亚慢性毒性试验
亚慢性和慢性毒理实验
❖ 当外源化学物在亚急性、亚慢性毒性试验中有严 重的毒作用时，此受试物就应考虑放弃，只有在 必要时才进行慢性毒性试验。
❖ Parkinson等(1995)报告117种药品狗亚慢性(90d) 和慢性(24月)毒性试验结果与大鼠(短期或长期毒 性试验)的结果比较，几乎没有发现新的毒性资料。 因此，Parkinson等认为，动物毒性试验长于6个 月没有必要，除非是研究致癌作用。
❖ Weil等(1969)报告，112种受试物中，大鼠染毒90d 后才出现毒性效应的只有3种(占2.5％)，其他受试 物均在90d内已出现毒性效应，故认为大鼠90d毒 性试验即可确定受试物的未观察到有害作用水平 (NOAEL)。
❖ 尽管还有争论，亚慢性毒性试验(90d亚慢性试验) 已成为比较常用的重复染毒毒性试验；从科学上 和经济上考虑，慢性毒性试验就倾向于和致癌试 验合并进行。
5 观察指标（一般指标、实验室检查、大体解剖）
❖ (1) 一般性指标 ❖ 在实验过程中，仔细观察动物的外观(体表通道和
毛色等)，社会行为(躁动、冷漠、探究活动)，刺 激性(好斗等)及对周围环境、食物、水的兴趣， 这些信息单独一项无太多意义，但结合起来就有 可能揭示出未观察到毒性症状前的潜在毒性效应。
❖ 为保证受试物在动物体内浓度的稳定，每天应在 相同的时间及实验室条件下染毒。每周至少染毒 6～7d。
动物慢性中毒和亚慢性中毒
三、诊断
1.毒物接触史 2.临床表现 3.实验室检查
临床表现（慢性中毒）
多见于职业病、地方病 （一）神经系统 1. 痴呆--CO 2.震颤麻痹综合症--CO 3.周围神经病变—金属铅、砷、有机磷 （二）消化系统—中毒性肝病 （三）泌尿系统—中毒性肾病 （四）血液系统—苯 （五）骨骼系统—氟骨症
实验室检查
蓄积作用
1.蓄积作用(accumulation)： 当外源化学物连续地、反复地进入机体，而且吸收速度（或总量）超 过代谢转化和排泄的速度（或总量）时，化学毒物或其代谢物在机体内逐 渐增加并贮留，这种现象为化学毒物的蓄积作用。 蓄积作用是发生亚慢性、慢性毒作用的前提 2.储存库（depot）： 化学毒物容易蓄积的组织和器官称为储存库。机体常见的储存库有血 浆蛋白、脂肪组织、肝脏、肾脏、骨骼等。 如骨骼为铅的储存库。 蓄积形式: 原形 代谢产物 结合形式 功能蓄积
3
3.蓄积的分类： 物质蓄积
3.1 物质蓄积（material accumulation）： 化学毒物反复多次染毒实验动物后，用化学分析方 法能测得机体内或某些器官组织内存在该化合物的原型 或其代谢产物。 3.2 功能蓄积（functional accumulation）： 化学毒物反复多次染毒实验动物后，机体内虽不能检 出化学毒物，然而机体可以出现慢性中毒现象。 注：功能蓄积是损害效应累计的结果。也可能是由 于存留的化学毒物或代谢物数量极微，目前技术方法尚 不能检出的一种物质蓄积，或者物质蓄积与功能蓄积兼 而有之
亚慢性经口毒性实验设计全
硫酸铜亚慢性经口毒性实验设计
一、实验目的
通过该实验不仅可获得一定时期内反复接触受试物后引起的健康效应、受试物作用靶器官和受试物体内蓄积能力资料，并可估计接触的无有害作用水平，后者可用于选择和确定慢性实验的接触水平和初步计算人群接触的安全性水平。
二、实验原理
1.亚慢性毒性实验：是指在实验动物部分生存期内，每日反复经口接触受试物后所引起的不良反应。
2.无有害作用水平（No-adverse-effect level）：是指在实验中不引起任何有害作用的最大染毒剂量，可用每日单位动物体重接触受试物的重量(mg/kg)表示。
三、实验仪器及试剂
实验试剂：3%-5%苦味酸、0.5%酸性品红、蒸馏水、无水硫酸铜、水、动物饲料
实验动物：健康、6-8周大鼠（80只）
实验仪器：灌胃针（16号）、电子天平、动物体重秤、饲养室、烧杯、容量瓶、吸量管、吸耳球、胶头滴管、手术剪、托盘、镊子、药匙等
四、实验步骤
1. 实验动物的选择：选择80只6-8周，体重在50-100g的健康大鼠，大鼠体重相差不超过10%（±5-10g）。
