度。一般来说，引物的长度应该在18-30个氨基酸之间，这样才能保证引物具有足够的灵敏度和特异性，从而达到最佳的表达效果。
引物的基序决定了它与目标片段的结合特异性。引物的基序应该完全符合表达目标片段的基序，以确保引物能够特异性地与目标片段结合。
引物的热稳定性决定了它在高温环境中的稳定性，即它能够在高温环境中保持原来的结构和功能。引物的热稳定性取决于其结构，如基序、碱基对等。一般来说，引物的热稳定性越高，它在更高的温度下的稳定性就越好。
根据上述原理，引物设计的一般步骤如下：
（1）确定目标片段的序列；
（2）选择合适的引物长度；
（3）设计和合成引物；
引物设计原理及详细步骤
2、引物长度一般在15-30碱基之间。
引物长度（primer length）常用的是18-27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。
3、引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。
GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm 值5-10℃。若按公式Tm=4（G+C+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55-80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
4、引物3'端要避开密码子的第3位。
如扩增编码区域，引物3'端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
5、引物3'端不能选择A，最好选择T。
引物3'端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，
G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3'端最好选择T。
6、碱基要随机分布。
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。
引物合成的原理
引物合成的原理
引物合成是一项重要的实验技术，用于在分子生物学研究中进行DNA扩增、测序等实验。其原理主要基于DNA的双链结构和配对原则。
在引物合成中，首先需要确定所需扩增的目标DNA序列，并根据该序列设计两个短的单链DNA片段，即引物。这两个引物的5'端需要与目标DNA序列互补配对。
引物合成通常通过核苷酸化学合成方法进行。该方法基于磷酸二酯链的扩增反应，通过使用已经含有保护基的核苷酸单元，逐个将核苷酸单元与反应基位点进行连接。每次反应结束后，需要进行碱性水解以去除保护基，再次进行连接反应。这样，在多次循环反应后，可以得到完整的引物。
在合成引物时，还需要注意控制反应条件，例如反应缓冲液的pH值、反应时间和温度等。合成后的引物可以通过比色法或者聚丙酰胺凝胶电泳进行质量检测。
引物合成的原理基于DNA的双链结构和碱基配对规则，通过化学合成方法制备出目标DNA序列的互补链。这些合成的引物可以作为DNA扩增、测序等实验中的起始点，有效地进行目标序列的扩增和分析。
引物设计原理
引物设计原理
引物设计是一种在分子生物学中使用的技术，它可以用来控制基因的表达或用于获取某些基因组的一部分分子序列。因此，引物设计的准确性和特异性非常重要，它可以满足分子生物学研究对高质量特异性DNA序列的需求。引物设计原理是引物设计的基础，它涉及到基因组学、分子生物学、基因工程等科学领域，是研究引物设计的思路和方法标准。
分子生物学中的引物设计是基因组学研究的重要组成部分，通过建立特异性的引物，可以提高基因表达的特异性和准确性，从而加快对基因的研究和理解。因此，引物设计的原理和方法是指其能够实现的标准，也是指DNA、RNA以及含有引物序列的模板的分子结构和表达特异性。
引物设计原理的基础是基因组学研究，由基因组学所获得的结果有助于分子生物学研究，特别是在揭示基因的功能和调控机制上。利用基因组学获取的序列信息，可以设计具有特定功能的引物，如在载体上的引物序列设计、基因的PCR扩增、连锁反应以及基因编辑，都能够从引物设计获得有效的特异性和准确性。
