PH、金属离子在溶菌酶提取过程中对酶活性的影响
酚氯仿法提取DNA主要步骤和原理
酚氯仿法提取DNA主要步骤：1.将动物组织放在1.5ml的离心管中，分别用75%、50%酒精和纯水梯度脱酒精。
每个梯度脱水时间为5-10min2.将组织放入研钵中，加入适量DNA裂解液（300μl），研磨后再加入300μlDNA裂解液冲洗研磨棒。
3.将研磨好的组织液用移液枪加到1.5ml离心管，在管中加10μl蛋白酶K，用封口带将离心管封口，放入摇床（56℃,5h）。
4.加入等体积的Tris饱和酚（500μl），摇匀（10min）。
5.离心：12000R，7min，4℃。
离心后分成上中下三层，上层为DNA，中层为蛋白质，下层为有机质。
6.吸取上层液体加入新的离心管。
7.配制Tris饱和酚：氯仿：异戊醇=25:24:1。
8.在含有上清液的离心管中加入Tris饱和酚、氯仿和异戊醇混合液450μl，摇匀10min。
9.离心：12000R，7min，4℃。
10.吸取上清液加到新的离心管，加入等体积的氯仿和异戊醇混合液400μl（氯仿：异戊醇=24:1）。
11.离心：12000R，7min，4℃。
12.吸取上清液加入新的离心管，加入2.5倍经过-20℃冷冻的100%的酒精。
-20℃过夜。
13.将样品取出，12000R，7min，4℃离心。
14.弃上清，留白色沉淀（DNA），加400μl的75%的经过-20℃冷冻的酒精，反复吹打溶解。
15.重复第14步骤2次（用75%酒精洗三次）。
16.提取DNA完成。
溴氯仿法提取DNA的原理：用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。
用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。
蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。
使用酚的优点：1. 有效变性蛋白质；2. 抑制了DNase的降解作用。
缺点：1. 能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly（A）RNA。
2. 不能完全抑制RNase的活性。
简述溶菌酶的研究现状
简述溶菌酶的研究现状作者：李红易建中刘成倩孙晓云严华祥来源：《国外畜牧学·猪与禽》2016年第06期摘要：溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶，是一种普遍存在于植物、动物和微生物中的盐基水解蛋白。
溶菌酶的特征在于无毒、无害、无残留、安全性高，因此被广泛用于抗菌、抗炎、抗病毒、免疫力提升、促进有益菌增殖（双歧杆菌）等用途。
本文分析和归纳了溶菌酶的研究发展、活性影响因素和分类，并总结了其在食品、医药、畜牧业和酶工程等行业的应用价值。
关键词：溶菌酶；性质；分类；应用中图分类号：S852.2 文献标识码：A 文章编号：1001-0769（2016）06-0099-031 溶菌酶简介溶菌酶（Lysozyme，LYZ），又称胞壁质酶（muramidase），其化学名称为N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种稳定的碱性蛋白酶。
它可对细菌细胞壁肽聚糖中的N-乙酰葡萄糖胺、以及N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4糖苷键进行水解，促进细菌细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，降低细菌细胞壁的稳定性，导致细胞壁裂解内容物溢出，并最终引起细菌溶解[1]。
在与带负电荷的病毒蛋白相互结合的情况下，溶菌酶能够与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐。
这种复盐具有使病毒失去活力的特性。
研究表明，溶菌酶能够在不破坏其他组织的前提下，有选择地对微生物的细胞壁进行分解。
这种特性就使得溶菌酶具有抗菌消炎、抗病毒、增强免疫力、促进双歧杆菌等有益菌增殖的独特功效[2-4]。
据研究，溶菌酶作为单核细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的产物，对革兰氏阳性菌有显著的抑菌效果。
而且，溶菌酶作为碱性蛋白酶，是生物体内重要的非特异性免疫因子，在抑杀病原体时不易产生抗药性。
溶菌酶的这种与抗生素不同的抑菌机制已经得到重视，并应用于食品级药品当中。
另外，有文献证明溶菌酶可作为免疫调节和免疫激活剂[5]，在免疫系统中起着重要作用。
鸡蛋中溶菌酶的提取
鸡蛋中溶菌酶的提取，纯化及纯度鉴定李莹姝蒋华云*（南京师范大学生命科学学院，南京 210046）摘要：从蛋清中用724弱酸性阳离子交换树脂提取溶菌酶，然后用硫酸铵溶液洗脱，盐析得到溶菌酶。
用葡聚糖凝胶层析（SephadexG-75）纯化溶菌酶，收集峰值处样品。
用SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳鉴定个步骤留样及所得溶菌酶样品的纯度。
溶菌酶得率为0.0474mg/100ml（0.03g/kg）；葡聚糖凝胶层析过程纯化样品得到了洗脱峰曲线，但未能收集到峰值处样品；电泳结果显示在纯化过程中溶菌酶纯度不断升高。
