PH、金属离子在溶菌酶提取过程中对酶活性的影响
溶菌酶的实验报告
溶菌酶的实验报告
实验报告：溶菌酶的活性和特性
1. 引言
溶菌酶是一种酶类蛋白质，广泛存在于细菌、真菌和某些病毒中。它们能够降解细菌细胞壁的组分，导致细菌破裂和死亡。溶菌酶在医疗、食品工业以及科学研究领域广泛应用。本实验旨在测定溶菌酶的活性，并研究其特性。
2. 材料与方法
2.1 实验材料
- 大肠杆菌（或其他细菌菌株）
- 溶菌酶溶液
- 反应液：含有溶菌酶的缓冲液
- 应答物：含有细菌菌株的琼脂平板
2.2 实验步骤
1. 在琼脂平板上涂布一层薄膜状的细菌液体（大肠杆菌）。
2. 在涂布的细菌表面滴加一定量的溶菌酶溶液。
3. 将琼脂平板在恒温孵化箱中孵育一段时间（通常为24小时）。
4. 检查平板上是否有清晰的细菌溶解区域（透明区域），观察细菌溶解的程度。
3. 结果与讨论
在实验过程中，我们发现在涂布完细菌后，经过一段时间的孵育后，在加入溶菌酶的区域产生了明显的细菌溶解区域（透明区域）。这表明溶菌酶对细菌产生了
溶解作用。
溶菌酶的活性可以通过以下几个方面进行评估：
3.1 溶菌酶单位（U）
溶菌酶单位（U）的定义是在标准条件下，使得溶菌酶在30分钟内使细菌的可溶菌酶量增加1倍所需要的溶菌酶量。通过测定单位时间内细菌总数量的变化，可以计算出溶菌酶的活性。
活性（U/ml）=单位时间内可溶菌酶总量/单位时间内总分析体积
3.2 温度和pH值的影响
我们可以通过在不同温度条件下进行实验，或者在不同pH值的溶液中测量溶菌酶活性，来研究温度和pH的影响。
溶菌酶活性在不同温度下可能表现出不同的变化趋势。通常情况下，随着温度的升高，溶菌酶活性增加，但过高的温度可能导致其变性。我们可以通过测量不同温度下的溶菌酶活性来确定最适温度。
DNA提取常见问题
DNA提取过程中各种试剂的作用及原理
1．溶液I—溶菌液：
溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。
葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。
EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase 作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。
2．溶液II－NaOH－SDS液：NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。
在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1／L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。
SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：
（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。
（2）解聚细胞中的核蛋白。
（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。
但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中
（用RNase去除RNA时）受到干扰。
3. 溶液III--3mol／L NaAc（pH
4.8）溶液：NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。
所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，
溶菌酶结晶法提取及其酶活力的探讨_黄赞良
作为一种糖苷水解酶的溶菌酶,又称 N-乙酰胞壁质聚糖水解酶或胞壁质酶,是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。溶菌酶广泛存在于鸟类的蛋清及哺乳动物的尿液、泪液、血液、体液 (如淋巴液、组织 (如肝、肾细胞内等 [1]。主要通过破坏细胞壁中的 N-乙酰胞壁酸 (NAM和 N-乙酰氨基葡糖 (NAG之间的β-1,4糖苷键,使细胞壁不溶性黏多糖分解为可溶性糖肽,导致细胞壁破裂而使细菌溶解。溶菌酶对人体无毒副作用,是一种安全的天然防腐剂,具有抗病毒、抗菌、抗肿瘤之功效。可用作为药物制剂、防腐剂、基因与细胞工程中细胞融合剂等 [2]。
作为碱性酶的溶菌酶,其来源不同,水解细胞壁的性能也表现为较大差异 [3]。溶菌酶水解微生物细胞壁的作用机理是破坏细胞壁结构中的肽聚糖, 作用位点是NAM 与 NAG 碳原子间的β-1.4糖苷键 [4]。肽聚糖作为微生物细胞壁的主要成份(骨架 ,是 NAG 与 NAM 通过β-1,4 糖苷键交替排列形成的多层网状结构的共聚物[5]。肽聚糖结构中的任何化学键断裂,都能促使细胞壁中的肽聚糖分解,导致细菌细胞壁被破坏,从而体现溶菌酶的溶菌特性 [6]。
近年来,根据不同原料及溶菌酶的特性,提取分离溶菌酶的方法有结晶法、反胶团萃取法、离子交换法、色谱法、亲和层析法等。结晶法这一传统的方法,是由Mayer Abraham 等提出并获得结晶状溶菌酶 [7]。本文利用湖光岩地区的鹌鹑蛋为提取原料,采用结晶法提取分离溶菌酶,进而利用重结晶的方法反复精制,可提取到所需纯度的溶菌酶晶体 [8]。
