抗体分离纯化技术的研究进展

Ｋｅ ｙ ｗｏｒｄｓ ： Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
引言
抗体是一种特殊的蛋白质分子， 被作为体外诊 断 的 试 剂 、治 疗 疾 病 的 药 物 、免 疫 亲 和 层 析 的 配 基 等 ， 在 生 命 科 学 研 究 、生 物 技 术 及 医 学 领 域 中 有 着 广 泛 的 应 用 。尤 其 是 抗 体 作 为 各 种 免 疫 分 析 的 核 心 试 剂 ， 对 免 疫 分 析 结 果 的 灵 敏 度 、特 异 性 起 着 至 关 重 要 的 作 用 。在 对 一 些 与 生 命 体 功 能 关 系 密 切 的 新 基因产物的研究中， 是否拥有相应的抗体以检测与 鉴定新基因的产物蛋白质， 是整个研究工作能否深 入开展的关键。
·技 术 与 方 法·
生物技术通报
ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＢＵＬＬＥＴＩＮ
２００８ 年第 ３ 期
抗体分离纯化技术的研究进展
侯越 罗奋华 吴应积
（ 内 蒙 古 大 学 哺 乳 动 物 生 殖 生 物 学 与 生 物 技 术 教 育 部 重 点 实 验 室 ， 呼 和 浩 特 ０１００２１）
摘 要： 制备高特异性、高效价的抗体是实验免疫学技术的基础， 抗体质量的高低 ， 将直接影响试验的成败。抗体 的制备有两个途径： 一是一般通用的方法， 以纯化的抗原免疫动物， 获得多克隆抗体； 二是应用杂交瘤技术制备单克隆抗 体 。但 不 论 用 何 种 技 术 制 备 的 抗 体 都 需 要 进 行 纯 化 。重 要 的 是 根 据 抗 体 的 性 质 和 来 源 选 择 一 个 合 适 的 分 离 纯 化 方 法 。对 当前的纯化方法进行了一个简要的综述。
亲和层析是利用生物活性物质之间的特异亲 和力， 使目标产物得以分离纯化。可应用于任何两 种有特异性相互作用的生物大分子， 如酶与底物 （ 包括酶的竞争性抑制剂和辅助因子） 、抗原与抗 体 、多 糖 与 蛋 白 复 合 体 等 。 正 是 因 为 利 用 的 是 生 物 学特异性而不是依赖于物理化学性质， 因而非常适 合 于 分 离 低 浓 度 的 生 物 产 品 。由 于 抗 体 与 抗 原 作 用 具有高度的专一性， 并且它们的亲和力极强， 所以 许多典型的亲和层析纯化蛋白质的过程已经使用 了 单 克 隆 抗 体 作 为 亲 和 配 基 。亲 和 层 析 技 术 具 有 高 收 率 、高 纯 度 、能 保 持 生 物 大 分 子 天 然 状 态 等 优 点 ， 广泛的应用于生物大分子的分离纯化， 特别是对含 量极少的基因工程抗体的一步纯化更显示出这一 技 术 的 优 越 性 。正 是 因 为 亲 和 层 析 技 术 的 高 度 特 异 性 ， 才 能 制 备 出 高 纯 度 的 生 物 大 分 子［７， ８］。 １．４ 凝胶过滤层析法
盐类对于蛋白质的溶解有双重作用， 当少量盐 类存在时， 盐类分子和水分子对蛋白质分子的极性 基团产生静电作用力， 使蛋白质的溶解度增大； 当 大量盐类存在时， 水的活度降低， 带电离子破坏蛋 白质周围的水化层， 使蛋白质表面的电荷被中和， 从而引起蛋白质相互聚集而沉淀。基于上述原理， 盐析法利用抗体与杂质蛋白之间对盐浓度敏感程 度的差异来分离。一般通过选择某一特定的盐浓 度 ， 令 大 部 分 杂 质 呈 现 “盐 析 （ 沉 淀 ） ”状 态 ， 而 抗 体 蛋 白 则 处 于 “盐 溶 （ 溶 解 ） ”状 态 。
抗体， 不论用何种方法制备抗体， 都需要在后期对 抗体进行分离和纯化， 所以根据目标抗体， 选择合 适的分离纯化方式就尤为重要。
１ 抗体的分离与纯化
通过不同方法制备的抗体往往与多种杂蛋白 混杂在一起， 为了获得成分相对单一的抗体或将抗 体用于特定的用途， 就需要对抗体进行纯化处理。 从成分的角度分析， 抗体分子是一类蛋白质分子， 与 其 他 蛋 白 质 一 样 ， 它 有 一 定 的 等 电 点 、溶 解 度 、荷 电 性 及 疏 水 性 ， 可 以 用 电 泳 、盐 析 沉 淀 或 其 他 层 析 技 术 进 行 分 离 、纯 化 。
抗体技术是免疫学领域中的一个重要方面， 广 泛应用于生命科学和医学各学科。从第一代抗 体— —— 血 清 多 克 隆 抗 体 开 始 ， 它 就 在 疾 病 治 疗 和 体 外 诊 断 中 发 挥 了 很 大 的 作 用 。由 于 免 疫 动 物 制 备 血