本实验溶菌酶得率较低，提取工艺有待改进，需进一步减少样品损失；层析过程需进一步熟练掌握，以更好达到纯化效果。
关键词：溶菌酶；离子交换树脂，凝胶层析；SDS-PAGEExtraction, purification and purity of Egg lysozymeYings Li Huay Jiang*(College of Life Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China)Abstract:From egg white, with 724 weak acid cation exchange resin extraction of lysozyme, and then eluted with ammonium sulfate, salting to be lysozyme. With dextran gel chromatography (SephadexG-75) purified lysozyme, the peak of the sample collection. By SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) electrophoresis and identified steps to stay kind of purity of the samples from lysozyme. Lysozyme yield 0.0474mg/100ml (0.03g/kg); dextran gel chromatography purified samples obtained during elution peak curve, but failed to collect samples at the peak; electrophoresis showed that the purification process of lysozyme enzyme purity rising. In this study, lysozyme was the low rate of extraction process could be improved, the need to further reduce sample losses; chromatography process needs further proficiency in order to better achieve purification.Key words:lysozyme, Ion exchange resin, Gel chromatography, SDS-PAGE溶菌酶( Lysozyme , 1,4－β－N－溶菌酶) 是一种专门作用于革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖的β-1,4- 糖苷键的水解酶, 因而又称为胞壁质酶或者N- 胞壁质聚糖水解酶。
溶菌酶实验报告
溶菌酶实验报告溶菌酶实验报告一、实验目的1. 了解溶菌酶的作用和原理。
2. 掌握溶菌酶的提取和纯化方法。
3. 观察溶菌酶对细菌的溶解作用。
4. 探究溶菌酶活性的影响因素。
二、实验原理溶菌酶是一种能够降解细菌细胞壁的酶，能够切断细菌细胞壁中的葡萄聚糖链。
本实验基于溶菌酶对细菌的溶解作用，通过提取和纯化溶菌酶，观察其对细菌的溶解作用，并考察其活性的影响因素。
三、实验步骤1. 细菌培养：将青霉素产生菌株接种到培养基中，在37℃恒温摇床中培养16小时。
2. 细胞破碎：将培养液离心，去除上清液，用冷水洗涤菌体。
将菌体置于离心管中，在4℃条件下用酸性缓冲液破碎菌体。
3. 提取溶菌酶：离心破碎后的溶液，收集上清液。
将上清液加入硫酸铵溶液中，离心分离出沉淀，收集沉淀并溶解。
4. 粗提溶菌酶的纯化：对溶菌酶溶液进行离心、过滤和上样等操作，分离出纯净的溶菌酶。
5. 观察细菌的菌斑：将菌落转移到几个含溶菌酶的琼脂平板上，培养一段时间后观察菌落溶解情况。
6. 探究影响溶菌酶活性的因素：将溶菌酶分成几组，分别在不同温度、pH值和离子浓度下进行活性测定。
四、实验结果1. 提取和纯化溶菌酶：通过离心和过滤等操作，从细菌的破碎液中提取出纯净的溶菌酶。
2. 观察细菌的菌斑：在含溶菌酶的琼脂平板上培养细菌，观察到溶菌酶作用后的菌落明显溶解，与对照组相比，差异显著。
3. 影响溶菌酶活性的因素：在不同的温度、pH值和离子浓度下测定溶菌酶的活性，结果显示：较高的温度和较低的pH值能够提高溶菌酶的活性，而高浓度的离子对其活性有抑制作用。
五、实验讨论通过本实验的操作，成功提取和纯化了溶菌酶，并观察到其对细菌的溶解作用。
这表明溶菌酶具有一定的活性，并且能够降解细菌细胞壁，达到抑制细菌生长的效果。
在影响溶菌酶活性的因素方面，高温和低pH值对其活性有促进作用。
这是因为高温能够提高酶的活性，使其具有更好的催化效果；而低pH值可以改变酶的构象，增加其与细菌细胞壁的结合能力，从而提高溶解作用。
溶菌酶结构特点及分离纯化的研究
溶菌酶结构特点及分离纯化的研究摘要：本文对溶菌酶的结构特点和作用机制做了简单介绍，并对近年来溶菌酶分离纯化的方法,如结晶法、离子交换法、亲和层析法、膜处理技术、反胶团萃取法等进行了综述。