DNA提取过程中各种试剂的作用及原理
DNA提取过程中各种试剂的作用及原理
1．溶液I—溶菌液：
溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。
2．溶液II－NaOH－SDS液：
NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。
但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。
在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1／L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。
SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：
（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。
（2）解聚细胞中的核蛋白。
（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。
但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中
（用RNase去除RNA时）受到干扰。
3. 溶液III--3mol／L NaAc（pH
4.8）溶液：NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。
所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，
实验溶菌酶的粗提取、分离纯化及酶活力、纯度及分子量测定报告
测压法：产物中有气体，测气压增加量。
滴定法：产物中有酸生成，用碱滴定。 荧光法：产物中有荧光物质生成或产物与荧光试剂 反应生成荧光产物可用此法。 旋光法：产物中有旋光物质可采用此法。 除了以上方法外，还可根据产物的性质采用其它方法。
4. 回收率和纯化倍数 回收率＝
提纯后酶总活力 提纯前酶总活力
×100％
高度纯化（fine
fractionation） （精纯化）：除去与产 物性质相似的杂质。
纯化方案评价：酶活力、蛋白浓度、纯度
6
粗纯化（ 提取）目标：
a. 将目的酶最大限度地溶解出来。
b. 保持生物活性。
注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活，
一般采用低温下（0~10℃）操作。
提取原则
a. 相似相溶。
实验1-3 溶菌酶的提取分离及鉴定 （酶活力、纯度及分子量测定）
1
实验内容
1. 溶菌酶的粗提取 2. 溶菌酶的分离纯化及酶活力、蛋白浓度测定 3. 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定
2
背景知识
溶菌酶（lysozyme）：胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质
聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水 解致病菌中黏多糖的碱性酶。 生物学效应：主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰 氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可 溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。该酶活 性可被一些金属离子Cu2+，Fe2+，Zn2+以及N-乙酰葡萄糖胺所抑
pH对溶菌酶活性的影响
pH对溶菌酶活性的影响
佚名
【期刊名称】《河南畜牧兽医》
【年(卷),期】2005(26)3
【摘要】溶菌酶在酸性环境下是稳定的，此时加热100％：对溶菌酶仅有很小的活性损失，Matsuoka等报道pH4．5(100％：，3分钟)、pH5．29(100％：，30分钟)的条件下溶菌酶是稳定的。Beychok等报道溶菌酶在pH5．5时最为稳定，Cunningham等发现溶菌酶在酸性环境中稳定，在碱性环境中不稳定。【总页数】1页(P53-53)
【关键词】环境pH值;溶菌酶;酶活性;温度
【正文语种】中文
【中图分类】Q556.2
【相关文献】
1.四黄汤浸泡种蛋可提高育雏存活率○调节瘤胃纤维素消化的主要因素○奶牛饲喂啤酒糟的注意事项○黄牛精液的解冻方法○pH对溶菌酶活性的影响○入孵蛋重对肉鸭生长性能的影响○对症治疗猪粪便异常○中草药饲料添加剂有益畜禽○春季要避免家畜饲料单一○阴道栓塞法处理绵羊发情○育肥羊日粮适宜的酒糟比例○指甲花白糖汤治疗牛胎衣不下 [J],
2.四黄汤浸泡种蛋可提高育雏存活率○调节瘤胃纤维素消化的主要因素○奶牛饲喂啤酒糟的注意事项○黄牛精液的解冻方法○pH对溶菌酶活性的影响○入孵蛋重对肉鸭生长性能的影响○对症治疗猪粪便异常○中草药饲料添加剂有益畜禽○春季要避免家畜饲料单一○阴道栓塞法处理绵羊发情○ [J],
3.玉米蛋白粉替代鱼粉对暗纹东方鲀溶菌酶活性及c型溶菌酶mRNA表达的影响[J], 钟国防;钱曦;华雪铭;周洪琪
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探究pH对酶活性的影响
..