2. 实验管理：实验前动物先适应环境和饲料5天。适应期间和实验期间雌雄分笼饲养，所有动物通过灌胃的方式进行染毒，每周染毒7天，连续染毒90天。
3. 实验条件：饲养室温度控制在22±4℃，相对湿度在40%-70%之间，无对流风，昼夜各半。实验期间正常饲料喂养，饮水不限。
4. 实验动物染色和分组
1）抓取大鼠：抓取大鼠前最好戴上防护手套。进行染色时，可采取左手固定法，只是用拇指和食指捏住鼠耳，余下三指紧捏大鼠背部皮肤，这样便可进行各种简单的实验操作；也可以用左手食指和中指放在颈背部的两侧，拇指和无名指放在胸前，分别用手指夹住左右前肢抓起来。
药理毒理学实验
药理毒理学实验
药理毒理学实验是指研究药物对机体生理和病理过程的影响以及药物的毒性和安全性的实验研究。这些实验常用于药物的开发、评价和监管。
药理学实验常包括以下方面的研究：
1. 药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄过程；
2. 药物对生理系统和器官的作用机制和效应；
3. 药物对生理参数（如血压、心率、血糖等）的影响；
4. 药物的药效学研究，如测定最小有效剂量、最大耐受剂量等。
毒理学实验主要研究药物对机体引起的毒性反应，包括急性毒性、慢性毒性和亚慢性毒性等。常用的毒理学实验包括：
1. 急性毒性实验：用于确定药物对动物的一次性剂量引起的毒性反应；
2. 慢性毒性实验：用于评估长期接触药物对动物的毒性效应；
3. 亚慢性毒性实验：用于评估中长期接触药物对动物的毒性效应；
4. 各种毒性指标的测定，如致死剂量、半数致死剂量、致畸性、致癌性等。
药理毒理学实验通常在动物模型中进行，常用的动物包括小鼠、大鼠、猴等。实验设计需要符合伦理规范，并进行必要的安全措施，以确保实验过程安全且可靠。
值得注意的是，药理毒理学实验虽然可以提供药物效果和毒性的初步评估信息，但实验结果在转化到人类临床应用方面仍需要进行更进一步的研究和验证。
亚慢性毒性试验
亚慢性毒性试验
2.3.9.1 目的
（1)检测消毒剂较长期染毒对实验动物的毒性作用及其靶器官，并确定其最大未观察到有害作用剂量。
（2)为慢性毒性和致癌试验的剂量设计提供依据。
2.3.9.2 实验动物
一般用啮齿类动物，首选大鼠。所用大鼠应为 4周～6 周龄者。全部试验至少需用 80 只动物。
2.3.9.3 试验分组
将实验动物随机分为4组(3个剂量组和1个对照组)，每组20只动物，雌雄各半。选择受试物剂量时，高剂量组应出现明显的毒性反应，但不引起死亡，如果出现动物死亡应不超过 10%；中间剂量组应可观察到轻微的毒性效应；低剂量组应不引起任何毒性效应(属未观察到有害作用剂量)。至于具体的剂量选择，可考虑高剂量为LD50的1/20~1/5，高、中、低3个剂量间的组距以3倍~5倍为宜，最低不小于2倍。另以受试物溶剂代替受试物进行试验，作为阴性对照组。
2.3.9.4 操作程序
（1）采用灌胃方式或将受试物掺入饲料经口染毒。
（2）灌胃法每天灌胃1次，每周称体重，并按体重调整受试物给予量。如受试物掺入饲料时，应定期称饲料消耗量，计算消毒剂摄入量。
（3）试验期为3个月(90d)，末次染毒后24h检测各项观察指标，然后处死实验动物，做病理学检查。
2.3.9.5 观察指标
观察指标，可因消毒剂毒理作用不同而异，一般至少包含以下方面。
（1）临床观察：观察动物中毒表现，每周称量体重1次，食物消耗量至少1次~2次。
（2)血液学检查：包括血红蛋白含量、红细胞数、白细胞及其分类计数、血小板数、网织红细胞数等。
（3)血液生物化学检查：例如天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、尿素氮、肌酐、血清总蛋白和白蛋白、总胆固醇、总胆红素等。必要时，可根据所观察到的受试物毒性效应，或与受试物化学结构相似物质的毒性作用，选择其他一些生化指标。
急性毒性、蓄积毒性、亚慢性毒性、亚急性毒性、慢性毒性资料区分
易混知识
