第2章 基因操作的主要方法和工具-1

什么是C 值？
通常是指一种生物单倍体基因组DNA的 总量.
在真核生物中，C值一般随着生物的进化而 增加，高等生物C值一般大于低等生物。 C值悖理（C-value paradox)： 生物的复杂性与基因组的大小并不完全成比 例增加
阴影部分为一个门内C-值的范围
动物
真菌 等 细菌
1.2 生命三界
标记物
同位素
非同位素标记技术有生物素、地高辛、碱
性磷酸酶、辣根过氧化酶和荧光素 ——直
接标记、间接标记
探针标记方法
末端标记法：将标记物导入核算分子的5’端或3’
端，适用于合成寡核苷酸探针的标记。末端标记， 标记强度低。
பைடு நூலகம்
切口平移法：Dnase I产生切口－DNA 聚合酶I加入 标记物。标记强度高。
③可移动元件的转座和逆转座。
④外源基因水平转移。 原核生物中DNA的水平转移是一种十分普遍的现象，可通
过接合转移、噬菌体转染、外源DNA的摄取等不同途径发生。
大多数有关动物种间基因转移主要集中在逆转录病毒及其转 座成分。
⑤基因裂变(fission)和融合(fusion)，由一个基因分裂成两个
涌动率决定因素：分子大小，空间构型，电荷数。 涌动方向
PAGE
OC：open－coiled L：line SC：supercoiled
（5） 核酸样品的保存
DNA： DNA样品溶于pH8.0的TE，4 ℃或-20 ℃保存； 长期保存样品中可加入1滴氯仿。 RNA： RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸灭菌 水中，-70 ℃保存;
转座子的发现
1951年，B. McClintock发现玉米中的Ac-Ds系统。
转座子可以分为两大类： DNA-DNA方式转座的转座子： 反转录转座子(retrotransposon)：在结构和复制上与反转录病 毒类似，只是没有病毒感染必须的env基因，它通过转录合成 mRNA，再逆转录合成新的元件整合到基因组中完成转座。
近年来完成的原核生物和真
核生物的基因组测序揭示， 在一些最基本的生命特征方 面，地球上所有生物可分为 三大类群，即真细菌 (bacteria)，古细菌或古生 菌(archaea)和真核生物
(eukarya)三界(domain)。
1.3 基因组进化的分子基础
1. 突变 系指基因组中小段区域内核苷酸序列的改变。大多数突变是点突变，即核苷 酸序列中某一碱基取代了另一碱基，其他的突变则涉及一个或几个核苷酸的 插入或缺失。 2. 重组 系指染色体或DNA分子之间的交换与重组,涉及染色体区段或DNA序列之间的 新的连锁关系。 3. 转座 转座是基因组进化的一种重要方式，出现在几乎所有生物类型中。其结果是 一段DNA或其拷贝从基因组的一个位置转移到另一位置,并在插入位点两侧产 生一对很短的正向重复序列。
树的进化年代。
2. 核酸操作
2.1 核酸的分离和检测
DNA, RNA——提取、分离与纯化——重要的
第一步
(1) 核酸的分离、提取通则
核酸在细胞中通常与各种蛋白质结合在一起。
分离原则：保证核酸分子一级结构的完整性；排 除其他分子污染。 核酸提取一般包括破碎细胞、酶处理、核酸释放 及与其他细胞组分分离、核酸纯化等几个主要步
①核酸的膜杂交
原理：核酸变性和复性 杂交在膜上进行——核酸印迹杂交 分类：DNA印迹杂交（Southern blot ） RNA印迹杂交（Northern blot ）
核酸杂交的基本过程
• 制备样品 • 待检测组织样品：动、植物器官、组织，培养细
胞，细菌，病毒等
• 核酸：分离提取DNA（RNA）
骤。
(1.1) 破碎细胞
机械作用：低渗、超声、微波、冻融裂解和颗粒破碎等。不适于高分子量长
链核酸的分离。 化学作用：一定p H 和变性条件下，细胞破裂，蛋白变性沉淀，核酸→水相。 变性条件：加热、表面活性剂(SDS、Triton X-100 、Tween 20 、NP-40 等) 、 强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍等) 。p H 环境：强碱(NaOH) 或缓冲液 ( TE、 STE 等)。 金属离子螯合剂( EDTA 等) 螯合Mg2+ 、Ca2+，抑制核酸酶活性。 酶作用：溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或链酶蛋白酶)破裂细胞。降 解与核酸结合的蛋白质，促进核酸的分离。 联合使用：细胞、待分离核酸类型及后续实验目。