,. 探究pH对酶活性的影响
实验步骤：
1.取3支洁净的试管，编号1,2,3，各加入2mLH2O2溶液。
2.分别向3支试管加入1mL的HCl
溶液、蒸馏水、NaOH溶液，摇匀。
3.向3支试管各加入1mL的H2O2酶
溶液，摇匀，观察各试管气泡数量。实验结果：
1,3号试管有少量气泡产生，2号试管有大量气泡产生。
实验结论：
pH会影响酶活性，在最适pH时，酶的活性最高，pH过高或过低，均会影响酶的活性。
DNA提取过程中各种试剂的作用及原理
DNA提取过程中各种试剂的作用及原理
1．溶液I—溶菌液：
溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。
2．溶液II－NaOH－SDS液：
NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。
但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。
在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1／L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。
SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：
（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。
（2）解聚细胞中的核蛋白。
（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。
但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中
（用RNase去除RNA时）受到干扰。
3. 溶液III--3mol／L NaAc（pH
4.8）溶液：NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。
所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，
溶菌酶实验报告
溶菌酶实验报告
溶菌酶实验报告
一、实验目的
1. 了解溶菌酶的作用和原理。
2. 掌握溶菌酶的提取和纯化方法。
3. 观察溶菌酶对细菌的溶解作用。
4. 探究溶菌酶活性的影响因素。
二、实验原理
溶菌酶是一种能够降解细菌细胞壁的酶，能够切断细菌细胞壁中的葡萄聚糖链。本实验基于溶菌酶对细菌的溶解作用，通过提取和纯化溶菌酶，观察其对细菌的溶解作用，并考察其活性的影响因素。
三、实验步骤
1. 细菌培养：将青霉素产生菌株接种到培养基中，在37℃恒温摇床中培养16小时。
2. 细胞破碎：将培养液离心，去除上清液，用冷水洗涤菌体。将菌体置于离心管中，在4℃条件下用酸性缓冲液破碎菌体。
3. 提取溶菌酶：离心破碎后的溶液，收集上清液。将上清液加入硫酸铵溶液中，离心分离出沉淀，收集沉淀并溶解。
4. 粗提溶菌酶的纯化：对溶菌酶溶液进行离心、过滤和上样等操作，分离出纯净的溶菌酶。
5. 观察细菌的菌斑：将菌落转移到几个含溶菌酶的琼脂平板上，培养一段时间后观察菌落溶解情况。
6. 探究影响溶菌酶活性的因素：将溶菌酶分成几组，分别在不同温度、pH值和离子浓度下进行活性测定。
四、实验结果
1. 提取和纯化溶菌酶：通过离心和过滤等操作，从细菌的破碎液中提取出纯净的溶菌酶。
2. 观察细菌的菌斑：在含溶菌酶的琼脂平板上培养细菌，观察到溶菌酶作用后的菌落明显溶解，与对照组相比，差异显著。
3. 影响溶菌酶活性的因素：在不同的温度、pH值和离子浓度
下测定溶菌酶的活性，结果显示：较高的温度和较低的pH值
能够提高溶菌酶的活性，而高浓度的离子对其活性有抑制作用。
DNA提取过程中所用试剂的机理
DNA提取过程中所用试剂的机理
1.溶菌酶的作用机制是
溶菌酶是一种碱性球蛋白，分子中碱性氨基酸、酰胺残基和芳香族氨，酸的比例较高，酶的活动中心是天冬氨酸和谷氨酸。
溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，称包胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，它专一地作用于肽多糖分子中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4键，从而破坏细菌的细胞壁，使之松驰而失去对细胞的保护作用，最终使细菌溶解死亡。也可以直接破坏革兰氏阳性菌的细胞壁，而达到杀菌的作用，这主要是因为革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由胞壁质和磷酸质组成，其中胞壁质是由杂多糖和多肽组成的糖蛋白，这种多糖正是由N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4键联结的。对某些革兰氏阴性菌，如埃希氏大肠杆菌，伤寒沙门氏菌，也会受到溶菌酶的破坏。溶菌酶是母乳中能保护婴儿免遭病毒感染的一种有效成分，它能通过消化道而保持其活性状态，溶菌酶还可以使婴儿肠道中大肠杆菌减少，促进双歧杆菌的增加，还可以促进蛋白质的消化吸收。
简言之,破坏细菌细胞壁，由于细菌在没有细胞壁时不能生存，从而杀死细菌。
2. 十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）常用于DNA提取过程中使蛋白质变性后与DNA分开。
SDS是分离DNA时常用的一种阴离子除垢剂，它有四个作用：
a. 溶解膜蛋白及脂肪，从而使细胞膜破裂；
b. 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来；
c. 对RNase、Dnase有一定的抑制作用；
d. SDS能够与蛋白质结合形成R1-O-SO3-…R2+-蛋白质复合物，使蛋白质变
蛋清溶菌酶的提取分离与活性研究
中国食品学报
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
蛋清溶菌酶的提取分离与活性研究
生吉萍 申 琳 范 蓓 姜 馗 罗云波
（中国农业大学食品科学与营养工程学院 北京１０００８３）
摘要 溶茵酶对杀菌、抗菌，提高免疫力，防止衰老都具有显著的效果。以鸡蛋蛋清作原料，加№Ｑ盐
结果图７表明在２０～５０℃的范围内，蛋清溶菌酶 相当稳定能保持较高活性；温度高于５０℃后， 酶活性明显下降，５５℃的处理，酶活性约降至原 来的Ｉ／２，６５℃的处理使活性几乎完全丧失。
从图８可看出，在３０℃下经历７２ｈ，酶活性 只略微下降。可见该酶对热具有较高稳定性，在 常温下能较长时间起溶菌作用。
！竺里型堕鱼垒！些竺堡垒堕堡堕里趔皇堕璺望塑垡里！垒竺！竺墅
底物悬液的制备：取上述菌粉０．１９，加 １０ｍＬ ０．１Ｍ ｐＨ６．２的磷酸缓冲液，用力振摇并用 玻棒研磨。静置数分钟后悬液用０．１Ｍ ｐＨ６．２的 磷酸缓冲液稀释，使它在可见分光光度计波长 ４５０ｎｍ处的ＯＤ值落在０．５～０．６之间１８ ３。
酶的活力测定方法：准确称取酶粉５ｒａｇ，用 ０．１ＭｐＨ６．２的磷酸缓冲液溶解成浓度为５０ｔｌｇ／ｍＬ 酶液。将酶液和底物悬液分别置２５℃水浴中保 温１０。１５ｍｉｎ，吸底物悬液３ｍＬ置于比色杯中比 色，此为零时读数。加入酶液０．２ ｍＬ，迅速摇 匀并从加酶液起计时，每隔３０Ｓ测一次ＯＤ４５０值， 共测三次，以每ｍｉｎＯＤ４５０值下降０．００１定为一个 活力单位Ｕ［９ Ｊ。
溶菌酶反应条件
溶菌酶反应条件
摘要：
1.溶菌酶简介
2.溶菌酶反应条件
a.温度
b.pH 值
c.离子强度
d.反应时间
3.溶菌酶反应的影响因素
a.溶剂类型
b.溶剂浓度
c.底物浓度
d.酶浓度
4.溶菌酶反应的应用
a.食品工业
b.医药领域
c.环保产业
正文：
溶菌酶是一种广泛存在于生物体内的酶，具有水解细菌细胞壁多糖的作用。它在很多领域都有广泛的应用，如食品工业、医药领域和环保产业等。了解溶菌酶反应条件对优化其应用具有重要意义。
溶菌酶反应条件主要包括温度、pH 值、离子强度和反应时间。酶活性受温度影响较大，一般在适宜的温度范围内，酶活性随温度升高而增加。但是，当温度超过最适温度时，酶活性会降低，甚至失活。溶菌酶的最适温度因种类而异，一般在37℃左右。
pH 值也是影响溶菌酶活性的重要因素。不同溶菌酶的最适pH 值不同，一般在4.5-7.0 之间。在最适pH 值下，溶菌酶的活性最高。当pH 值偏离最适值时，酶活性会降低。
离子强度对溶菌酶反应也有影响。通常情况下，离子强度越高，溶菌酶活性越低。因此，在实验过程中，应尽量选择低离子强度的溶剂。
反应时间对溶菌酶反应的影响较小，但在一定范围内，反应时间越长，酶促反应进行得越充分。但过长的反应时间会导致酶活性降低，影响反应效果。