毒性概念区分 慢性毒性试验(此项书写临床资料注意同亚慢性毒性区分)
评价方式： 1.观察指标的选择，应以亚慢性毒性试验的观察指标为基础。其中包括体重、食物 摄 取、临床症状、行为、血象和血液化学、尿的性状及生化成分以及重点观察在亚 慢性毒性试验中已经显现的阳性指标。 2.应重视病理组织学的检查(原则必做)。凡试验期间死亡的动物，都应做病理组织 学检查。 3.根据急性阀剂量和亚慢性阀剂量计算受试动物亚慢性毒作用带，并参考慢性作用 危险性对受试动物的中毒危险性进行评估。（可参考《化学物危险性分级标准》）
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易混知识
兽药易混知识点 2.毒性概念区分 (临床资料22号-26号)
毒性：指外源化学物质在一定剂量、一定接触时间和一定接触方式下，对 动物机体产生的总体毒效应的能力，又称作一般毒性作用。 毒性分类 1.一般毒性根据外源化学物质剂量大小和时间长短分为：急性毒性、蓄积 毒性、亚慢性毒性、亚急性毒性、慢性毒性等。 442公告中中兽药要求的23号资料要求长期毒性试验（化药为亚慢性毒 性），长期毒性即包括：亚慢性毒性和慢性毒性试验！ 2.相对特殊毒性根据观察目标不同可分为：遗传毒性、生殖发育毒性、致 癌性、免疫毒性、神经毒性和神经行为毒性等。
急性毒性、蓄积毒性、亚慢性毒 性、亚急性毒性、慢性毒性资料 区分
(个人分享)
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易混知识
（为了规范临床药理毒理资料书写）
亚慢性、慢性毒性及其评价方法
Ⅲ 生物半减期法 ➢ 生物半减期法是用毒物动力学原理阐明 外源化学物在机体内的蓄积作用特征。
四、局部毒作用
• • • • • • • 1.皮肤原发性刺激试验 2.皮肤致敏反应试验 3.光致敏反应 4.光刺激试验 5.眼刺激试验 6.其他粘膜刺激试验 7.替代（体外）试验
一是以急性毒性的LD50 剂量为出发点， 即
以LD 50 的1/10、1/100和1/1000为染毒剂量
各染毒剂量组之间的剂量间距应当大些，有
利于求出剂量-反应关系，也有助于排除实 验动物个体敏感性差异。 组间剂量差一般以 2-5倍为宜，最低不小于两倍
4. 观察指标
观察指标的选择，应以亚慢性毒性试验的
亚慢性试验分组和剂量设计 • 阴性对照组 • 低剂量组 • 中剂量组 • 高剂量组 急性毒性阈剂量 （1/20~1/5） LD50 • 组距：3~10倍，最低不小于2倍
4、观察指标
一般性指标 1）外观体征、行为活动： 2）动物体重：体重变化的表示方式，可 将接触组与对照组同期体重绝对增长的重 量或体重百分增长率(以接触化学物开始时 动物体重为100%)进行统计和比较
• 在卫生毒理学实际工作中，蓄积作用试验多用小 鼠或大鼠为实验动物，一般以死亡为指标，其K 值计算公式如下： K= LD 50 (n）/LD 50 (1) LD 50 (n)表示引起一半动物死亡的累积总剂量 LD 50 (1)表示引起一半动物死亡的一次剂量 意义：K值越小，表示化学物的蓄积毒性越大
长期毒性作用及其试验方法
2019/4/2
任立群
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二、实验动物
2. 起始月(周)龄
起始体重应在体重均值± 20% 的范围内。
2019/4/2
任立群
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二、实验动物
3. 性别及数量 （1）性别
☆ 一般来讲是兼用两种性别的动物，每个剂量组中 雌雄性别的动物数必须一致。
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任立群
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二、实验动物
3. 性别及数量 （1）性别
一类新药：Beagle犬 二类新药：杂种狗