关键词：溶菌酶、结构特点、作用机制、分离纯化1 前言溶菌酶(1ysozyme;EC3.2.1.17)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶,溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramideglycanohydrlase),是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
人们对溶菌酶的研究始于本世纪初,英国细菌学家弗莱明(Flem ing)在发现青霉素的前6年(1922年)发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶,因其具有溶菌作用,故命名为溶菌酶。
在自然界中,溶菌酶广泛存在于人体多种组织中,鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁体液、木瓜、大麦、无花果和卷心菜等植物中以及微生物中也含此酶[1],其中以蛋清含量最为丰富，约0.3%[2]。
2 溶菌酶的结构特点和作用机制2.1 溶菌酶的类型溶菌酶按其所作用的微生物不同分为两大类,即细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。
细菌细胞壁溶菌酶有两种,一种是作用于β-1.4糖苷键的细胞壁溶解酶,另一种是作用于肽“尾”和酰胺部分的细胞壁溶解酶。
真菌细胞壁溶菌酶包括酵母菌细胞壁溶解酶和霉菌细胞壁溶解酶[3]。
2.2 溶菌酶的结构鸡蛋清溶菌酶是研究最清楚的一种溶菌酶,它由18种129个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质,在分子中的4对含硫氨基酸Cys间形成4个S-S键。
Phillips 等人1956年用X射线晶体结构分析法阐明了溶菌酶的三维结构,溶菌酶分子近椭圆形,大小为4.5nm×3.0nm×3.0nm,其构象复杂,α螺旋仅占25％,在分子的一些区域有伸展着的β片层结构,研究表明溶菌酶的内部几乎都为非极性的,疏水的相互作用在溶菌酶的折叠构象中起到重要作用,其分子表面有一个容纳多糖底物6个单糖的裂隙,这是溶菌酶的活性部位。
溶菌酶1
溶菌酶研究现状2010级基地班马冬珂10104109关键词：溶菌酶基本性质活性检测酶学性质提取，分离，纯化纯度检测一：溶菌酶的基本性质：１９０７年，Ｎｉｃｏｌｌｅ最早发表了枯草杆菌溶菌因子的报告，两年后，Ｌａｓｃｈｔｓｃｈｅｎｋｏ指出，鸡蛋也有较强溶菌活性，并把它命名为溶菌酶（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ，ＥＣ３．２．１．１７）。
紧接着Ｆｌｅｍｉｎｇ和Ｍｅｙｅｒ等证实植物中也含有溶菌酶，以后人们对溶菌酶的特性有了更深入的认识。
【1】作用机制：溶菌酶是一种广泛存在于各种动植物有机物中的糖苷水解酶，作用于Ｎ一乙酰氨基葡萄糖和Ｎ一乙酰胞壁之间的β—１，４糖苷键，能使某些细菌细胞壁中的粘多糖成分分解，破坏肽聚糖支架，在内部渗透压的作用下，细胞胀裂，细菌裂解，而人和动物细胞无细胞壁结构，也无肽聚糖，故溶菌酶对人体细胞无毒性作用，但具有溶解细胞壁的能力。
【2】溶菌酶分子量的测定：溶菌酶原料相对分子质量测定采用ＳＤＳＰＡＧＥ凝胶电泳法测定，分离胶浓度为１２％，采用考马斯亮蓝染色。
溶菌酶是由１２９个氨基酸残基组成的碱性球蛋白，等电点在ｐＨ值１０．８左右，分子量为１４０００，化学性质非常稳定。
当ｐＨ值在１．２—１１．３的范围剧烈变化时，其结构几乎不变。
在酸性环境下，溶菌酶对热的稳定性很强；ｐＨ值低于４时，溶菌酶可以长期在室温下存放。
其纯品为白色或微黄、黄色的结晶体或无定型粉末，无异味，，微甜，易溶于水，遇碱易被破坏，不溶于乙醚. 280nm的消光系数为13.0。
酶活性可被该酶活性可被一些金属离子Cu2+，Fe2+，Zn2+（10-5～10-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+,Ca2+（10-5～10-3M）、NaCl所激活。
应用：在国外，溶菌酶普遍的应用在食品的杀菌，保险，防腐以及微生物发酵和生物工程技术中菌体内容物的提取，如核酸，蛋白质，抗生素，酶等的提取，在医药和临床上，溶菌酶制成的各种药物具有抗菌抗病毒，消炎消肿，增强抗生素疗效等作用，检测血清尿中的酶的活性，临床上可用于诊断白血病。
溶菌酶的提取,分离纯化,产物纯度鉴定及活性测定精选全文
可编辑修改精选全文完整版溶菌酶的提取，分离纯化，产物纯度鉴定及活性测定实验目的：1、学习和掌握溶菌酶的制备过程2、学习和掌握溶菌酶的纯化过程3、学习和掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的德原理和技术4、测定溶菌酶的分子量和所提取的溶菌酶的浓度5、测定所提取的溶菌酶的活性试验原理：溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶于水，不溶于乙醚和丙酮，pI为11.0-11.35，最适pH值6.5。
酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活。
溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。
因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
该酶广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。
从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种129个氨基酸残基构成的单一肽链。
它富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶构型，是一种碱性蛋白质，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。
可分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌。
2.1、离子交换层析离子交换层析是依据混合样品中各种离子或离子化合物与离子交换树脂的可交换离子之间的交换程度不同而进行分离纯化的。
离子交换层析主要是离子交换剂与溶液中离子或离子化合物以离子交换方式进行，过程是可逆的。
由于离子交换剂对溶液中各种离子具有不同的结合力，也就是说，离子交换剂对各离子的排斥和阻滞作用不同，从而引起各离子在柱内的流速差异，逐渐发生分离，最终分别流出层析柱。
该法可同时分析多种离子化合物，具有灵敏度高，重复性、选择性好，分离速度快等优点。
溶菌酶1
溶菌酶研究现状2010级基地班马冬珂10104109关键词：溶菌酶基本性质活性检测酶学性质提取，分离，纯化纯度检测一：溶菌酶的基本性质：１９０７年，Ｎｉｃｏｌｌｅ最早发表了枯草杆菌溶菌因子的报告，两年后，Ｌａｓｃｈｔｓｃｈｅｎｋｏ指出，鸡蛋也有较强溶菌活性，并把它命名为溶菌酶（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ，ＥＣ３．２．１．１７）。
紧接着Ｆｌｅｍｉｎｇ和Ｍｅｙｅｒ等证实植物中也含有溶菌酶，以后人们对溶菌酶的特性有了更深入的认识。
【1】作用机制：溶菌酶是一种广泛存在于各种动植物有机物中的糖苷水解酶，作用于Ｎ一乙酰氨基葡萄糖和Ｎ一乙酰胞壁之间的β—１，４糖苷键，能使某些细菌细胞壁中的粘多糖成分分解，破坏肽聚糖支架，在内部渗透压的作用下，细胞胀裂，细菌裂解，而人和动物细胞无细胞壁结构，也无肽聚糖，故溶菌酶对人体细胞无毒性作用，但具有溶解细胞壁的能力。
【2】溶菌酶分子量的测定：溶菌酶原料相对分子质量测定采用ＳＤＳＰＡＧＥ凝胶电泳法测定，分离胶浓度为１２％，采用考马斯亮蓝染色。
溶菌酶是由１２９个氨基酸残基组成的碱性球蛋白，等电点在ｐＨ值１０．８左右，分子量为１４０００，化学性质非常稳定。
当ｐＨ值在１．２—１１．３的范围剧烈变化时，其结构几乎不变。
在酸性环境下，溶菌酶对热的稳定性很强；ｐＨ值低于４时，溶菌酶可以长期在室温下存放。
其纯品为白色或微黄、黄色的结晶体或无定型粉末，无异味，，微甜，易溶于水，遇碱易被破坏，不溶于乙醚. 280nm的消光系数为13.0。
酶活性可被该酶活性可被一些金属离子Cu2+，Fe2+，Zn2+（10-5～10-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+,Ca2+（10-5～10-3M）、NaCl所激活。
应用：在国外，溶菌酶普遍的应用在食品的杀菌，保险，防腐以及微生物发酵和生物工程技术中菌体内容物的提取，如核酸，蛋白质，抗生素，酶等的提取，在医药和临床上，溶菌酶制成的各种药物具有抗菌抗病毒，消炎消肿，增强抗生素疗效等作用，检测血清尿中的酶的活性，临床上可用于诊断白血病。
溶菌酶的提取和活性测定
实验讲义溶菌酶的提取和活性测定南方医科大学药学院I 溶菌酶的提取和部分纯化【试验目的】掌握根据等电点的差异，用离子交换层析方法进行分离纯化蛋白质。
【试验原理】溶菌酶（lysozyme ）又称胞壁质酶，是一种具有抗菌作用的粘多糖酶，相对分子量为1.44×104，可以催化水解细菌细胞壁N－乙酰胞壁酸和N－乙酰氨基葡萄糖的ß－1，4糖苷键，使细胞壁不溶性多糖成份分解成可溶性的糖肽，细菌细胞内容物溢出，使细菌溶解。
溶菌酶广泛存在于动植物中，比如鸡蛋、人的泪液、乳汁等等，其中以鸡蛋清中的含量最高。
下表是鸡蛋清中各种蛋白质的种类、含量和某些特性。
从表中可以看出，蛋清中大部分蛋白质的等电点在6.05以下，只有溶菌酶和卵白素的等电点在10以上，而溶菌酶的含量是卵白素的70倍。
在pH值7.0的缓冲液中，只有溶菌酶和卵白素带正电荷，其他蛋白质带负电荷，因此，可以通过阳离子交换层析，把溶菌酶和其他蛋白质分离，使溶菌酶得到部分纯化。
【仪器、材料和试剂】(一)、仪器分光光度计（二）、材料1、磷酸氢二钠（Na2HPO4）2、磷酸二氢钠（NaH2PO4）3、新鲜鸡蛋4、Amberlite阳离子交换树脂5、氯化钠（三）试剂1、PBS缓冲液：0.10M的磷酸盐缓冲液，pH7.0。
2、杂蛋白洗脱液：NaCl溶于0.10M的磷酸盐缓冲液（pH7.0），浓度0.05M。
3、溶菌酶洗脱液：NaCl溶于0.10M的磷酸盐缓冲液（pH7.0），浓度0.5M。