除了上述条件外，溶菌酶反应还受溶剂类型、溶剂浓度、底物浓度和酶浓度等因素影响。溶剂类型和浓度的选择要根据实际应用需求来定，底物浓度和酶浓度的优化则需要通过实验来确定。
溶菌酶反应在食品工业中的应用主要包括提高食品的保质期、改善食品口感和提高食品的营养价值等。在医药领域，溶菌酶可用于治疗细菌感染、预防龋齿等。在环保产业中，溶菌酶可用于水处理、环境保护等方面。
溶菌酶1
溶菌酶研究现状
2010级基地班马冬珂10104109
关键词：溶菌酶基本性质活性检测酶学性质提取，分离，纯化纯度检测一：溶菌酶的基本性质：
１９０７年，Ｎｉｃｏｌｌｅ最早发表了枯草杆菌溶菌因子的报告，两年后，Ｌａｓｃｈｔｓｃｈｅｎｋｏ指出，鸡蛋也有较强溶菌活性，并把它命名为溶菌酶（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ，ＥＣ３．２．１．１７）。紧接着Ｆｌｅｍｉｎｇ和Ｍｅｙｅｒ等证实植物中也含有溶菌酶，以后人们对溶菌酶的特性有了更深入的认识。【1】
作用机制：
溶菌酶是一种广泛存在于各种动植物有机物中的糖苷水解酶，作用于Ｎ一乙酰氨基葡萄糖和Ｎ一乙酰胞壁之间的β—１，４糖苷键，能使某些细菌细胞壁中的粘多糖成分分解，破坏肽聚糖支架，在内部渗透压的作用下，细胞胀裂，细菌裂解，而人和动物细胞无细胞壁结构，也无肽聚糖，故溶菌酶对人体细胞无毒性作用，但具有溶解细胞壁的能力。【2】
溶菌酶分子量的测定：
溶菌酶原料相对分子质量测定采用ＳＤＳＰＡＧＥ凝胶电泳法测定，分离胶浓度为１２％，采用考马斯亮蓝染色。
溶菌酶是由１２９个氨基酸残基组成的碱性球蛋白，等电点在ｐＨ值１０．８左右，分子量为１４０００，化学性质非常稳定。当ｐＨ值在１．２—１１．３的范围剧烈变化时，其结构几乎不变。在酸性环境下，溶菌酶对热的稳定性很强；ｐＨ值低于４时，溶菌酶可以长期在室温下存放。其纯品为白色或微黄、黄色的结晶体或无定型粉末，无异味，，微甜，易溶于水，遇碱易被破坏，不溶于乙醚. 280nm的消光系数为13.0。酶活性可被该酶活性可被一些金属离子Cu2+，Fe2+，Zn2+（10-5～10-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+,Ca2+（10-5～10-3M）、NaCl所激活。
实验 溶菌酶的粗提取、分离纯化及酶活力、纯度及分子量测定
27
梯度洗脱方式
28
图4-39 梯度溶液的制备方法和洗脱曲线
29
（a）线性梯度；（b）凸形梯度；（c）凹形梯度；（d）编程梯度
层析柱的制备与层析操作 柱层析的设备:
层析柱、蠕动泵（恒流泵）、检测仪、 部分收集器、梯度洗脱器。
30
层析设备
层析装置： 梯度混和器 蠕动泵 层析柱 监测仪 记录仪 收集器
回收率＝
US2*V2 US1*V1
S2比活力
纯化倍数＝
S1比活力
×100％
42
7. 完成下表
样品 体积 ml
S1 V1＝
S2 V2＝
蛋 白 浓 度 总蛋白 mg/ml mg
活力 比活力 总活力 回 收 率 提 纯 倍
u/ml u/mg U
%
数
100
1
43
实验3溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定
实验目的: 1、通过实验的学习与操作，在实验过程更好的理解SDS-聚丙 烯酰胺凝胶（PAGE）测定蛋白质纯度与分子量的原理与依据； 2、掌握电泳原理以及SDS-PAGE垂直板电泳分析蛋白质技术； 3、熟悉垂直板电泳操作原理和方法，凝胶染色与脱色方法， SDS-PAGE分子量测定图谱的绘制与计算； 4、了解在电泳中分子量标准物的使用。
12
离心管
材质：玻璃， 塑料
（新编）DNA提取过程中各种试剂的作用及原理
DNA提取过程中各种试剂的作用及原理
1．溶液I—溶菌液：
溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。
2．溶液II－NaOH－SDS液：
NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。
但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。