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任立群
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二、实验动物
1.种类及品系
☆我国药政部门规定的基本原则是选用两种动物, 一种为啮 齿类，首选大白鼠；另一种为非啮齿类，首选狗。 ☆在吸入给药时，猴是首先推荐的动物，因为它在呼吸系统 的解剖学和生理学方面比其它动物更接近人类。
☆如研究计划生育用药，应选择猴或其他大动物。
﹤5天 ﹤2周
2-4周 1-3月
2周 1月 3月 6月 6月
2周 1月 3月 6月 9月
﹥3月
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每天给药最好固定时间。
任立群 47
四、剂量水平的选择
三个剂量组是必不可少的：
一个是足以引起明显的毒性反应的高剂量，但死亡 率应控制在 10% 以内； 一个是不引起毒性作用的低剂量(一般为动物有效剂 量或临床治疗量的2~3倍)；
慢性毒性试验测定
慢性毒性试验测定
1目的
检测受试物长期染毒对实验动物所产生的毒性作用，确定其最小观察到有害作用剂量，最大未观察到有害作用剂量及毒性作用的靶器官。
2实验动物
试验选用刚离乳的大鼠。在试验结束时，每个剂量组每种性别的动物应不少于10只。中间需活杀动物检查时，需相应增加实验动物数量。
3试验分组
将实验动物随机分在3个剂量组和1个阴性对照组。阴性对照组除不接触消毒剂外，其它与实验组相同，若在试验中对受试物使用溶剂或赋形剂时，阴性对照组应给予相应剂量的溶剂或赋形剂。试验剂量根据亚慢性试验结果选择。高剂量应引起明显的毒性效应甚至个别动物死亡，低剂量应不引起毒性效应。
4操作程序
(1)用灌胃法或将受试物掺入饲料或饮水中喂饲。掺入饲料的受试消毒剂的最高浓度一般不超过5%0 饲料中受试消毒剂应定期监测，观察其均匀性和稳定性。
(2)灌胃法每天给药一次。
(3)前3个月每周称量体重，3个月后每月称1次体重，调整受试物灌胃量。如受试物掺入饲料，应定期称饲料消耗量。如受试物溶于饮水中喂饲，需记录动物的饮水量。
(4)试验期限为一般为6个月，必要时可延长至2年。
5观察指标
指标与亚慢性毒性试验基本相同，也可根据受试物对实验动物的亚慢性毒性作用和靶器官，可适当增加或更换一些针对性更强更灵敏的观察指标。
(1)临床观察：观察中毒表现，体重前3个月每周1次，以后每月I次。
(2)血液学检查：于试验的第3个月、6个月及以后每半年进行1次血液学检查。
(3)血液生化检查：检查时间同血液学检查。
(4)病理学检查：
系统解剖：所有实验动物包括试验过程中死亡的动物都应进行完整的系统解剖和详尽的肉眼观察。肉眼可见的异常组织都应留样作进•步组织病理学检查。
短期亚慢性和慢性毒性
亚慢性毒性试验可依据急性毒性的阈剂量或以1/20～1/5LD50 确定；
慢性毒性试验以亚慢性毒性试验效应的最大耐受量（MTD）为 最高剂量。
剂量选择步骤：
急性
亚急性
亚慢性
慢性
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②对于人群主动摄入的食品和药品，可采用人 体可能接触的最高剂量为剂量设计依据
大 鼠： 3个剂量组：10 30 100 非啮齿类： 3个剂量组：5 15 50
14
A 固定剂量法
在事先求出毒物的LD50的前提下，选取相同条件的40只（或更多） 动物，随即分为2组：实验组和对照组。每组至少20只，雌雄各半。
在1/20～1/5LD50 之间选择一个固定剂量，每日固定剂量、定时和 相同途径染毒
试验组累计发生一半动物死亡。如接触剂量已累计达5个LD50，也 可终止。
根据专业特殊性和管理部门有所区别
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亚慢性毒性的剂量选择
阴性对照组 低剂量组 中剂量组 高剂量组
急性毒性的阈剂量
1/20~1/5 LD50
