泥蚶血细胞耐饥饿及抗菌力特性的研究

经饥饿处理后 ,泥蚶血细胞随着时间的迁移 ,出现细胞形态不规则 、胞质色泽变浅 、胞质颗粒物减少 、胞
膜边缘光滑度减小等现象 。血细胞对大肠杆菌 、奥斯陆莫拉氏菌 、脲放线杆菌均具较高的噬菌率 ,噬菌
实验过程中血细胞形态结构以及细胞组分不断产生变化 。细胞抗菌活性检测结果表明 :血细胞对三者
都具有一定的抗菌活性 ,活性依次为 :大肠杆菌 >奥斯陆莫拉氏菌 >脲放线杆菌 。
根据着色性质和颗粒大小不同 ,胞质中的颗粒 物质可分为 3类 :小颗粒 、中颗粒 、大颗粒 。目前认 为存在 2种不同的噬菌机制 : ( 1)血细胞在吞噬反 应中释放溶酶体酶类物质 。Coles等采用电镜细胞 化学法将贻贝血细胞中的溶酶体酶类物质 ———酸 性磷酸酶定位于大颗粒物质中 [ 11 ] 。 ( 2 )血细胞由 呼吸作用释放有解毒功能的高活性氧化代谢产物 。 张峰等对贝类血细胞活性氧体内防御作用研究结 果表明 :当血细胞接触外来异物后 ,活性氧成分伴 随吞噬作用产生 ,这些活性氧成分可直接对外来生 物起到杀伤作用 [ 13 ] 。Coles等采用电镜细胞化学法 将贻贝血细胞中的过氧化物酶定位于小颗粒物质 中 [ 11 ] 。 Pipe等采用免疫细胞化学法显示贻贝血细 胞中过氧化氢酶和超氧化物歧化酶 ,分别定位于小 颗粒物质和大颗粒物质中 [ 12 ] 。贝类血细胞胞质中 的小颗粒很可能为过氧化物酶体 ,并栉孔扇贝血细 胞酶电镜细胞化学研究 [ 14215 ]也支持这一结论 。泥 蚶血细胞胞质中的小颗粒物质参与细胞吞噬过程 , 并且发挥了重要作用 ;大颗粒物质基本上无吞噬作 用 。初步认为泥蚶血细胞小颗粒物质的噬菌作用 与其作为过氧化物酶体是密切相关的 。过氧化物 酶体是生物氧化的重要场所 ,能消除细胞内的氧 , 将有毒物质转变成无毒物质 ,并产生细胞所需要的 某些代谢物 。血细胞抗菌活性大小因菌种而异 ,是 与菌体表面所含有或释放的物质参与或辅助血细 胞对异物的识别 、黏附 、摄入 、降解 、破坏 、清除过程 有关 。而贝类血细胞噬菌 、抗菌作用的具体生化机 理以及与颗粒物质的关联还有待进一步深入研究 。
大肠杆菌 、奥斯陆莫拉氏菌 、脲放线杆菌用液 体培养基于 37 ℃培养 24 h。分别取 3种菌体培养 液 10 m l,以 8000 r/m in离心 15 m in,弃上清液 ,以 0. 1 mol, pH 6. 4的无菌磷酸钾缓冲液作为底物 ,将 3种菌配成一定浓度 (OD570 nm≈ 0. 1) 。
2. 2 抗菌活性检测结果 血细胞对大肠杆菌 、奥斯陆莫拉氏菌 、脲放线
杆菌均有较高的抗菌活性 ,其检测结果见表 1。由 表 1可见 :泥蚶血细胞对 3类细菌的抗菌活性大小 依次为 :大肠杆菌 (U平均 : 0. 2881 ) >奥斯陆莫拉氏 菌 (U平均 : 0. 2157) >脲放线杆菌 (U平均 : 0. 1143) 。
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水 产 科 学
第 26卷
的趋向性 (图 325, 6) 。
图 2 血细胞噬菌实验对照 噬菌实验对照组 : 1. 奥斯陆莫拉氏菌 : 2. 脲放线杆菌 : 3. 大肠 杆菌 : a. 吞噬初期 : b. 吞噬晚期
图 3 大肠杆菌的血细胞噬菌实验过程
3 讨论
根据常规贝类血细胞分类法 ,血细胞分为颗粒 细胞和透明细胞 [ 1 ] 。细胞吉姆萨染色结果表明 :泥 蚶血细胞多为颗粒细胞 ,透明细胞较少 ,初步认为 与血细胞具有较强的耐饥能力密切相关 。目前 ,贝 类血细胞的研究结果表明 :过氧化氢酶 、超氧化物 歧化酶和酸性磷酸酶等酶类物质大多位于颗粒细 胞内的颗粒物质中 [ 11212 ] 。过氧化物酶体自身能产 生细胞新陈代谢所需的物质 ,饥饿状态下它可作为 物质来源 ,维持细胞新陈代谢 。由此推断 ,泥蚶血 细胞耐饥能力由颗粒物质成分引起 。
用 pH 7. 0, 0. 1 mol/L 无菌 PB S反复冲洗并稀 释血细胞至 1. 0 ×107个 /m l。各菌液与细胞悬液以 5∶1混合 ,对照组用无菌磷酸钾缓冲液代替菌液 ,每 隔 2～3 m in观察细胞噬菌现象 。