生物信息学技术经常被用于引物设计，通过运用相关的软件和算法，结合基因组序列和已知的信息，可以进行引物设计。这些软件有很多种，如OptiMAGE、OligoPerfect、PrimerSelect和GeneRunner 等，它们可以提供一些方便的工具来实现特定的引物设计。
此外，引物设计也应考虑到合成能力，即根据特定条件确定的引
物的长度、GC含量和结构，以确保引物的有效性和可生物合成性。一般而言，引物的最佳长度为18-25个核苷酸，其中包含一个或多个T节段，以简化引物合成过程。引物的GC含量应保持在30-70％之间，并且不应含有太多的碱基重复（优先选择三个及以下的碱基重复），这有助于避免引物的自反应。
PCR引物设计原理
PCR引物设计原理
PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增特
定DNA序列。PCR引物设计是PCR实验的关键步骤，合理的引物设计能够
确保PCR反应的特异性和高效性。
1.引物长度：通常，PCR引物的长度在18-25个碱基对之间，较短的
引物能够提高PCR扩增的特异性，但也会减弱引物与模板DNA的互补性。
较长的引物能够提高PCR扩增的选择性，但也会增加二次结构的可能性。
2. 引物温度：引物通常被设计成具有相似的熔解温度（Tm），即引
物与模板DNA解离的温度。Tm计算可根据引物序列中的碱基组成和长度
来进行，通常采用Wallace规则或Marmur规则。相似的Tm可以确保引物
在PCR反应中一起工作，提高特异性和扩增效率。
3.引物特异性：为了确保PCR扩增的特异性，引物应在模板DNA中有
唯一的互补区域。这可以通过NCBI的BLAST或其他引物设计软件进行引
物序列比对来验证。特异性也可以通过引物的3'端碱基匹配限制来提高。此外，避免引物之间的重叠或互补也可以减少非特异性扩增的风险。
4.引物GC含量：GC含量是影响PCR引物的熔解温度和特异性的重要
因素。高GC含量的引物比低GC含量的引物具有更高的熔解温度，因此在
高GC含量的引物中，引物长度应适当缩短，以保持相似的Tm。此外，高GC含量的引物在互补区域中与模板DNA结合更牢固，有利于特异性扩增。
5.引物末端修饰：末端修饰可以改变引物的特性，如增加引物的亲合性、稳定性和特异性。一般采用引物末端加入磷酸基团或胺基基团的修饰，用于提高引物的稳定性和抗核酸酶降解的能力。
随机引物法的原理
随机引物法的原理
1. 介绍
随机引物法（Random Primer法）是一种在分子生物学中广泛应用的技术，主要用
于DNA合成、PCR扩增、DNA测序等实验中。通过引物（primer）的作用，可以选
择性地引导DNA聚合酶在特定的DNA模板上进行扩增或合成。随机引物法可以产生随机组合的引物序列，其主要原理是利用随机核苷酸序列作为引物，有助于扩增或合成复杂的DNA。
2. 引物的作用
引物是DNA或RNA序列的片段，它们在聚合酶链式反应（PCR）中的作用是选择性
地与DNA模板连接，提供一个起始点供聚合酶进行扩增或合成。引物的序列需要与目标DNA序列互补，以确保特异性扩增或合成。在随机引物法中，引物序列是随机选择的，因此可以扩增或合成具有不同序列的DNA。
3. 随机引物法的步骤
随机引物法主要包括以下步骤：
步骤1：选择随机引物
在随机引物法中，首先需要选择合适的随机引物。随机引物可以由四种核苷酸（A、T、C和G）组成，并且不具有特定的序列。常见的随机引物包括deoxyoligonucleotide primers（dN6）和hexamer primers（dN6）。
步骤2：模板DNA的提取
随机引物法需要一定数量的模板DNA作为反应的起始物质。模板DNA可以从细胞中提取，也可以通过酶切、PCR扩增等方法获得。
步骤3：引物的合成
随机引物通常由化学合成的方式取得。引物的合成可以通过DNA合成仪或商业合成公司进行。
步骤4：引物的连接
引物需要连接到目标DNA的末端，以启动聚合酶的扩增或合成。可以使用引物连接试剂或聚合酶来完成此步骤。
引物设计原理
引物设计原理
概述