组距：3~10倍，最低不小 于2倍
慢性毒性的剂量选择
阴性对照组 低剂量组 中剂量组 高剂量组
亚慢性阈剂量或其1/5~1/2
1/10 LD50 组距：2~5倍，最低不小于
实验期限最短为25天（1/5LD50），最长100天（1/20LD50）
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亚慢性毒性作用及其试验方法
亚慢性毒性作用及其试验方法
一、概念和试验目的
(一) 概念
亚慢性毒性是指实验动物连续多日接触较大剂量的外来化合物所出现的中毒效应。所谓较大剂量，是指小于急性LD50的剂量。
(二) 试验目的
亚慢性毒性试验的目的，主要是探讨亚慢性毒性的阈剂量或阈浓度和在亚慢性试验期间未观察到毒效应的剂量水平，且为慢性试验寻找接触剂量及观察指标。
二、亚慢性毒性试验设计
(一) 亚慢性试验期限
亚慢性毒性试验的期限“多日”的确切天数，至今尚无完全统一的认识。一般认为在环境毒理学与食品毒理学中所要求的连续接触为3～6个月，而在工业毒理学中认为1～3月即可。这是考虑到人类接触大气、水和食品污染物的持续时间一般较久，而在工业生产过程中接触化合物仅限于人一生中的工作年龄阶段，且每日工作不超过8小时之故。
现有学者主张进行实验动物90天喂饲试验为亚慢性毒性试验，即将受试物混合物饲料或饮水中，动物自然摄取连续90天。这是由于有研究报道认为动物连续接触外来化合物3个月，其毒性效应往往与再延长接触时间所表现的毒性效应基本相同，故不必再延长接触期限。相应地主张呼吸道接触可进行30天或90天试验，每天6小时，每周5天。经皮肤试验进行30天。
（二）实验动物和染毒途径
1、实验动物的选择
亚慢性毒性作用研究一般要求选拔两种实验动物，一种为啮齿类，另一种为非啮齿类，如大鼠和狗，以便全面了解受试物的毒性阿特征。
由于亚慢性毒性试验期较长，所以选择被动物的体重(年龄)应较小，如小鼠应为15g左右，大鼠100g左右。
2、染毒途径
亚慢性毒性试验接触外来化合物途径的选择，应考虑两点：一是尽量模拟人类在环境中接触该化合物的途径或方式，二是应与预期进行慢性毒性试验的接触途径相一致。具体接触途径主要有经口、经呼吸道和经皮肤三种。
第7章一般毒性作用及其实验与评鉴方法
第7章⼀般毒性作⽤及其实验与评鉴⽅法
第六章⼀般毒性作⽤及其试验与评价⽅法
⼀般毒性作⽤：是指毒物对动物机体产⽣的综合毒性效应，也称基本毒性作⽤根据接触毒物的时间长短可将产⽣的毒性作⽤分为急性毒性、亚慢性毒性和慢性毒性。
第⼀节急性毒性作⽤及其试验与评价⽅法
⼀、急性毒性试验的概念
急性毒性试验是指动物机体⼀次或24h内多次接触受试物后在短期内所产⽜的毒性效应及反应。
观察内容⼀般包括⾏为变化、外观改变以及致死效应。
观察时间⼀般为7d，观察范围可为7～28d（迟发毒性效应）。
凡经⼝或经注射给毒，“⼀次”的含义是指瞬间将受试物输⼊试验动物体内；若经呼吸或⽪肤给毒，“⼀次”则指在⼀个特定的时间内，使试验动物持续接受受试物的过程。
“24h内多次接触受试物”的概念是指当受试物毒性很低，⼀次接触还不能达到充分了解该受试物的毒性作⽤，或⼀次不能导⼊设计剂量的受试物时，需在24h内分次染毒。⼆、急性毒性试验的⽬的
（1）测定和计算出受试物的致死量及其他急性毒试参数，主要获得受试物对某种实验动物以某种接触途径的LD50值；
(2)了解受试物对动物机体的急性毒性特征，靶器官和剂量⼀反应关系；
(3)研究受试物在动物体内的动⼒学变化规律；
(4)为下⼀步的亚慢性、慢性毒性试验及其他毒理学试验的剂量设计和观察指标选择提供依据。
三、急性毒性试验⽅法
1．实验动物的选择和要求
(1)品种、品系的选择
实验动物选择的原则是以哺乳动物为主，选择两种或两种以上的动物，包括啮齿类(rodentspecies)和⾮啮齿类(nonrodenl species)，其中⾄少有⼀种⾮啮齿类动物。啮齿类多选⽤⼩⿏和⼤⿏，⾮啮齿类常选⽤⽝或猴。
药物毒理学：长期毒性 重复给药毒性
实验动物的选择
1-3个月长期毒性试验