【实验步骤】（一）树脂的再生Amberlite阳离子交换树脂用0.5mol/L NaOH 浸泡30min，水洗至中性；再用0.5mol/L HCl 浸泡30min，水洗至中性。
在PBS缓冲液平衡12小时以上。
（二）蛋清样品的准备市售新鲜鸡蛋3个，破蛋壳取出蛋清，除去黏稠状物体，加入2倍体积的PBS 缓冲液（pH7.0），搅拌均匀。
八层纱布过滤，取30ml澄清液体，其中取0.5mL 置于EP管中，于-20°C冻存备用，标记为样品1。
实验 溶菌酶的粗提取、分离纯化及酶活力、纯度及分子量测定
43
实验3溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定
实验目的: 1、通过实验的学习与操作，在实验过程更好的理解SDS-聚丙
烯酰胺凝胶（PAGE）测定蛋白质纯度与分子量的原理与依据；
2、掌握电泳原理以及SDS-PAGE垂直板电泳分析蛋白质技术； 3、熟悉垂直板电泳操作原理和方法，凝胶染色与脱色方法， SDS-PAGE分子量测定图谱的绘制与计算； 4、了解在电泳中分子量标准物的使用。
13
离心机操作
平衡、定温、定速、定时。
14
实验一、 溶菌酶的粗提取——略
15
酶精纯化常用技术
透析
膜分离技术
超滤
凝胶过滤（分子筛/排阻）层析 离子交换层析 疏水层析 吸附层析
柱层析技术
亲和层析
蛋白质结晶
反相层析
16
Principles of Operation for Chromatography Techniques
称为1标准单位。
2.酶的比活力：
每单位酶蛋白所含的活力单位数。
对固体酶：用活力单位 /mg 酶蛋白、或活力单
位/mg酶蛋白氮来表示；
对液体酶：用活力单位/ml酶液来表示。
很明显，比活力越大，酶的活力越大。
37
3.具体测定方法
分光光度法：产物与适当的化学试剂生成有色物质 或产物有紫外吸收的能力可采用此法。
—CH2COO－ —C3H6SO3－
23
化学原料合成 ： sephadex sepharose 载体
天然材料制成： cellulose
如：DEAE-Sepharose， CM-Sepharose
24
实验设计原理
利用不同的蛋白质分子在溶液中所带电 荷不同，因而与离子交换剂有不同吸附力
溶菌酶的研究及应用简介
溶菌酶的研究及应用简介摘要溶菌酶（lysozyme）是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，又称胞壁质酶（muramidase）。
人们对溶菌酶的研究始于20 世纪初，英国细菌学家Fleming在发现青霉素的前6年（1922年）发现人的唾液、眼泪中存在能溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌作用，故命名为溶菌酶，其中鸡蛋溶菌酶的研究和应用已相当深入和广泛［1］。
通过对它的结构、性质、来源的研究；溶菌酶已广泛的应用于医药、生物工程和食品工业等多个方面。
关键词溶菌酶；结构；应用；研究进展溶菌酶（Lysozymc EC3.2.1.17）又名胞壁质酶（muramidase）、乙酞胞壁酸聚糖水解酶（N-acctylmuramide glyca-nohydrolase）,广泛地分布于自然界[2]。
在病毒（如噬菌体T4）、细菌（如枯草杆菌）、植物（如番木瓜）、动物（如鼠、狗）及人体都含有。
人体多数组织器官含有一定浓度的溶菌酶。
但以脾、肾含量较高。
在鼻及支气管分泌液、泪液、脑脊液、唾液、乳汁及血液中均含有一定量的溶菌酶。
此酶自被发现以来,经科学家们不断地研究,使得它在酶学及临床医学中均占有一定的重要位置，也将其应用于医疗、食品、畜牧及生物工程中。
1 溶菌酶的发现1907年Nicollc[2]猜测芽胞杆菌（Bacillus）及枯草杆菌中含有溶解细菌的酶。
1909年schtchenko[3]第一个报道了鸡蛋清含有溶解细菌的酶。
1922年Alexander Fleming[2]发现鼻粘液里有一种能溶解微球菌（micrococcus lysodeikticus）及其他细菌的酶，他把这种酶命名为溶菌酶（lysozyme）。
经过仔细的观察和研究，他发现此酶广泛地存在于生物组织及机体的某些分泌物中。
之后Robert及Wolff 也从鸡蛋清里提取出溶菌酶。
1937~1946年间Abraham[3]，Robinson, Alderson及Fevold等人通过实验从而分别获得了溶菌酶的结晶。
生物化学实验
温度、pH及酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响一、实验目的酶是生物催化剂，生物体内化学反应基本上都是在酶的催化下进行的。
通过本实验了解酶催化的特异性以及pH、温度、抑制剂和激活剂对酶活力的影响，对于进一步掌握代谢反应及其调控机理具有十分重要的意义。
二、实验原理酶的化学本质是蛋白质。
凡是能够引起蛋白质变性的因素，都可以使酶丧失活性。
此外，温度、pH和抑制剂、激活剂对酶的活性都有显著的影响。
酶的活性通常是用测定酶作用基质在酶作用前后的变化来进行观察的。
本实验用唾液淀粉酶作用的基质—淀粉，被唾液淀粉酶分解成各种糊精、麦芽糖等水解产物的变化来观察该酶在各种环境条件下的活性。
淀粉被酶水解的变化，可以借遇碘呈不同颜色来观察。
