CTAB法提取细菌DNA教学资料
实验一-DNA提取
实验一-DNA提取实验一DNA的小量制备小量法提取植物基因组DNA（CTAB法）1 实验目的：随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern 分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。
本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法，进一步了解DNA 的性质。
2 实验原理细胞中的DNA 绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。
提取DNA 时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA 从抽提液中沉淀出来。
DNP 与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。
以NaCl 溶液为例：RNP 在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1％。
当NaCl 浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP 的溶解则随之不断增加。
当NaCl 浓度大于1mol/L 时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2 倍，因此通常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。
为了得到纯的DNA 制品，可用适量的RNase 处理提取液，以降解DNA 中搀杂的RNA。
关于植物总DNA 的提取主要有两种方法：1．CTAB 法：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。
CTAB法枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)基因组DNA的提取
CTAB法枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）基因组DNA的提取内容提要以枯草芽孢杆菌为材料，采用CTAB法（十六烷基三甲基溴化铵）提取枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的基因组DNA作为基因扩增的模板，并测定其含量和纯度。
本实验要求：提取高质量的基因组DNA为下一步的基因操作准备。
原理高纯度、高分子量的基因组DNA是构建基因组文库、Southern 杂交(包括RFLP)及PCR等后续的分子生物学操作的基础。
利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。
加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA 即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中，可用玻棒将其取出，而小分子DNA 则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。
在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA 时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓，以保证得到较长的DNA。
一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb 以上，否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。
而进行RFLP 和PCR 分析, DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下)，并可保证包含PCR 所扩增的片段(一般2kb 以下)。
不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同；不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。
在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA 大分子。
尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR 反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA 时, 应考虑除去多糖和酚类物质。
DNA的含量与纯度在研究工作中十分重要，常常需要测定。
目前使用较多和较简便的是紫外吸收法。
核酸在260nm波长有一特征吸收峰，根据其光密度（OD）值可计算DNA浓度。
ctab法提取dna的原理