年龄：大鼠80~100g（6-8 周龄） 狗 8~12月 小鼠10~15g
数量：啮齿类≥20 犬≥6~8
性别：雌雄各半
6~12个月长期毒性试验
年龄：大鼠: 初断乳 50~70g
狗 <8月 数量：啮齿类≥40
犬≥8 性别：雌雄各半
如果设计要求在染毒受试物期间处死一部分动物，进行某些指标动态观 察，则在试验开始时应相应增加实验动物数。
作详细的组织学检查，啮齿类动物36种，非啮齿类动物39种。 ❖ 在吸入毒性研究中，需检查整个呼吸道。经皮毒性试验应选
取涂敷受试物部位的皮肤和相邻部位的皮肤。 ❖ 应评价器官组织病理改变的性质和发生率。如果病理组织学
损害程度进行半定量评价，将易于判断损害是否由于受试物 诱发的损害是否随染毒剂量和时间增加而严重。
*低剂量 雌1/雄1
雌1/雄1
全部存活动物 雌1/雄1
V
0 溶 剂 对 雌1/雄1
雌1/雄1
照
全 部 存 活 动 雌1/雄1 物
给以受试物2周，此为常见的和推荐最低的实验周期。如要得到更多的信息，实验周期 可为4周。
实验分组和剂量设计
2、药物或保健食品： 以动物试验药效学或功能学资 料作基础确定低剂量组水平开始设计。
中剂量组 低剂量组 阴性对照组 组距：2~5倍，最低不小
90天经口毒性试验(一)
I
本标准规定了试验动物90天经口毒性实验的基本实验办法和技术要求。 本标准适用于评价受试物的亚慢性毒性作用。 2 术语和定义 2.1 亚慢性毒性
试验动物在不超过其寿命期限10%的时光内(大鼠通常为90d ),重复经口接触受试物后引起的健康伤害效应。 2.2 未观看到有害作用剂量
通过动物实验，以现有的技术手段和检测指标未观看到任何与受试物有关的毒性作用的最大剂量。 2.3 最小观看到有害作用剂量
在规定的条件下,受试物引起试验动物组织形态、功能、生长发育等有害效应的最小作用剂量。 2.4 靶器官
试验动物浮现由受试物引起显然毒性作用的器官。 2.5 卫星组
在毒性讨论设计和实施中外加的动物组,其处理和饲养条件与主要讨论的动物相像,用于实验中期或实验结束复原期观看和检测，也可用于不包括在主要讨论内的其他指标及参数的观看和检测。 3 实验目的和原理
确定在90d 内经口重复接触受试物引起的毒性效应，了解受试物剂量-反应关系、毒作用靶器官和可逆性,得出90d 经口最小观看到有害作用剂量(LO A EL)和未观看到有害作用剂量(N O A EL),初步确定受试物的经口平安性,并为慢性毒性实验剂量、观看指标、毒性尽头的挑选以及获得“暂定的人体健康指导值”提供依据。 4 仪器和试剂 4.1 仪器/器械
试验室常用解剖器械、电子天平、生物显微镜、检眼镜、血生化分析仪、血液分析仪、凝血分析仪、尿液分析仪、心电图扫描仪、离心机、病理切片机等。 4.2 试剂
、、、、、、血球分析仪稀释剂、血生化分析试剂、凝血分析试剂、尿液分析试剂(或试纸)等。 5 实验办法 5.1 受试物
毒理学评价的四个阶段和内容
毒理学评价的四个阶段和内容通常包括以下：
1. 急性毒性试验（Acute Toxicity Testing）：
这是毒理学评价的第一阶段，主要目的是确定物质在短时间内（通常是一次或几次接触后）对生物体产生的有害效应。
内容包括：经口、皮肤接触和吸入途径的急性毒性试验，计算LD50（半数致死剂量），即导致一半实验动物死亡的剂量。
2. 遗传毒性试验（Genotoxicity Testing）：
这个阶段评估物质是否能够引起遗传物质（DNA）的损伤，这可能导致突变、癌症或其他遗传疾病。
内容包括：Ames试验（细菌回复突变试验）、染色体畸变试验和微核试验等。
3. 亚慢性毒性试验（Subchronic T oxicity Testing）：
在这个阶段，物质的毒性效应在较长时间内（几周到几个月）被研究。
内容包括：重复剂量毒性试验，观察动物的行为变化、体重变化、血液学参数、生化指标、器官重量和病理学改变等。
4. 慢性毒性试验和致癌性试验（Chronic T oxicity and Carcinogenicity Testing）：