淀粉遇碘呈蓝色;糊精按分子从大到小的顺序，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和红色;最小的糊精和麦芽糖遇碘不呈现颜色反应。
三、试剂1.0.5%淀粉溶液称取可溶性淀粉0.5g加蒸馏水少许搅拌成糊状，然后用煮沸的;1%氯化钠溶液稀释至1Ooml。
2.碘化钾一碘溶液取碘化钾2g及碘1.27g溶解于2OOml蒸馏水中，使用前用蒸馏水稀释5倍。
3.1%尿素溶液。
4.奈斯勒试剂(见实验二十二)5.1%CuSO4溶液台秤称取CuSO4•5H2O， 1g用蒸馏水溶解至1OOml。
6.磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液pH5.0-8.0:A. 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液称35.62gNa2HPO4·2H2O用蒸馏水溶解后，定容至10OOml。
B. O.lmol/L柠檬酸溶液称取19.21g无水柠檬酸，用蒸馏水溶解后定容10OOml。
用A、B两液，按附录五，配制pH5.O、pH6.2、pH6.8、pH7.4、pH8.0各lOml。
7.0.5%NaCl溶液。
8.唾液淀粉酶制备每人用自来水漱口3次，然后取20m1蒸馏水含于口中，半分钟后吐入烧杯中，纱布过滤，取滤液lOml，稀释至2Oml为稀释唾液，供实验用。
9.脲酶提取液取黄豆粉6g，加30%乙醇250ml，振摇lOmin，过滤，滤液供实验用。
溶菌酶反应条件
溶菌酶反应条件摘要：1.溶菌酶简介2.溶菌酶反应条件a.温度b.pH值c.离子强度d.反应时间3.溶菌酶反应应用a.食品工业b.医药领域c.环境保护正文：溶菌酶是一类能够水解细菌细胞壁的酶，具有抗菌、消炎、抗病毒等生物活性。
在实验室和工业生产中，溶菌酶被广泛应用于食品加工、医药制造和环境保护等多个领域。
为了充分发挥溶菌酶的性能，了解其反应条件至关重要。
首先，温度是影响溶菌酶活性的重要因素。
溶菌酶的最适工作温度一般在30℃-50℃之间，低温条件下酶活性较低，高温条件下酶容易失活。
因此，在实际应用中需要根据具体情况选择适当的温度。
其次，pH值对溶菌酶的活性和稳定性也有很大影响。
溶菌酶的最适工作pH值通常在6.5-7.5之间，酶活性会随着pH值的偏离而降低。
在极端条件下，pH值过高或过低都可能导致溶菌酶变性失活。
因此，在实验过程中需要严格控制pH值，以保证溶菌酶的性能。
再者，离子强度也会对溶菌酶的活性产生影响。
通常情况下，离子强度越高，溶菌酶的活性越低。
因此，在实验过程中应尽量选择低离子强度的缓冲体系。
最后，反应时间是溶菌酶反应效果的关键因素。
反应时间过短，溶菌酶可能无法完全发挥作用；反应时间过长，溶菌酶容易因过度作用而失活。
因此，在实际应用中需要根据实验目的和实际情况合理设置反应时间。
总之，溶菌酶反应条件包括温度、pH值、离子强度和反应时间等因素，这些条件都会影响溶菌酶的活性和稳定性。
为了充分发挥溶菌酶的性能，在实验过程中需要严格控制这些条件。
备战2023年高考等级考生物考试易错题(全国通用)精练05 酶相关实验分析(含详解)
易错点05 酶相关实验分析关于“酶相关实验分析”的试题常常以选择题或非选择题形式考查酶的本质、特性和影响因素，这类试题具有较强的综合性，而且以曲线图、表格、相关试验设置试题情境。
错误原因有对酶的相关知识掌握不全、获取信息不足、实验分析不到位等等。
在复习备考中，需要梳理相关知识，加强动手实验和实验专题练习，切实提高获取信息能力和实验分析能力，同时关注易错点，弄清易错易混知识，这样才能通过复习提高得分率。
常见易错陷阱有：易错陷阱1：酶的化学本质是蛋白质或RNA。
忽略RNA造成错误判断。
易错陷阱2：温度对酶活性的影响。
误以为低温和高温均会破坏酶的空间结构，误以为不同温度下酶促反应速率不可能相同。
易错陷阱3：酶起催化作用的原理。
误以为温度、PH值、酶浓度、底物浓度、酶活性抑制剂均影响酶的活性从而影响酶促反应速率；误以为提高反应速率，就能提高生成物的量。
易错陷阱4：酶制剂的保存条件。
误以为酶适于在最适温度和最适PH值条件下保存。
易错陷阱5：酶相关实验材料、试剂、操作步骤。
例如：选择用淀粉和淀粉酶探究酶的最适温度，检测底物被分解的试剂能否选用斐林试剂或能否选择过氧化氢(H2O2)和过氧化氢酶作实验材料探究酶的最适温度。
易错陷阱6：曲线图中酶促反应速率限制因素的判断。
例如：下图曲线中，限制ABC点酶促反应速率增加的因素是否相同。
易错陷阱7：确定酶作用的最适温度（PH）。
误以为曲线最大值就是最适宜温度（PH）——曲线未出现拐点；一组数据中产物量最大值就是最适宜温度（PH）——梯度还可以变化。
例题1、（2022 全国乙卷·T4）某种酶P 由RNA 和蛋白质组成，可催化底物转化为相应的产物。
为探究该酶不同组分催化反应所需的条件。
某同学进行了下列 5 组实验（表中“+”表示有，“－”表示无）。
根据实验结果可以得出的结论是A．酶P 必须在高浓度Mg2+条件下才具有催化活性B．蛋白质组分的催化活性随Mg2+浓度升高而升高C．在高浓度Mg2+条件下RNA 组分具有催化活性D．在高浓度Mg2+条件下蛋白质组分具有催化活性例题2、(2020北京·T4)用新鲜制备的含过氧化氢酶的马铃薯悬液进行分解H2O2的实验，两组实验结果如图。