ctab法提取dna的原理
CTAB法（Cetyltrimethylammonium Bromide）是一种常用于
提取DNA的方法，原理是利用CTAB结合DNA形成稳定的DNA-CTAB复合物。
与DNA相结合的CTAB可以将其他细
胞组分如蛋白质和RNA等溶解。
下面将介绍CTAB法的操作
步骤：
1. 准备样品：将待提取DNA的生物材料如植物叶片或动物组
织切碎，并放入离心管中。
2. 加入CTAB溶液：向离心管中加入含有CTAB的提取缓冲液，CTAB会结合DNA并分离细胞组分。
3. 细胞破碎：将离心管置于60-65°C的水浴中，短暂加热使细
胞完全破碎。
4. 酚/氯仿提取：加入等体积的酚/氯仿混合液，轻轻摇匀并离心。
这一步可以将DNA从细胞残渣和其他溶解物中提取出来。
5. DNA沉淀：将上清液转移到新的离心管中，加入等体积的
异丙醇，再次轻轻摇匀。
在冰上静置几分钟后离心，可使
DNA沉淀到离心管底部。
6. 溶解DNA：倒掉上清液，加入70%乙醇洗涤DNA沉淀，
离心去除乙醇。
再次离心后，将残留的乙醇洗涤液倒掉，将离心管倒置在纸巾上，将DNA自然风干。
通过以上步骤，利用CTAB法可以提取到高质量的DNA样品。
此方法的优势在于CTAB的高度阳离子性可以有效溶解其他
细胞组分，而不影响DNA的稳定性。
同时，CTAB法适用于
不同种类的生物材料，如植物，微生物和动物组织等。
ctab法提取dna流程
CTAB法提取DNA流程引言DNA提取是分子生物学和遗传学研究中的基础实验之一，它可以用于从各种生物样品中纯化DNA，并用于进一步的分析和研究。
CTAB法是一种常用的DNA提取方法之一，其在提取DNA时使用了CTAB作为离子相互作用剂，能够有效地纯化DNA。
本文将详细介绍CTAB法提取DNA的流程。
实验材料与设备•样本：细菌、植物或动物组织样本•CTAB提取缓冲液：含有CTAB、EDTA和TRIS的缓冲液•醇类溶液：包括乙醇和异丙醇•氯仿•甲醇•高盐溶液：含有NaCl和CTAB的溶液•TE缓冲液：含有TRIS和EDTA的缓冲液•离心管•离心机•热平台实验步骤1. 样本处理1.将样本收集或制备成细胞输液。
2.使用离心机将细胞输液离心，分离得到细胞沉淀。
2. 细胞裂解1.向细胞沉淀中加入适量的CTAB提取缓冲液，并充分混匀。
2.放置于热平台上，在适当的温度下，通常为60°C-65°C，孵育一段时间，使细胞充分裂解。
3. 蛋白质沉淀1.将蛋白质沉淀剂（氯仿）加入到裂解液中，充分混匀。
2.离心管盖住盖子，以高转速离心，使裂解液分为上清液和沉淀两部分。
4. DNA沉淀1.将上清液转移到新的离心管中。
2.加入等体积的醇类溶液，充分混匀。
3.放置于冰箱中，使DNA在醇类溶液中沉淀。
5. DNA洗涤1.使用离心机将DNA沉淀离心，将上清液倒出，注意不要破坏DNA沉淀。
2.加入预冷的85%乙醇，使DNA沉淀溶解。
3.放置于冰箱中，使DNA在乙醇中沉淀。
4.重复以上步骤，直至DNA沉淀洗涤干净。
6. DNA溶解1.使用离心机将DNA沉淀离心，将上清液倒出。
2.加入适量的TE缓冲液，使DNA沉淀溶解。
结果与讨论通过CTAB法提取DNA的流程，我们可以成功地从细菌、植物或动物组织样本中获得高质量的DNA。
这种方法利用CTAB作为离子相互作用剂，能够有效地去除细胞的蛋白质和其他杂质，从而纯化DNA。
在DNA溶解的步骤中，使用TE缓冲液可以保护DNA的稳定性并提高其质量。
DNA提取(CTAB法)
CTAB法提取细菌总DNA
先用试剂盒提取DNA，未成功则采用此方法。
（1）将供试细菌纯培养后接入LB液体培养基，28℃震荡培养24h，取振荡培养LB液体细菌培养物，10000r/min离心10min，收集菌体装入1.5ml的离心管中。
（2）每30mg菌体加1mL菌体裂解液悬浮沉淀，加溶菌酶（50mg/mL）5μL，混匀，37℃保温20min。
（3）加RNase(10mg/mL)5μL，37℃保温30min。
（一般PCR这步可省略）
（4）加蛋白酶K（20mg/mL）20μL，混匀，65℃保温1h。
（5）用等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提，12000r/min 离心10min，取上清于另一离心管，重复抽提一次。
（6）用等体积氯仿：异戊醇（24：1）抽提一次，12000r/min 离心10min，取上清于另一离心管。
（7）加0.1V醋酸纳溶液（pH 5.2）和2V无水乙醇，混匀，-20℃沉淀1-2h。
（8）4℃ 12000r/min 离心10min，收集沉淀，70% 乙醇洗涤沉淀2次，干燥后溶解于适量的TE中，-20℃保存备用。
细菌基因组的提取--CTAB
细菌基因组的提取—-CTAB法准备试剂：TE缓冲液10%的SDS20mg/ml蛋白酶K（分装好后保存于-20度）5MNaClCTAB/NaCl溶液24:1氯仿：异戊醇25:24:1酚：氯仿：异戊醇异丙醇70%乙醇3M乙酸钠（pH5.2）50ml的离心瓶实验流程：1、将过夜培养的阴沟肠杆菌（Amp抗性）种子菌按1%的接种量转接于一瓶100mL液体LB培养基中，37度，200rpm培养月2h,使其进入对数期（OD600为0.6）。