清抗体的免疫原性和非均质性， 给抗体研究和应用 造 成 了 困 难 ［１］， 激 发 了 人 们 对 抗 体 进 行 深 入 研 究 的 热 情 。１９７５ 年 Ｋｏｈｌｅｒ 和 Ｍｉｌｓｔｅｉｎ 通 过 杂 交 瘤 技 术 制 备出针对一种抗原决定簇的抗体即第二代抗 体— —— 单 克 隆 抗 体 （ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ， ＭｃＡｂ） ， 是 均质的异源抗体［２］。单克 隆抗体具有高度均 质性、高 度特异性， 促进了对各种传染病和恶性肿瘤诊断的 准确性， 是目前应用最广泛的抗体。单克隆抗体的 出现， 引起了生物学理论的革命， 生物学技术的广 泛 应 用 提 供 了 重 要 的 工 具 ［３］。２０ 世 纪 ８０ 年 代 采 用 基因工程的手段研制抗体， 并对抗体的基因进行改 造 和 重 组 等 ， 制 备 出 第 三 代 抗 体— —— 基 因 工 程 抗 体 （ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＧＥＡｂ） 。基 因 工 程 抗 体 主要对现有的鼠源性单克隆抗体进行人工改造， 并
收稿日期： ２００７－１１－１９ 基金项目： 内蒙古自治区自然科学基金重大项目（ 编号 ２００４０８０２０４０２） 作者简介： 侯越（ １９８２－） ， 男， 硕士研究生， 研究方向： 动物学生物技术 通讯作者： 吴应积， 教授
பைடு நூலகம்
２００８ 年第 ３ 期
侯越等： 抗体分离纯化技术的研究进展
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通 过 噬 菌 体 抗 体 库 筛 选 ， 克 隆 新 的 单 克 隆 抗 体［４］。 不 论 是 多 克 隆 抗 体 、单 克 隆 抗 体 还 是 基 因 工 程
抗体的纯化有 ２ 个原则： 抗体的用途和抗体的 来 源 ［５］。
（ １） 抗体的用途 在确定抗体的具体纯化方法 之前， 首先要明确纯化后的抗体的用途， 不同用途 的抗体， 纯化要求也不同。
（ ２） 抗体的来源 从多抗、单抗到基因工程抗 体， 制备方法的不同导致最终所含的杂蛋白也有很 大 的 差 异 。另 外 重 链 类 别 、亚 型 、相 对 分 子 质 量 的 不 同也将使纯化的方法间彼此有差别。目前， 常用的 纯化方法主要有以下几种。 １．１ 盐析法
凝胶过滤层析法又称空间排阻层析， 工作原理 是应用该技术进行分离的蛋白质分子具有相似的 分子结构而其分子量有差别而进行分离纯化， 简而 言之， 凝胶过滤层析是通过分子量的差异将蛋白质 分离开来。
应用凝胶过滤层析时， 将含有抗体的溶液通过 装有多孔性介质填料的层析柱床， 收集流出的抗体 组分。当样品从层析柱的顶端向下运动时， 大的抗 体 分 子 不 能 进 入 凝 胶 颗 粒 而 迅 速 洗 脱 。小 的 抗 体 分 子能够进入凝胶颗粒， 其在凝胶柱中的迁移被延 缓。因此， 抗体分子从凝胶过滤柱洗脱的先后顺序 一般是按照分子量的大小由高到低。
外 的 蛋 白 质 ， 使 上 清 液 中 只 含 有 ＩｇＧ， 所 以 该 法 一 般 用 来 纯 化 ＩｇＧ１ 和 ＩｇＧ２ｂ， 不 能 用 于 ＩｇＭ， ＩｇＡ 的 纯 化 ， 而 对 ＩｇＧ３ 的 纯 化 效 果 也 不 佳 。 在 实 际 操 作 中 ， 正辛酸的量随抗体的来源不同而有所差异。正辛 酸－ 饱和硫酸铵纯化法具有下列优点： （ １） 快速： 整 个 操 作 过 程 １ｄ 内 即 可 完 成 ； （ ２） 简 单 易 行 ： 仅 用 ２ 次沉淀， 无需复杂的仪器及设备； （ ３） 价格低廉： 实 验中所用试剂均为普通试剂， 容易得到且便宜； （ ４） 一次可纯化大量抗体。本法与柱层析法不同， 不受 标本多寡的限制； （ ５） 应用范围广， 可用于多种动物 血 清 及 小 鼠 腹 水 中 抗 体 及 单 克 隆 抗 体 的 纯 化 ［６］。 １．３ 亲和层析法
关键词： 抗体 分离 纯化
Ｐｒ ｏｇｒ ｅｓｓ ｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｕｒ ｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｐａｒ ａｔｉｏｎ
Ｈｏｕ Ｙｕｅ Ｌｕｏ Ｆｅｎｈｕａ Ｗｕ Ｙｉｎｇｊｉ
（ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃｈｉｎａ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ， Ｈｏｈｈｏｔ ０１００２１）
在 组 成 蛋 白 质 的 常 见 的 ２０ 种 氨 基 酸 中 ， 有 ８ 种氨基酸的侧链是非极性的， 属疏水性氨基酸。多 数蛋白质分子都是折叠的， 这样可以使其中大多数 疏水性氨基酸残基包埋在分子内部， 因而与周围的 水 性 坏 境 隔 离 。包 埋 在 内 部 的 疏 水 性 基 团 通 常 与 临 近 的 疏 水 基 团 发 生 作 用 。不 同 的 蛋 白 质 分 子 表 面 的 疏水性氨基酸残基的数量和类型不同， 因而表面的 疏 水 程 度 也 不 同 。疏 水 层 析 根 据 蛋 白 质 分 子 表 面 疏 水性的不同分离蛋白质， 需要蛋白质表面疏水基团 和共价连接到适当基质的疏水基团之间发生疏水 作用。
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生物技术通报 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ
２００８ 年第 ３ 期
所用的大多数凝胶基质都是化学交联的聚合 物 分 子 如 葡 萄 糖 、琼 脂 糖 、丙 烯 酰 胺 和 乙 烯 聚 合 物 制备的， 交联程度控制凝胶颗粒的平均孔径。交联 程 度 越 高 ， 平 均 孔 径 越 小 ， 凝 胶 颗 粒 的 刚 性 越 强 。在 任何给定的条件下使用什么孔径的凝胶取决于目 标 抗 体 的 分 子 量 和 主 要 杂 质 蛋 白 质 的 分 子 量 。 ［９￣１１］ １．５ 疏水层析法
Ａｂｓ ｔｒａ ｃｔ： Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｐｏｓｓｅｓｓｅｄ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｉｓ ｔｈｅ ｂａｓｅ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． Ｔｈｅ ｓｕｃｃｅｓｓ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｈａｓ ｔｗｏ ｗａｙｓ： ｏｎｅ ｉｓ ｃｏｍｍｏｎｌｙ ｃｕｒｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ， ｔｏ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｖｉａ ｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇ ａｎｉｍａｌｓ ｗｉｔｈ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ； ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｉｓ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ． Ｗｈａｔｅｖｅｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｕｓｅｄ， ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｎｅｅｄｓ ｔｏ ｂｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ． Ｉｔ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｔｏ ｃｈｏｏｓｅ ｔｈｅ ｐｒｏｐｅｒ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ， ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ． Ｔｈｉｓ ｒｅｖｉｅｗ ｉｓ ｆｏｃｕｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ．
目前用于盐析的盐类主要是硫酸铵， 因为它的 溶解度大， 对温度不敏感， 分级效果好， 对蛋白质有 稳定结构的作用， 价格低廉， 处理样品量大。 １．２ 正辛酸－ 饱和硫酸铵法
这是一个经验性的方法， 正辛酸－饱和硫酸铵 可 以 在 偏 酸 的 条 件 下 沉 淀 血 清 或 者 腹 水 中 除 ＩｇＧ