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2011届本科毕业生毕业论文题目：PH、金属离子在溶菌酶提取过程中对酶活性的影响作者姓名徐萧苟真汪磊指导教师刘秀丽学科专业生物技术系别生命科学与技术学院学号2007221121 20072211022007221115提交论文日期2011年6月2日PH、金属离子在溶菌酶提取过程中对酶活性的影响徐萧苟真汪磊指导老师：刘秀丽（陇东学院生命科学与技术学院甘肃庆阳 745000）摘要:本实验采用盐析法从鸡蛋清中提取溶菌酶，通过在提取过程中施以不同的PH和加入不同的金属离子，来测定其对提取的溶菌酶活性的影响。
结果表明酶活性在PH6.0-6.5最强、且在5-7范围内较稳定；金属离子中Na+、K+对其活性有轻微激活作用。
Mn2+、Mg2+对溶菌酶活性无明显影响，Ca2+、Cu2+、Fe2+、Zn2+使溶菌酶活性下降。
关键词：盐析蛋清溶菌酶；酶活性；影响因素；金属离子；提取；PHPh, Metal Ions In Mind The Enzymes Are Extracts Of The Enzyme ActivityXuxiao gouzhen wanglei（Gansu College of Life Science and Technology, Biotechnology, 07 classes inQingyang 745000）Abstract: Objective To study the extraction process of egg white lysozyme PH, metal ions on enzyme activity levels.Methods: egg white lysozyme in the extraction process or by changing the PH by adding various metal ions the size of the different factors to determine the results of the activity of egg white lysozyme was observed enzyme activities. The results of activity of the strongest in the PH6.0-6.5 and was stable in the range 5.0-7.0; metal ions in the Na +, K + activation of its activity slightly. Mn2 +, Mg2 + had no effect on the activity of lysozyme, Co2 +, Ca2 +, Cu2 +, Fe2 +; Zn2 + is the activity of lysozyme decreased. Conclusion Preliminary results showed that acid extraction of lysozyme as part of the environment and enhance the metal ions for their activity and reduce the effectKeywords ：out truffles are an enzyme ;enzyme activity ; factors influencing Metal ion; extraction;pH;0引言溶菌酶(Lysozyme),正式名为N-乙酰基糖胺酶（N-lhexosaminodase）,属胞壁质酶（muramidase）, 有称N-乙酰胞壁质酶，能选择性地分解微生物的细胞壁而具有杀菌、抗病毒、抗肿瘤细胞等功效，在食品工业、医疗、生物学领域有着广泛的应用[1]。
当前、可以从牛、羊、马等动物乳汁中分离溶菌酶，从番木瓜、无花果、大麦、卷心菜等植物中也可分离溶菌酶。
溶菌酶在临床现象常用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔溃疡、水痘、带状疱疹和扁平疣等。
在食品工业上中还可以作为防腐剂。
利用溶菌酶处理革兰阳性菌还可得到原生质体，因此，溶菌酶也是基因工程、细胞工程中细胞融合操作必不可少的工具酶。
因此，开发溶菌酶具有良好的经济价值和研究价值[2-4].国内上市制剂有溶菌酶含片和肠溶片两种，尚未有溶菌酶液体制剂上市。
目前使用的溶菌酶为鸡蛋清溶菌酶，为C型溶菌酶，从人乳汁、尿和胎盘中提取的溶菌酶也属于C型。
鸡蛋清溶菌酶占蛋清总蛋白3.5%左右，作为溶菌酶类的典型代表是目前重点研究对象。
本文为了拓展溶菌酶应用，对蛋清溶菌酶的酶学活性质进行研究，探讨PH、常见金属离子对其在提取过程中活性的影响，以期提高酶提取纯度和酶活。
1 仪器与材1.1 材料溶菌酶(15000U/mg)、枯草芽孢杆菌、牛肉浸取物、蛋白胨、琼脂等；生化药品：PBS缓冲液、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸铵、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、利丙酮等。