按文献 [ 3 ] ,取 5 m l该菌液于试管 ,置于冰浴 中 ,再加入 100μl血细胞悬液 ,混匀 ,用 Cary100型 分光光度计检测试液在 570 nm 波长处的光密度 ( A0 )值 。然 后 将 试 液 移 入 37 ℃水 浴 , 恒 温 30 m in,取出后立即置于冰浴内 10 m in,以终止反应 , 测其经水浴后的试液在 570 nm 波长处的光密度 ( A )值 。抗菌活力 Ua按下述公式计算 :
收稿日期 : 2006 - 01 - 19;修回日期 : 2006 - 05 - 18. 基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30371095). 作者简介 :潘沙芳 (1981 - ) ,女 ,在读研究生 , 研究方向 :海洋生物学 ; . E - mail: panshafang@163. com. 通讯作者 :李太武 ( 1955 - ) ,
和大肠杆菌 (图 221a, 1b) 。 以大肠杆菌为例 ,每隔 2～3 m in对血细胞不同
噬菌阶段进行显微观察 (见图 3 ) ,研究发现 ,对照 组细胞形状规则且明显 ,细胞核多居中 ,细胞质色 泽较深 ,胞质中小颗粒物质丰富 ,黑色大颗粒物质 较少 (图 321) ;细胞吞噬初期 ,细胞形态结构 、组分 与对照组十分接近 (图 322) ;随着细菌降解 ,细胞变 小 ,胞质中的小颗粒物质逐渐减少 ,部分细胞出现 颗粒物质外渗现象 (图 323, 4) ;细胞吞噬晚期 ,细胞 质内的小颗粒物质减少到一定程度 ,胞质中的大颗 粒物质在细胞核周围呈现聚集现象 ,大颗粒物质减 少趋势者较少 ,并且细胞核出现向细胞膜边缘移动
细胞形状完全不规则 ,细胞核的位置凌乱 ,有的位
表 1 泥蚶血细胞抗菌活力测定结果
组别
大肠杆菌
1
2
3
奥斯陆莫拉氏菌
1
2
3
脲放线杆菌
1
2
3
抗 A o 0. 9244 0. 9377 0. 9250 0. 5608 0. 6023 0. 6385 0. 5619 0. 5663 0. 5832
菌 活A
0. 8479 0. 8620 0. 9963 0. 5376 0. 5898 0. 5940 0. 5564 0. 5609 0. 5711
力 U a 0. 3004 0. 2963 0. 2675 0. 2277 0. 1456 0. 2737 0. 0994 0. 0981 0. 1455
2. 3 噬菌作用观察结果 血细胞首先识别附着其表面的外来异物 ———
男 ,教授 ,博士生导师 , 研究方向 :海洋生物学 ; E - mail: litaiwu@ nbu. edu. cn.
第 1期
潘沙芳等 : 泥蚶血细胞耐饥饿及抗菌力特性的研究
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Ua =
Ao - A A
于细胞中间 ,有的位于细胞一侧 ,细胞颗粒呈透明 状 ,细胞膜边缘呈锯齿状 (图 126) 。
1 材料与方法
1. 1 材料 泥蚶采自浙江乐清养殖场 ,均为 2 龄 ,养于室
内充气水箱内 ,水温为 18～24 ℃。 1. 2 方法 1. 2. 1 Giem sa染色
对照组泥蚶隔天用微藻投喂试验组泥蚶用过 滤灭菌海水饥饿处理 ,隔天换水 、取样观察 。经饥 饿处理后 ,泥蚶血窦取血 ,血细胞涂片并加热烤干 , 用固定液 —甲醇 ∶冰醋酸 ( 3 ∶1)固定后 , pH 7. 6 的 Giem sa液常规染色 30 m in,冲洗 、干燥后 , O lympus BX - 60显微镜下观察并拍照 。 1. 2. 2 抗菌活性检测及噬菌现象观察
关键词 : 泥蚶 ; 血细胞 ; 噬菌作用
中图分类号 : S968. 314
文献标识码 : A
文章编号 : 100321111 (2007) 0120022204