引物设计是在分子生物学和遗传学研究中非常重要的一部分内容。引物是用于PCR（聚合酶链式反应）、基因克隆和DNA测序等实验中的关键组成部分。引物
的设计必须精确合理，以确保实验的准确性和可重复性。本文将介绍引物的设计原理以及一些常用的引物设计工具。
引物的定义
引物是一段短的DNA或RNA序列，它们与待扩增或待测序的目标序列的两个
特定位点相互作用。在PCR反应中，引物与目标序列的两个末端结合，然后通过
聚合酶的作用，在目标序列上合成新的DNA链。在基因克隆和测序中，引物与目
标序列特定区域结合，以实现目标序列的扩增或测序。
引物设计原则
引物的设计需要考虑以下几个原则：
1. 特异性
引物应该具有高度的特异性，即只与目标序列的特定区域相互作用。这可以通
过选择具有较高GC含量的引物来实现，因为高GC含量使引物更稳定，并能够与
目标序列更特异地结合。同时，通过在引物的3’末端引入一些限制性内切酶位点，还可以进一步确保引物的特异性。
2. 避免组内和组间杂交
在引物设计过程中，需要避免引物之间的互相杂交以及引物与非目标序列的互
相杂交。互相杂交可能导致非特异性扩增产物的产生，影响实验结果的准确性。为了避免这种情况的发生，引物设计时需要借助生物信息学工具进行引物比对和引物间互相比对的分析，以确保引物之间没有相互重叠的区域。
3. 合适的长度和温度
引物的长度和温度也是引物设计中需要考虑的因素。通常，引物的长度在18-
30个碱基对之间，过长或过短的引物都会导致不理想的扩增效果。此外，引物的
熔点温度（Tm）应该在50-65摄氏度之间，以保证PCR反应的成功进行。
引物设计的原理与程序
引物设计的原理与程序
引物设计是一项用于DNA或RNA扩增的关键技术，它在分子生物学和
遗传学的研究中起着重要作用。引物设计的原理是通过合成、设计一对互
补序列的引物，在PCR（聚合酶链式反应）等技术中，使其能够高度特异
地结合到目标DNA/RNA的特定区域，从而引导扩增反应的发生。为了实现
引物的高精确性和特异性，人们依据一些特定的规则和算法来设计引物，
其中最常用的是吉布斯自由能最小化法和龙格－库塔法（Runge-Kutta algorithm）等。
引物设计程序可以粗略地分为以下几个步骤：
1.目标序列选择：首先，根据实验需求和研究目的选择一个适当的目
标序列，该序列通常来自于已知序列数据库或文献报道。
2.引物长度和Tm值的设定：确定所需的引物长度以及Tm值（熔解温度），Tm值通常在50-60℃之间。引物长度的选择可以考虑到特定的实验
条件，如扩增反应中的嵌合效应和引物的特异性。
3.引物序列设计：根据目标序列，设计一对能够互补结合到目标
DNA/RNA特定片段的引物。引物的设计一般应满足以下几个条件：
a.引物长度一般为18-25个核苷酸，长度相似，所取的GC含量相似；
b.引物之间的互补碱基序列长度差异不大，理想情况下应相同，差异
尽量不超过2个碱基；
c.引物的GC含量应在40%-60%之间，根据需要可以适量调整；
d.引物不能含有重复序列、空白区域、内部多聚物等；
e. 引物的3'端应尽可能避免GCgc和ATat碱基对的设计。
4. 引物的特异性分析：在引物设计过程中，需要进行特异性分析，
确保引物与非目标序列无法结合。利用生物信息学工具，如BLAST
pcr引物原理
pcr引物原理
PCR引物原理是一种用于复制特定DNA片段的方法。PCR
（聚合酶链式反应）是通过不断重复三个步骤来实现的：变性、退火和延伸。在这个过程中，引物起着关键作用。
引物是一小段单链DNA分子，它的序列与所要复制的DNA
片段的起始和终止位置相匹配。PCR过程中需要使用两个引物，一个用于复制DNA片段的前半部分，另一个用于复制DNA片段的后半部分。
PCR开始时，DNA样品被加热，使其两条链分离。然后，温
度被降低，引物结合到目标DNA片段的起始和终止位置。引
物的结合在一定温度下是特异性的，即仅与与其序列完全匹配的DNA片段结合。
下一步是延伸。在一定温度下，Pfu聚合酶（或其他DNA聚
合酶）开始合成一条新的DNA链，利用目标DNA作为模板。此时，引物结合到模板上，指导新的DNA链的合成。
重复这些步骤几次后，DNA片段的复制数目会呈指数级增加。每一轮PCR循环，DNA片段的复制数目翻倍。这使得可以从