鲜鸡蛋：市售。
1.2主要仪器722型分光光度计、电子天平、离心机、超净工作台、烧杯、量筒、漏斗、离心管、定性快速滤纸、移液管（10mL）、移液枪、试管及试管架2 试验方法2.1培养基的配制2.11 液体培养基葡萄糖20g,蛋白胨15g,氯化钠5.0g，牛肉膏0.5g,琼脂20g,调PH至7.0，定溶于1L蒸馏水中，封装与三角瓶中，121℃灭菌15min。
2.12 固体培养基液体培养基加琼脂2%，调PH至7.0，置于1L水蒸馏中，加热溶解，封装于斜面中，121℃灭菌15min[5-6].2.2 蛋清液的配制选择新鲜鸡蛋，用水清洁掉蛋壳表面的不洁之物，破壳分离蛋清，将蛋清搅拌稠度均匀，以不引起泡沫为宜，防止蛋白质变性，用双层纱布滤去卵带和碎蛋壳。
2.3溶菌酶提取取一定量蛋清液，加入适量氯化钠同时搅拌均匀，再用1mol/L的氢氧化钠调节蛋清液pH10.0，加入少量溶菌酶作为晶种，4℃静置数天，溶菌酶晶体将析出，离心、干燥即得溶菌酶干粉。
2.4 酶活力测定方法2.41底物的制备在斜面培养基中取枯草芽孢杆菌接种于30ml液体培养基中，37O C,18h过夜培养， 5000r/min离心15min，弃上清液，收集菌体，用pbs缓冲液制成悬液。
2.42 酶液的制备准确称取干菌粉5mg，用0.1mol/L的pH6.2磷酸缓冲液溶解成50ml。
2.4.3 酶活力测定取6mL枯草芽孢杆菌的过夜培养物，3500rpm常温离心5分钟，弃上清，沉淀用6mL 0.02mol/L PBS缓冲液悬浮，利用可见光分光光度计测其OD450并记录（吸光度在0.5～1.0范围，如果读数过高可适当稀释）。
比色皿编号见下表，其中1只加入PBS作为仪器调零空白，2作为对照，3、4用于平行测定然后取平均值），30s测定一次吸光度值，约3min内至吸光度达到稳定。
比色皿 1 2 3 4PBS缓冲液/mL 3 - - -细胞PBS悬液/mL - 3 2.9 2.9- - 0.1 0.1分别用酶液S1～S4/mL在室温，以1号管为对照，每隔30s分别测定2、3、4在450nm的吸光度。
观察悬液OD450反应前后的变化。
根据以下的酶活定义，测定溶菌酶活性。
其中活力单位（U）：酶在室温（25℃），pH8.0条件下，以每毫克溶菌酶每分钟使吸光度降低0.001个单位为1个酶活力单位[7-9]。
将2.4.3酶活力测定结果作为对照。
2.5不同范围内的PH值对溶菌酶活性的影响的测定方法选择pH值为1.0-7.0的酸性环境和pH值为7-14碱性环境大范围的测定酶活性，测得pH范围在1.0-7.0，酶活性有上升趋势；在pH值为7-14，酶活性急剧下降。
在选择不同点的pH值做测定，分别选择4.0；5.0；5.5；6.0；6.5；7.0；8.0；9.0等不同pH值梯度的磷酸缓冲液测定其对酶活性的影响。
得结果绘制曲线图形，讨论不同pH值对酶活性的影响。
具体实验方法：分别在不同PH值的磷酸盐缓冲液中，在25℃下放置0.5h，测定溶菌酶活性。
加入不同条件的pH值，从加酶时开始记时，每隔30s测1次OD450值，共测3次，计算出平均值。
最后记录下不同范围pH条件下的酶活值。
2.6属离子对酶活性的影响的测定方法将溶菌酶液与底物混合，测定酶活力，作为对照。
然后将常见金属离子中的一种加入到溶菌酶液中，并保持每种金属离子的浓度都保持在0.01mol/L,与底物混合，并迅速摇匀，从加酶时开始记时，每隔30s测1次OD450值，共测3次，记录数据，取平均值。
每种金属离子都依上述方法依次加入，测三次，求平均值。
在25℃条件下放置0.5h后，以不加金属离子的酶液活性为参照计算相对酶活力。
3 测定结果3.1 不同pH在溶菌酶提取过程中对蛋清溶菌酶活性的影响结果图一结果见图一：由图一可知，蛋清溶菌酶在pH6.0~6.5活性最强，pH5.0~7.0范围内酶活性比较稳定，在pH大于7.0时酶活性急剧下降。
说明蛋清溶菌酶在酸性环境中稳定。
图一是根据溶菌酶中加入不同pH值，测定其酶活性，将不同pH条件下多次测得的酶活平均值与对照实验测的酶活的相对值作为图一的纵坐标，加入的pH值做为图一的横坐标。
根据不同条件下所得的值与坐标值对应，描述pH对溶菌酶提取过程的中酶活性的影响。
3.2不同金属离子在溶菌酶提取过程中对蛋清溶菌酶活性的影响结果结果如图二，实验表明，Ca 2+、Co 2+、Fe 2+、Zn 2+、Cu 2+金属离子均出现溶菌酶溶液沉淀现象。
金属离子中Na +、K +对其活性有轻微激活作用。
Mn 2+、Mg 2+对溶菌酶活性无明显影响，Co 2+、Ca 2+、Cu 2+、Fe 2+、Zn 2+是溶菌酶活性下降，后者可能使酶沉淀变性。
Fe 2+、Zn 2+存在下这种现象尤为明显。
结论 初步试验结果表明溶菌酶提取过程酸碱环境和有一部分金属离子对其活性有提升作和降低作用。
因此在溶菌酶制剂生产过程中应避免溶菌酶与金属离子接触[10-12]。
图二是0.01mol/L 金属离子对溶菌酶活性的影响，以纵坐标为相对酶活，横坐标为不同的金属离子，描绘出金属离子对酶活性的影响程度。
且以2.4.3测定的酶活作为对照值与加入不同金属离子的酶活值进行计算，获得相对酶活数值。
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