这是最长的一个试验阶段，通常持续数月到数年，旨在评估物质长期暴露对生物体的影响，包括潜在的致癌性。
内容包括：生命周期研究，观察生长发育、生殖能力、寿命以及肿瘤发生率等。
在这些试验中，除了直接的毒性效应外，还会考虑物质的代谢途径、蓄积效
应、剂量-反应关系以及敏感群体（如孕妇、儿童和老人）的特殊反应。这些信息对于全面评估物质的安全性和风险管理至关重要。值得注意的是，具体的试验设计和要求可能会根据监管机构的指导原则和物质的特性进行调整。
急性、慢性和亚慢性毒性实验
急性毒性试验
（一）经典的急性致死性毒性试验
通过试验得到化合物引起动物死亡的剂量—反应关系并求得LD50（LC50）
1、实验动物
常用的实验动物是小鼠或大鼠。一般受试动物应是雌、雄各半；若雌、雄动物对待测化学物毒性的敏感程度有明差异，则应分别求出各自的LD50；如果试验是为畸形试验做剂量准备，也可仅做雌性动物的LD50试验。小动物每组10只，狗等大动物可每组6只。
2、染毒剂量设计
首先要了解化学毒物的结构式、分子量、常温常压下的状态、纯度、杂质成分与含量、溶解度、挥发度、PH等理化性质。对于新的受试化学物，找出与受试化学毒物结构与理化性质近似的化学物的毒性资料，并以文献资料中相同的动物种系和相同接触途径所测得的LD50(LC50)值作为受试化学物的预期毒性中值，先用少量动物，以较大的剂量间隔（一般按几何级数）染毒，找出找出10%~90%（或0％~100％）的致死剂量范围，然后在这个剂量范围内设几个剂量组。改良寇氏法最好设5个剂量组，每组10只动物，雌雄各半，剂量组要求以等比级数设置。根据以下公式计算出剂量分组：
i=(lgLD90-lgLD10)／(n-1) 或：i=(lgLD100-lgLD0)／(n-1)
式中i为组距(相邻的两个剂量组对数剂量之差)；
n为设计的剂量组数。
有的毒性较小，此时可不再求其LD50，而应进行限量试验。在用大鼠或小鼠进行试验时，一般用20只动物，雌雄各半。单次染毒剂量一般限定为5g/kg（体重），对于食品毒理学试验，限量要求为15g/kg（体重）。如果实验动物无死亡或仅有个别动物死亡（死亡率低于50%），则可得出LD50大于限量的结论。
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毒理学作业
农药2,4-滴钠盐原药为白色粉末，水溶性，表1是其对SD大鼠的急性经口试验结果，请根据表中结果，给出该农药的90天亚慢性试验的试验方案，以及如何对保证实验质量予以控制。
表1 2，4-滴钠盐原药对SD大鼠急性毒性实验结果
剂量设置高剂量为25%LD50，中剂量为12.5%, 低剂量为6.3%。
雌性LD50为584mg/kg，高剂量为146mg/kg,中剂量为73mg/kg,低剂量为37mg/kg；雄性为501mg/kg，高剂量为125mg/kg，63mg/kg,低剂量为31mg/kg。
根据GB15670《农药登记毒理学实验方法》的农药急性毒性分级标准，2，4-滴钠盐原药的LD50>500mg/kg，属于低度农药。因此试验时选择SD大鼠的LD50为584mg/kg。
农药2,4-滴钠盐原药SD大鼠亚慢性毒性试验
目的;研究喂饲农药2,4-滴钠盐原药对大鼠的亚慢性毒性。
方法：取初断乳 SD大鼠80只，雌雄各半按照体重随机分为4组。将2,4-滴钠盐原药按146、73、37mg/kg mg/kg剂量分别拌入饲料内经口喂饲染毒90d。
观察：大鼠外观体征、体质量、进食情况等。在实验中期和末期采血检测检测血液学。试验末期检测血生化指标以及尿常规检查。实验结束时处死实验动物，计算脏器指数，并对主要脏器进行病理组织学观察。
1 材料和方法
1.1 受试物
农药2,4-滴钠盐原药，白色粉末，水溶性，由某地某农药公司提供。SPF级初断乳大鼠80只，雌雄各半，体质量50~100 g，由XXX
实验动物研究所繁育场提供，动物合格证号为医动字第XX-XXXX号。
1.2 饲养与管理
SPF 环境条件下，同组同性别两只一笼喂养，自由进食和饮水。环境温度 21～25℃，相对湿度 40%～60%。严格控制昼夜交替。