贝类血细胞作为体内免疫防御系统之一 ,具有 吞噬 、包囊 、损伤修复等功能 [ 122 ] 。其中吞噬作用是 一种基本和原始的防御机制 ,主要包括 : 异物的识 别 、黏附 、摄入 、降解 、破坏 、清除 6 个阶段 [ 3 ] 。目 前 ,关于贝类血细胞分类 、噬菌作用 、亚显微结构 、 细 胞 生 化 等 已 有 报 道 。 Cheng 等 将 硬 壳 蛤 (M ercena ria m ercena ria) 的血细胞分为透明细胞 、 颗粒细胞 、和成纤维细胞三类 ,并发现当蛤在受细 菌刺激时 ,会使活跃吞噬的血细胞将溶酶体释放到 血清中 [ 425 ] 。孙虎山等将栉孔扇贝 ( Cham ys fa rreri) 血细胞分为 6类 ,对革兰氏阴性和阳性细菌均有吞 噬能力 [ 3, 627 ] 。Moore等对帘蛤血细胞的吞噬作用进 行了研究 ,结果显示 :帘蛤血细胞不仅对革兰氏阴 性和阳 性 细 菌 有 吞 噬 作 用 , 而 且 可 吞 噬 酵 母 细 胞 。 [ 8210 ]
有关泥蚶 ( Teg illa rca g ranosa L innaeus) 血 细 胞的显微结构 、耐饥能力和抗菌作用方面的研究 , 国内外均未见报道 。笔者通过吉姆萨染色显微观 察泥蚶血细胞噬菌作用以及不同饥饿状态下其形 态结构的变化 ,以期了解血细胞吞噬过程和机制以 及饥饿条件对血细胞形态结构的影响作用 ,为细胞 生物学和贝类免疫学研究提供基础 。
当贝类动物受到外界抗原物质刺激时 ,血细胞 主要表现为吞噬反应 ———能够清除细菌 、病原体 、 大分子物质及无机颗粒等 。本试验观察到泥蚶颗 粒细胞具有较强的吞噬能力 ,与孙虎山 [ 627 ]等人的
观点一致 。Oubella等观察到细菌可使蛤血淋巴中 颗粒细胞的数量显著增加 ,为贝类颗粒细胞具有较 强吞噬能力提供了证据 。由此可见 ,泥蚶血细胞吞 噬作用主要由颗粒细胞完成 。
细菌 ,然后细胞伸出伪足将细菌包围 ,形成吞噬泡 进入血细胞内部 。接着 ,血细胞通过不同的噬菌机 制 ,逐渐使细菌降解或破裂 (见图 2 ) 。由图 2 可 见 :一个血细胞可吞噬多个细菌 。吞噬作用后 ,血 细胞和菌体混合液中的细菌数量显著减少 ,细胞的 结构形态也发生较大变化 ,胞质色泽变浅 ,细胞呈 透明状 。由各种细菌噬菌现象的前后对照图可知 , 泥蚶血细 胞对大 肠杆 菌的 吞噬 率较 大 (图 223a, 3b) 。奥斯陆莫拉氏菌对血细胞的形态影响程度最 大 (图 221a, 1b) ,其次是脲放线杆菌 (图 222a, 2b)
图 1 血细胞吉姆萨染色显微结构 1. 从滩涂取后第 2 d泥蚶的血细胞 ; 2. 第 4 d泥蚶的血细胞 ; 3. 第 6 d泥蚶的血细胞 ; 4. 第 8 d泥蚶的血细胞 ; 5. 第 10 d泥蚶的 血细胞 ; 6. 第 12 d泥蚶的血细胞
(图 122) ;第 6 d、第 8 d,细胞形状开始不规则 ,细胞 核染色结构不明显 ,胞质颜色变浅 ,小颗粒物质大 量减少 ,大颗粒物质呈现围核聚集状态 ,部分细胞 有颗粒物质外渗现象 ;第 8 d时 ,大颗粒物质出现了 颗粒合并现象 (图 123, 4) ;第 10 d细胞中的黑色大 颗粒物质几乎完全消失 ,细胞胞质内小颗粒物质突 然增多 ,细胞间聚堆现象频繁 (图 125 ) ;第 12 d血

2 结果
2. 1 显微观察结果 对不同饥饿状态的泥蚶血细胞进行吉姆萨染
色处理后 ,显微观察 。正常泥蚶血细胞分颗粒细胞
和透明细胞 ,颗粒细胞多单核细胞 ,形状规则 ,呈椭
圆形 ;细胞核明显 ,染色后呈现血红色 ;细胞质色泽
较深 ,颗粒物质丰富 ,大颗粒物质少 ,小颗粒物质相
对较多 ,呈分散状分布 ;细胞膜界限清晰 ,膜光滑呈 弧状 (图 121) 。饥饿处理时间长短不同 ,颗粒细胞 出现不同程度的变化 。饥饿处理第 4 d,首先出现 胞质逐渐减少 ,颗粒物质出现向细胞核聚集趋势
第 26卷第 1期 2007年 1月
水产科学
F ISHER IES SC IENCE
Vol. 26 No. 1 Jan. 2007
泥蚶血细胞耐饥饿及抗菌力特性的研究
潘沙芳 , 李太武 , 苏秀榕
(宁波大学 生命科学与生物工程学院 , 浙江 宁波 315211)
摘 要 : 显微镜下观察泥蚶血细胞抗菌能力以及在不同饥饿条件下细胞形态结构的变化 。结果表明 :