很少数量的起始DNA中扩增出大量DNA。
引物在PCR中起着关键作用，它们的设计必须精确。引物的
长度和序列决定了它们的特异性和效率。过长或过短的引物可能无法特异性地结合到目标DNA片段上，导致PCR的失败。因此，在进行PCR实验时，合理设计引物是至关重要的。
引物设计的原理和程序
引物设计的原理和程序
一、设计原理
1、择合适的靶序列：设计引物之前，必须分析待测靶序列的性质，选择高度保守、碱
基分布均匀的区域进行引物设计。
2、长度：一般来说，寡核苷酸引物长度为15～30bp。
3、Tm值：引物的Tm值一般控制在55～60℃，尽可能保证上下游引物的Tm值一致，
一般不超过2℃。若引物中的G+C含量相对偏低，则可以使引物长度稍长，而保证一定的退火温度。
4、（G+C）含量：有效引物中（G+C）的比例一般为40～60％。
5、碱基的随机分布：引物中四种碱基的分布最好是随机的，不存在聚嘌呤和聚嘧啶，
尤其在引物的3’端不应超过3个连续的G或C。
6、引物自身：引物自身不存在连续4个碱基以上的互补序列，如回文结构，发夹结构
等，否则会影响到引物与模板之间的复性结合，尤其避免3’末端的互补。
二、引物设计操作流程
序列下载
引物设计筛选
1、 序列查找
根据所需检测的病原体或者待检特定基因，在/pubmed 网址查询有关序列。
2、同源性比较 主要有两种方法
A、在/blast/blast.cgi 网址进行在线的两两比较。
B、
采用OMIGA, PCGENE 等软件进行两两或多序列比较。 1、打开OMIGA 软件，导入（import）下载存盘的纯文本序列文件：
2、选择待比较的多条序列，右键点击“align sequences”命令；
3、等待计算机处理，直至状态显示排列结束，点击“alignment”显示结果；
4、“alignment”结果，相同碱基以同色标记
三、引物设计与筛选 Primer Premier 5.0软件为例，进行引物设计和筛选的操作示范
引物合成的基本原理
引物合成的基本原理
引物合成是一种重要的实验技术，用于检测和分析DNA、RNA或蛋白
质序列。引物合成的基本原理是通过化学方法合成一段与目标序列互补的
短链核苷酸，以便在实验中用作引物。以下是引物合成的详细基本原理的
解释。
首先，引物合成需要知道目标序列的碱基顺序。这可以通过DNA或RNA序列数据的在线数据库或实验室内部的测序技术得到。获得目标序列后，可以确定所需引物的长度和序列。
引物的长度通常为15-30个碱基，最好是20-25个碱基。较短的引物
可能会导致特异性较差的扩增，而较长的引物可能会降低扩增效率。因此，选择合适长度的引物是非常重要的。同时，引物的序列也要尽量选择没有
或较少重复区域的部分，以避免非特异性扩增。
引物合成一般使用化学方法，如磷酸二酯法或磷酸三酯法。这些方法
允许在无机硅胶或C18纯化柱上合成短链核苷酸。具体步骤包括：
1.碱基保护基团的去除：在引物合成开始之前，需要去除碱基的保护
基团。这可以通过二乙酰苯基（使用二乙酰氯）或9-氨甲基吲哚（使用
氨甲基化试剂）进行。
2.磷酸二酯法合成：将合成核苷酸的3'-端与2-氧乙基基团反应，使
其与下一个核苷酸的5'-端形成磷酸二酯键。这个过程在固相合成柱上完成。
3.磷酸三酯法合成：将合成核苷酸的3'-端与N-4-二丁氨基甲酸保护
基团反应，同时在5'-端加入磷酸二维碘苯基团作为保护基团。然后，通
过反应剂如二乙酰二硝酸酯或乙二酸二苄酯，将5'-端碱基上的保护基团
去除，使其能够与下一个核苷酸形成磷酸三酯键。这个过程在固相合成柱
上完成。
4.引物的纯化与检验：合成的引物需要经过纯化步骤去除其他杂质所
引物设计原理
引物设计原理
引物设计原理是指科学家在实验中经过一系列的研究和实践得出的一套有效的设计方法和原则。引物是在分子生物学研究中非常重要的工具，它们是通过与目标DNA序列特异性配对而
实现其它分子生物学方法的关键。正确设计引物对于实验的成功与否起着至关重要的作用。以下是一些常用的引物设计原则：
1. 引物长度：一般来说，引物的长度应在18-24个碱基对之间。过长的引物可能会导致引物与非特异性DNA序列杂交，而过