在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1／L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。
SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：
（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。
（2）解聚细胞中的核蛋白。
（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。
但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中
（用RNase去除RNA时）受到干扰。
3. 溶液III--3mol／L NaAc（pH
4.8）溶液：NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。
所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，
不同pH值对酶活性的影响实验
不同pH值对酶活性的影响实验实验目的：
本实验旨在研究不同pH值对酶活性的影响，深入探究酶催化作用在不同酸碱条件下的特性变化，为了解酶在不同环境条件下的催化效果提供科学依据。
实验器材：
1. 酶溶液：选取一种常用酶溶液，如淀粉酶溶液。
2. 缓冲液：准备一系列不同pH值的缓冲液，如pH 4, 5, 6, 7, 8, 9的磷酸盐缓冲液。
3. 淀粉溶液：准备适量的淀粉溶液。
4. 加热设备：如电热板或炉子。
5. 容器：用于混合反应物的试管或烧杯。
6. 显色剂：如碘液或苏丹红溶液。
7. 其他常规实验器材：试管夹、移液器、计时器等。
实验步骤：
1. 在一个试管或烧杯中取适量的酶溶液。
2. 添加相同体积的淀粉溶液，使其充分混合。
3. 在实验过程中，先将加热设备预热至适宜温度（通常为酶的最适温度）。
4. 使用移液器向试管中加入预先调好pH值的缓冲液，确保每个试管的缓冲液体积相同。
5. 在每个试管中加入相同体积的混合溶液（酶溶液和淀粉溶液），立即启动计时器计时。
6. 在设定的反应时间结束后，立即将试管放入预热的加热设备中加热一段时间（如1分钟），停止酶的活动。
7. 取出试管，添加适量的显色剂，观察溶液颜色的变化。颜色的变深表示淀粉的降解程度。
8. 重复以上步骤，进行其他pH值的实验。
实验结果：
根据实验观察和颜色变化的深浅，记录每个pH值下的淀粉降解程度。以颜色的深浅为指标，可以定量分析不同pH值下酶活性的高低。
实验数据处理及分析：
将颜色的变化程度与每个pH值对应，得到实验数据。可以绘制曲线或制作柱状图来表示不同pH值下的酶催化作用效果。
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2011届本科毕业生毕业论文
题目：PH、金属离子在溶菌酶提取过程中对酶活性的影响
作者姓名徐萧苟真汪磊
指导教师刘秀丽
学科专业生物技术
系别生命科学与技术学院
学号2007221121 2007221102
2007221115
提交论文日期2011年6月2日
PH、金属离子在溶菌酶提取过程中对酶活性的影响
徐萧苟真汪磊
指导老师：刘秀丽
（陇东学院生命科学与技术学院甘肃庆阳 745000）
摘要:本实验采用盐析法从鸡蛋清中提取溶菌酶，通过在提取过程中施以不同的PH和加入不同的金属离子，来测定其对提取的溶菌酶活性的影响。结果表明酶活性在PH6.0-6.5最强、且在5-7范围内较稳定；金属离子中Na+、K+对其活性有轻微激活作用。Mn2+、Mg2+对溶菌酶活性无明显影响，Ca2+、Cu2+、Fe2+、Zn2+使溶菌酶活性下降。
关键词：盐析蛋清溶菌酶；酶活性；影响因素；金属离子；提取；PH
Ph, Metal Ions In Mind The Enzymes Are Extracts Of The Enzyme Activity
Xuxiao gouzhen wanglei
（Gansu College of Life Science and Technology, Biotechnology, 07 classes in
Qingyang 745000）