1.4 新基因产生的主要方式：
①基因加倍之后的趋异，这类基因基本保持原有的基因 功能,但往往获得了新的表达模式,这是新基因产生的主 要方式。酵母基因组在1亿年前经历了一次完全的加倍
②外显子或结构域洗牌（domain shuffling or exon shuffling):功能域或外显子洗牌由不同基因中编码不同结构域 的片段彼此连接形成的全新编码序列。它们有一个全新的结构 组合，可为细胞提供完全不同的生物学功能。 不同的结构域加倍或重组,产生具有创新功能的基因.真核生物 约19％的基因产生于外显子洗牌。
MagNA Pure LC 2.0
(2) 核酸定量
ug（10-6）、ng（10－9）、pg（10－12）
紫外吸收法中DNA或RNA的定量
A260=1.0相当于: 50μg/ml双链DNA
40μg/ml单链DNA（或RNA）
20μg/ml寡核苷酸
分光光度计
Biophotometer
Thermo Scientific NanoDrop 2000c (March 2, 2009)
不同的基因，或两个或多个基因融合组成一个新的基因，原核 生物约0．5％的基因由此产生。 ⑥非编码序列转变为编码序列。 ⋯⋯
基因之间的同源性： 直系同源（ortholog）：不同物种，同一祖先，功能相同。 旁系同源（paralog）：同一物种，复制产生，功能可能 不同。
1.5 分子钟
单位时间内同源蛋白质氨基酸顺序或DNA核苷酸序列发生 改变的比率称为分子钟，通常以百万年发生单个代换为计 算单位，可用于估算祖先序列演化的时间，确立系统发生
（3）核酸质量鉴定
A260/A280
DNA纯品: A260/A280 = 1.8， >1.8 RNA污染，<1.8蛋白污染
RNA纯品: A260/A280 = 2.0
电泳
28s 18s
5s
（4） 核酸的凝胶电泳
当前核酸研究中最常用的方法，常用于检测核酸
的分子量、纯度、结构变化、序列分析等 种类： 琼脂糖凝胶电泳（水平电泳） 聚丙烯酰胺凝胶电泳（垂直电泳， 分辨率可达1bp 常用于测序）
探针的制备－核酸标记
基因组DNA探针：应用最广
cDNA探针：不含内含子序列
cRNA探针：以cDNA为模板，体外转录获得，单链 探针，cRNA－RNA杂交体稳定；RNase敏感 人工合成寡核苷酸探针 ：DNA合成仪合成，不需要 纯化，组织穿透性极好；长短控制，过长——错配， 过短——特异性差 探针长度：＜500碱基
(1.2) 酶处理
裂解液中加入蛋白酶（蛋白酶K 或链酶蛋白酶） ， 降解蛋白质；灭活核酸酶（DNase 和RNase） 加入DNase 和RNase 去除不需要的核酸。
(1.3) 核酸的分离与纯化
高电荷磷酸骨架比蛋白质、多糖、脂肪等其他生 物大分子物质更具亲水性。 根据理化性质差异，选择性沉淀、层析、密度梯 度离心等方法。
核酸杂交
主要杂交模式： Southern Blot —— DNA 膜杂交 Northern Blot —— RNA Western Blot —— Protein 组织切片杂交 In situ Hybridization —— DNA/RNA Immunohistochemistry —— Protein
①酚提取/ 沉淀法
经典方法是酚:氯仿抽提法。
裂解细胞；等体积酚:氯仿:异戊醇(25 :24 :1 体积) 混合液抽提；离心分离；疏水性的蛋白质→有机相， 核酸→上层水相。
缓冲液饱和酚——蛋白变性；氯仿增加有机相比重， 防止酚流入水相；异戊醇可减少操作过程中产生的 气泡，下层的界面更清晰 。
核酸盐经有机溶剂沉淀浓缩
含核酸的水相在pH5. 0～5. 5，终浓度0. 2～0.3M NaAc 或KAc （钠离子中和核酸磷酸骨架负电荷， 在酸性环境中促进核酸疏水复性），加2～2. 5 倍 体积乙醇或异丙醇，沉淀核酸。