短的引物则可能导致特异性的问题。
2. 引物序列：引物的序列应该与目标序列互补，这样才能够有效地与目标DNA序列特异性结合。此外，要避免引物序列中
出现重复、互补或自身互补的碱基序列，以减少非特异性杂交的可能性。
3. 引物的熔解温度：引物的熔解温度是指在升温过程中引物与DNA序列间的杂交解离所需的温度。为了保证特异性杂交的
效果，引物的熔解温度应在50-60°C之间。可以通过调整引物
的长度和碱基组成来调节其熔解温度。
4. 引物的GC含量：GC含量是指引物中含有鸟嘌呤（G）和
胞嘧啶（C）的比例。一般来说，引物的GC含量应在40-60%之间，过低或过高的GC含量都可能导致非特异性杂交的问题。
5. 引物的两个末端：引物的两个末端应该设计成自由的3'末端，以便于引物在PCR扩增或其他分子生物学技术中的连接和扩
增。
总之，引物设计原理是依据引物的长度、序列、熔解温度、GC含量和两个末端的设计来保证引物与目标DNA序列的特异性结合，从而提高实验的成功率。正确的引物设计可以大大提高实验的准确性和可靠性。
PCR引物设计原理及原则
PCR引物设计原理及原则
PCR引物设计是指在聚合酶链反应（PCR）中使用的引物的设计过程。PCR引物起到了在PCR扩增过程中特异性识别和引导DNA复制反应的作用。因此，PCR引物的设计直接影响PCR反应的成功与否。以下是PCR引物设
计的原理及原则。
一、PCR引物设计的原理
1.引物长度：引物的长度通常为18-25个碱基对。引物过短可能导致
非特异性引物结合，引物过长可能导致反应条件不佳。较长引物（20-25
个碱基对）通常用于扩增目标DNA较长的片段，而较短引物（18-20个碱
基对）通常用于扩增较短的目标DNA片段。
2.引物序列：引物的序列应与目标DNA序列互补，以确保引物与模板DNA的特异性结合。引物序列应尽量避免重复序列或序列中的碱基。此外，引物序列的催化部位（3'端）应该具有高度的特异性与模板DNA序列匹配，以确保PCR反应的特异性。
3.引物的Tm值：引物的Tm值是指反应温度下引物和目标DNA序列的
熔解温度。引物的Tm值应相似，通常在56-64℃之间，以保证引物与目
标DNA序列结合的特异性和稳定性。
4.引物的GC含量：引物的GC含量对PCR反应的效率和特异性有重要
影响。引物的GC含量应控制在40-60%之间，过高或过低的GC含量可能
导致引物结合能力不佳。
二、PCR引物设计的原则
1.引物特异性：引物应与目标DNA序列的特异区域互补，以确保特异性扩增。在设计引物时，应避免引物与非目标序列互补或有任何交叉杂交现象。
2.引物长度：引物长度通常为18-25个碱基对，过短或过长的引物可能导致PCR反应效果不佳。
前后引物原理
前后引物原理
前后引物是PCR（聚合酶链式反应）技术中的关键成分，PCR是一种在生
物体外快速扩增特定DNA片段的分子生物学技术。在PCR反应中，需要一对引物与模板DNA结合，通过DNA聚合酶的作用，以模板DNA为基准，合成与模板互补的新链，实现DNA的快速扩增。
引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与目的基因一端的一条
DNA模板链互补，另一个引物与目的基因另一端的另一条DNA模板链互补。当PCR反应开始时，引物与模板DNA的两条链结合，形成延伸的3'端，为DNA聚合酶提供了一个起始点，通过DNA聚合酶的作用，以4种
脱氧核苷酸（dATP、dCTP、dGTP和dTTP）为原料，沿模板链方向合成
新的DNA互补链。
前后引物的区别在于结合模板链的位置。前引物是相对于后引物而言的，它们分别与模板的两条链相结合。后引物是在前引物的基础上延伸出来的，其3'端与前引物的5'端相接。通过前后引物的结合，使得DNA聚合酶能够从
延伸的3'端开始合成新的DNA互补链，实现DNA的快速扩增。
在PCR反应中，引物的选择直接影响到扩增的效果。引物与模板的结合必
须具有足够的特异性，以确保扩增的准确性。同时，引物的长度、碱基组成
和浓度等也会影响PCR扩增的效果。因此，在PCR反应中，需要根据具体的实验条件和要求选择合适的引物。