1.3实验方法
试验前将雌、雄大鼠各半按体重随机分为3个剂量组和1个对照组，每组20只，将2,4-滴钠盐原药按146、73、37mg/kg mg/kg剂量分别均匀混入饲料中制成颗粒饲料辐照灭菌后分别供高、中、低剂量组动物食用，连续每日一次喂养90d；对照组给予不加受试物的正常饲料。
1.4 观察指标
1.4.1一般情况
试验期间观察动物的一般情况包括外观体征和行为活动、粪便性状、食物摄入量及体重变化等。
1.4.2血常规
在实验中期和末期按常规方法测定血液学指标
1.4.3血液生化指标
试验末期检测血液生化指标
1.4.5尿常规检查
尿常规测定颜色、 pH值、比重(SG)、尿糖(GLU)、尿蛋白，将尿液离心，并对尿中沉淀物进行镜检。
1.4.6脏器病理
解剖动物，取心、肝、脾、肺、肾、胃肠、肾上腺、胸腺、脑和卵巢、睾丸等脏器，观察大体变化并称重（胃肠除外），计算脏器指数[脏器质量/体重）×100%]。
将解剖取得的脏器福尔马林固定，常规制片，HE 染色，光学显微镜进行病理组织学检查。
1.5 统计学分析
亚慢性毒性试验结果经正态性检验后，符合正态的指标采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析，否则经变换后分析。
２结果
2.1 一般状况
2.2 体重变化见表2
2.3 血常规检验结果见表3
2.4 血生化检测结果见表4
2.5 尿常规检查
2.5 脏器指数见表5
2.6 病理组织学检查
表2 2，4滴原药大鼠90 d亚慢性毒性试验体质量变化情况
表3 2，4-滴钠盐原药大鼠90 d亚慢性毒性试验血液常规检验
雌性试验前0 37 73 146
雄性试验前0 37 73 146
雌性试验后0 37 73 146
雄性试验后0 37 73 146
表4 2，4-滴钠盐原药大鼠90 d亚慢性毒性试验血生化检测结果
表5 脏器指数%
3.讨论
控制实验质量
1 大鼠毒理学实验中实验技术因素的质量控制
1. 1 动物临床观察指标的质量控制
在药品临床前大鼠毒理学实验研究过程中 , 其临床观察指标主要包括行为活动、体质量、增质量、饲料生物利用度等，而体质量、增质量、饲料生物利用度指标均为需要统计分析的客观指标。因其贯穿于整个实验周期 ,数据的客观性与实验环境、给药过程中动物感受是否舒适、动物密度、动物健康状况等因素相关。在动物临床指标统计分析前控制体系中 , 实验环境应选择 S P F级动物
实验室 ;每笼 2只 ;体质量在实验前应适应环境周期≥1周 ; 计算饲料摄入量每日应称质量 , 每周给药完毕即计算大鼠的饲料生物利用度 ,比较分析各组动物饲料生物利用度的统计学意义 ; 分析产生差异的原因 ,讨论差异是否与动物自发性疾病 ( 如大鼠自发性糖尿病会引起大鼠饲料生物利用度明显增大 ) 有关 , 同时应排除营养因素或给药途径对动物的损伤因素 ; 在动物行为活动指标观察中应在每日投药过程中重点观察大鼠投药部位是否发生充血、水肿、呕血 ,是否发生动物争斗外伤、皮毛稀疏竖散、粪便性状改变等变化 ,并及时处理与药物因素无关的改变 ,并详细记录 ,认真分析。
1. 2 血液学样本的质量控制
大鼠慢性毒理学实验中血液学常规的检测项目主要有红细胞计数( R B C ) 、血红
蛋白定量 ( H b ) 、白细胞计数及其分类计数 ( WB C+D C ) 、血小板计数 ( P T ) 、凝血时间 ( C T ) ; 血清生物化学检测项目主要有天门冬氨酸氨基转移酶 ( A S T ) 、丙氨酸氨基转移酶 ( A L T ) 、碱性磷酸酶 ( A L P ) 、总蛋白 ( T P ) 、清蛋白 ( A L B ) 、总胆固醇 ( T -C H O ) 、总胆红素 ( T - B I L ) 、空腹血糖 ( G L U ) 、尿素氮 ( B U N ) 、肌酐 ( C r ) 。选择合适的血样采集法，不仅对动物损伤小、样本溶血率低、可重复采样等优势 ,而且使大鼠慢性毒理实验中分阶段检测药物对造血系统、生化系统的影响成为可能。