DNA沉淀用乙醇洗涤，再用水或TE缓冲液溶解。
进一步纯化——氯化铯梯度密度离心、透析、凝 胶排阻层析
引物延伸标记法：模板——核酸分子变性，与引物退火，聚合
酶催化延伸反应。用标记的NTP作为底物。所有的核酸序列都
有标记，标记强度高。
2. 2 核酸的序列测定
加减法（略） 化学降解法测序 链终止法测序 自动化测序 非常规DNA测序
第2章 基因操作的主要方 法和工具－1
1. 分子生物学基本知识
1.1基因组（genome）： 生物所具有的携带遗传信息的遗传物 质的总和,是指生物细胞中所有的DNA，包括所 有的基因和基因间区域。
人的核基因组：30亿bp（最新资料说28.5亿） 2∼2.5万个蛋白编码基因
真核生物基因组： 核基因组 线粒体基因组 叶绿体基因组 原核生物基因组： 染色体 质粒 病毒基因组：病毒颗粒携带的遗传物质
C. 杂
交
D. 漂洗、检测
Southern Blot：检测DNA，基因的有无 ——遗传病、感染性疾病等 镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 MstⅡ酶切位点(GCTNAGG)
5´ 1.15kb 3´
正常基因
×
5´ 1.35kb 3´
突变基因
镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析
﹣
1.35kb
两端具有反向重复序列
转座后靶位点形成正向重
复
转座子转移
已知的转座因子的转座途径有两种： 复制转座和非复制转座。 复制转座：转座因子在转座期间先复制一份拷贝，而后拷 贝转座到新的位置，在原先的位置上仍然保留原来的转座 因子。 非复制转座：转座因子直接从原来位置上转座插入新的位 置，并留在插入位置上，结果是在原来的位置上丢失了转 座因子，而在插入位置上增加了转座因子。
Genome Size (Mb)
Zea mays （玉米） 8,000 Homo sapiens 3,000 Oryza sativa（稻） 400 Drosophila melanogaster 165 Arabidopsis thaliana（拟南芥） 100 Saccharomyces cerevisiae 12 E.coli 4.6
1.15kb
电 泳 方 向
0.2kb
正常人 突变携带着 患者
+
Northern Blot：检测RNA，基因的表达水平
斑点杂交——耗时短
菌落原位杂交筛 选目地基因
②原位杂交
应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针 与组织、细胞中待检测的核酸进行杂交，再用 与标记物相应的检测系统，通过放射自显影、 组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸 原位形成带颜色的杂交信号，在显微镜或电子 显微镜下进行细胞内定位的技术。
长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中;
在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核 苷复合物)冻贮于-70℃,可保存数年。
(6) 核酸的检测
PCR：常规PCR、RT-PCR、荧光定量PCR 杂交：膜杂交（Southern Blot、Northen Blot）、组 织样品原位杂交
• 酶切：限制性内切酶消化DNA
•
电泳：凝胶电泳分离酶切DNA混合物
DNA变性：获得单链DNA 转膜 ：将核酸样品转移到支持膜上(硝酸纤维 素膜、 尼龙膜)
探针（probe）: 互补于靶基因顺序的单 链DNA或RNA片段，通常带有标记物如：放射 性同位素、荧光化合物或半抗原地高辛等，以 检测目的基因。
②层析法
利用待分离核酸与其他组分的物质与理化性质差 异建立的分离分析方法。
包括吸附层析、亲和层析、离子交换层析等。
商品试剂盒，分离和纯化同步进行。
核酸质量好、产量高、成本低、快速、简便、节 省人力以及易于实现自动化。
亲和层析法分离mRNA
全自动核酸分离纯化系统
Roche MagNA Pure 96