总之，前后引物是PCR技术中的关键成分，它们通过与模板DNA的结合，为DNA聚合酶提供了一个起始点，实现了DNA的快速扩增。
pcr引物设计原理
pcr引物设计原理
PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，用于复制和扩增特定的DNA序列。PCR引物是在PCR反应中使
用的两个短的单链DNA分子，它们与目标DNA序列的两端
相互互补。引物的设计是PCR的关键步骤之一。
引物设计的原理考虑了目标DNA序列的多个因素，包括长度、GC含量、互补性和特异性等。以下是PCR引物设计的一般原理：
1. 引物长度：引物通常由18-30个碱基对组成，这个长度范围
有助于在PCR反应中实现高效的扩增。过短的引物可能无法
准确地与目标DNA序列的特定区域结合，而过长的引物可能
导致PCR反应较低的产物产量。
2. GC含量：为了确保引物的稳定性和特异性结合，引物的
GC含量应在40-60%之间。这是因为GC碱基对比AT碱基对
具有更高的结合能力，能够增加引物与目标DNA序列的互补性。
3. 互补性：PCR引物的两个引物应该互补，并形成稳定的引
物-模板DNA复合物。引物之间的相互互补性可以通过计算引物序列之间的互补碱基数来评估，以确保引物之间没有太多的自身互补性或与其他引物的互补性。
4. 特异性：引物设计还需要确保引物与目标DNA序列具有高
度特异性的互补性。这意味着引物与目标DNA序列的其他非
目标区域不应该有太多的互补性，以避免非特异性扩增。
引物设计可以使用基因组和引物设计软件来辅助完成。这些软件基于目标DNA序列的输入，在计算上述因素的基础上，为PCR反应提供最佳的引物设计。一旦引物设计完毕，它们可以被合成和纯化，并用于PCR扩增特定的DNA序列。
pcr技术原理 引物
pcr技术原理引物
PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种常用的分子生物学技术，可在短时间内扩增特定DNA片段，以便于后续的检测和
研究。以下是PCR技术的原理：
PCR反应由三个步骤组成：变性、退火和延伸。
第一步是变性。反应体系中的DNA模板被加热至95℃，使其
双链DNA解聚成两条单链DNA。此时，DNA的氢键被破坏，使得DNA链分离。
第二步是退火。反应体系中的温度降低至50-65℃，此时两条
单链DNA的引物（primer）与目标DNA的互补序列结合。引物是一小段单链DNA，具有能与目标DNA互补配对的序列。
第三步是延伸。反应体系中加入DNA聚合酶（DNA polymerase）和四种核苷酸（dNTPs），温度升高至72℃。DNA聚合酶通过互补配对原则，在每个引物的3'端引导下，
延伸合成新的DNA链。此时，产生的新DNA链将与原DNA
模板相同，并且延伸长度为引物的互补序列。
通过多次重复以上三个步骤，PCR反应可以迅速扩增特定的DNA片段。每个PCR循环将产生2倍的DNA，经过多个循环，DNA的数量呈指数倍增，从而得到大量特定的DNA产物。
PCR技术具有高度敏感性和高选择性，在分子生物学、医学
诊断、基因工程等领域被广泛应用。
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引物的原理
引物是短的寡核苷酸片段，充当DNA复制的起点。因为几乎所有DNA聚合酶都不能从头合成，所以它们需要一个3’-羟基作为DNA合成的起始点。这个3’-羟基由相配的引物提供。在体内，由于DNA聚合酶的忠实性，不能从头合成DNA，因此只能由RNA聚合酶（称为引物酶）生成，采用RNA引物来延伸，在延伸过程中，RNA引物降解并由DNA 取代。在体外PCR反应中所用到的DNA引物，是根据不同的要求及模板序列设计，然后用化学法人工合成的，与模板形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸；对于大多数PCR反应，决定整个反应成功与否的最重要因素是引物的序列和质量。
1. 不同实验要求的引物选择
在开始设计引物之前，必须弄清以下几点：
（1）明确PCR的目的（例如克隆、SNP检测、定量检测等）
（2）确定样品材料（基因组DNA、RNA、微小RNA）