Abstract: Objective To study the extraction process of egg white lysozyme PH, metal ions on enzyme activity levels.Methods: egg white lysozyme in the extraction process or by changing the PH by adding various metal ions the size of the different factors to determine the results of the activity of egg white lysozyme was observed enzyme activities. The results of activity of the strongest in the PH6.0-6.5 and was stable in the range 5.0-7.0; metal ions in the Na +, K + activation of its activity slightly. Mn2 +, Mg2 + had no effect on the activity of lysozyme, Co2 +, Ca2 +, Cu2 +, Fe2 +; Zn2 + is the activity of lysozyme decreased. Conclusion Preliminary results showed that acid extraction of lysozyme as part of the environment and enhance the metal ions for their activity and reduce the effect
Keywords ：out truffles are an enzyme ;enzyme activity ; factors influencing Metal ion; extraction;pH;
0引言
溶菌酶(Lysozyme),正式名为N-乙酰基糖胺酶（N-lhexosaminodase）,属胞壁质酶
（muramidase）, 有称N-乙酰胞壁质酶，能选择性地分解微生物的细胞壁而具有杀菌、抗病毒、抗肿瘤细胞等功效，在食品工业、医疗、生物学领域有着广泛的应用[1]。当前、可以从牛、羊、马等动物乳汁中分离溶菌酶，从番木瓜、无花果、大麦、卷心菜等植物中也可分离溶菌酶。溶菌酶在临床现象常用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔溃疡、水痘、带状疱疹和扁平疣等。在食品工业上中还可以作为防腐剂。利用溶菌酶处理革兰阳性菌还可得到原生质体，因此，溶菌酶也是基因工程、细胞工程中细胞融合操作必不可少的工具酶。因此，开发溶菌酶具有良好的经济价值和研究价值[2-4].
国内上市制剂有溶菌酶含片和肠溶片两种，尚未有溶菌酶液体制剂上市。目前使用的溶菌酶为鸡蛋清溶菌酶，为C型溶菌酶，从人乳汁、尿和胎盘中提取的溶菌酶也属于C型。鸡蛋清溶菌酶占蛋清总蛋白3.5%左右，作为溶菌酶类的典型代表是目前重点研究对象。本文为了拓展溶菌酶应用，对蛋清溶菌酶的酶学活性质进行研究，探讨PH、常见金属离子对其在提取过程中活性的影响，以期提高酶提取纯度和酶活。
1 仪器与材
1.1 材料
溶菌酶(15000U/mg)、枯草芽孢杆菌、牛肉浸取物、蛋白胨、琼脂等；
生化药品：PBS缓冲液、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸铵、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、利丙酮等。鲜鸡蛋：市售。
1.2主要仪器
722型分光光度计、电子天平、离心机、超净工作台、烧杯、量筒、漏斗、离心管、定性快速滤纸、移液管（10mL）、移液枪、试管及试管架
2 试验方法
2.1培养基的配制
2.11 液体培养基葡萄糖20g,蛋白胨15g,氯化钠5.0g，牛肉膏0.5g,琼脂20g,调PH至7.0，定溶于1L蒸馏水中，封装与三角瓶中，121℃灭菌15min。
2.12 固体培养基液体培养基加琼脂2%，调PH至7.0，置于1L水蒸馏中，加热溶解，封装于斜面中，121℃灭菌15min[5-6].
2.2 蛋清液的配制
选择新鲜鸡蛋，用水清洁掉蛋壳表面的不洁之物，破壳分离蛋清，将蛋清搅拌稠度均匀，以不引起泡沫为宜，防止蛋白质变性，用双层纱布滤去卵带和碎蛋壳。