（3）确定PCR的类型（普通的、定量PCR、RT-PCR、长片段PCR)，在查找序列的时候还需要考虑可能存在的问题（如假基因等）
2.引物设计的重要因素
有一些不同的软件工具可用于引物设计和引物分析。引物设计的软件如Oligo 6.22 ，Premier 5.0，Primer Express 3。引物分析常用Primer 5，Oligo 6.22，Primer-Blast。目前生工生物给客户提供的引物设计服务引物用的是在线软件Primer 3 plus，
引物长度和专一性
•常见的引物长度为18-30个碱基。短的引物（≤15碱基）能非常高效地结合, 但是它们的专一性不够。较长的引物能提高专一性，然而退火效率低，从而导致PCR产量低下。同时应避免编码单一序列和重复序列的引物。
平衡GC含量，避免GC-和AT-富集区域
•引物的GC含量应介于40%～60%之间。应避免聚-（dC）-或聚（dG）-区域，因为它们会降低退火反应的专一性。聚-（dA）-和聚（dT）-也应避免，因为这样会形成不稳定的引物-模板复合物，从而降低扩增效率。
3’-序列
•3’端为G-或C-核苷酸较好，因为能增加结合强度。同时它将提高PCR效率，因为引物-模板符合物的开放将达到最小。但是，超过3个G/C碱基将会具有负面效果，因为会降低反应的专一性。
避免互补的引物序列
•引物设计应避免引物自身序列的互补性超过3个碱基。因为这容易使引物形成自身发夹结构。
上下游引物之间的互补配对也应避免，尤其在作为扩增起始点和关键区域的3’端。因为这将导致强引物二聚体形成，后者将与所需要的PCR反应竞争资源，导致PCR效率降低，在极端情况下，甚至导致完全无特异性目的产物生成。
退火温度是基于引物的解链温度（Tm）------计算方法。
•最常用的解链温度计算公式如下三种：“2+4”法则，亦称华莱士法则，对于14个碱基以下引物有效，
另外，还有GC法则，适用于长于13个碱基的序列，这两种方法都相对不准确。
“盐调整”法相对准确一些，考虑到了反应缓冲液中的中的Na+离子浓度(50 mM Na+ ,pH 7.0)。
但是不管根据哪种方法计算出的解链温度，都可用于估算最佳退火温度，也都仅作为实验参
考温度。
•DNA的化学合成研究起始于上世纪50年代。
•1953年英国科学家James Watson和美国科学家Francis Crick依据伦敦国王学院的罗莎琳富兰克林所拍摄的X光绕射图及相关资料，共同提出了最早的DNA的双螺旋结构，自此以后，科学家们便开始尝试核酸的人工合成。
•1957～1965年H.G.科拉纳等人设计并合成了由一种、两种或3种脱氧核苷酸组成的重复顺序的脱氧寡核苷酸片段，并以此为模板进一步复制和转录，得到了相对应的互补顺序的人工长链(mRNA)，再用这种人工mRNA在无细胞体系中进行蛋白质合成。通过分析这样得到的多肽产物的氨基酸顺序和与模板中核苷酸顺序的对应关系破译了遗传密码。
•1958年，英国剑桥大学Todd实验室于首先合成了具有3’→5’磷酸二酯键结构的TpT和pTpT。
•自从Kary Mullis博士于1983年发明的PCR技术之后，加之1976年耐高温的Taq DNA聚合酶的发现并被分离纯化，PCR技术已成为分子生物学中被研究最多，应用最广泛的技术之一，其中引物的设计和合成是实现PCR关键的一环。
•1972年H.G Khorana 等人应用磷酸二酯法合成了相当于酵母内丙氨酸tRNA结构基因的DNA双链。
•1979年完成了包括启动和调节顺序在内的共有207个碱基对的大肠杆菌酪氨酸校正tRNA 基因。
•1981年，中国生化学家王德宝完成了酵母丙氨酸tRNA的全合成，这
是世界上第一个人工合成的具有全部生物活性的RNA分子。
•1982年，美国PE公司应用生物系统部(原美国应用生物系统公司，ABl)推出了世界上第一台全自动DNA合成仪。
•2000年9月，ABI最新推出的3900 台式高通量DNA合成仪。现在国内比较常见的高通量DNA合成仪是ABI3900，MM192和OLIGO192，前者一次可合成48条，后二者一次可以合成192条。其中以ABI公司的仪器占我国及世界市场的80～90%。生工生物现在用的是ABI3900高通量合成仪。