2、离心收集菌体（4000义例如在转子的离心机上是）,倒掉上清。
3、收集好的菌体用9.5mLTE缓冲液重悬（重悬的时候要轻柔），并加入0.5mL10%SDS和50比20mg/mL的蛋白酶K,轻轻的颠倒试管是溶液混合充分，于37度水浴1h。
（处理完后的溶液应该很粘稠，不需要用溶菌酶预先处理）4、向上步的处理液中加入1.8mL5MNaCl,充分混匀。
（这一步至关重要，因为在室温若是盐离子浓度下降至0.5M时，就会形成CTAB-核酸沉淀，CTAB能与细胞壁碎片、变性的蛋白质及多糖形成复合体，而核酸仍然存在于溶液中）5、向上步溶液中加入1.5mLCTAB/NaCl溶液，充分混匀后于65度水浴10min。
6、用等体积的氯仿：异戊醇抽提，混合充分后，室温6000又离心（转子的离心机上是）7、将上层水相用大口径的移液枪将其转移到另一干净管中。
（若是基因组含量很高的话上层水相将会非常粘稠，可以另外再用氯仿：异戊醇或是酚：氯仿：异戊醇进行抽提）8、用0.6倍体积的异戊醇沉淀收集的上清（加入异丙醇后混合充分静置约10min）,这时会出现白色絮状沉淀，将白色絮状沉淀转移另一干净的EP管中，用1mL70%乙醇清洗。
9、10,000义（转子的离心机上是）离心去掉上清，沉淀用真空冷冻机抽干，溶于mLTE缓冲液（这一过程可能要很长一段时间。
几个小时甚至是过夜，也可以吧它放于60度以加快DNA的溶解）小提：1、生长到对数期离心收集菌体2、收集好的菌体用567L TE缓冲液重悬（重悬的时候要轻柔），并加入3L10%SDS 和3L20mg/mL的蛋白酶K,轻轻的颠倒试管是溶液混合充分，于37度水浴1h。
(完整版)CTAB法提取DNA原理及步骤、制胶、电泳
CTAB法提取DNA的原理及步骤：冷冻的植物组织，在低温干燥状态下机械磨碎。
通常精提DNA，都要加液氮使材料变脆，易于研磨。
低温降低了DNase的活性，利用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）去污剂溶解细胞膜，使核蛋白等解聚，使DNA游离出来。
CTAB作为一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，与核酸形成复合物，可使核酸沉淀出来。
通过离心将CTAB-核酸复合物语糖类、蛋白质等分离开来。
随后将复合物溶于高盐溶液中，再加乙醇使核酸沉淀，而CTAB溶于乙醇，从而去除CTAB 。
1.研磨2.加1000ul预处理液，10-15min，4000r，10min,弃上清（重复）预处理液：Tris-hcl (PH8.0)提供缓冲环境，防止核酸被破坏。
EDTA （螯合二价阳离子）0.5M抑制DNase活性。
Nacl 5M提供高盐环境，使DNA充分溶解。
β-巯基乙醇抗氧化剂，去除酚，糖，能与酚形成络合物，也可与糖结合。
3.加800ul2×CTBA(预热），10ul β-巯基乙醇，65℃水浴1-2h。
15min 震荡4.冷至室温，离心1000r ,10min ,取上清750ul，加800ul氯仿-异戊醇（24:1），抽提10min，1000r，15min,重复3次。
氯仿：加速有机相与水相分层，去除核酸溶液中残余酚，抽提蛋白质等杂质。
5.取上清，加2倍体积的无水乙醇，-20℃,1h,沉淀DNA.无水乙醇：DNA不溶于酒精，CTAB和一些蛋白质可以，低温乙醇可抑制DNase 活性，降低分子运动，易于DNA沉淀。
6. 4℃，1000r,10min,倒乙醇，收集DNA.7. 70％乙醇洗涤2遍，风干（不可太干），溶于40-60ul dd水。
DNA在凝胶中涌动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
由于相同数量的双链DNA几乎具有等量的静电荷，因此能以同样的速率向正极移动。
在一定电场强度下，DNA分子的歉意速率取决于分子筛效应，即DNA本身的大小。
CTAB法提取细菌Total_DNA原理
CTAB法提取细菌Total DNA原理CTAB法原理CTAB(Hexadecyltrimethy Ammonium Bromide，十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。
阳离子表面活性剂，呈白色或浅黄色结晶体至粉末状。
易溶于异丙醇，可溶于水，熔于热水、乙醇、三氯甲烷，微溶于丙酮，不溶于醚和苯。
在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。
通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
CTAB提取缓冲液的经典配方：Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNA充分溶解于液相；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除；PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
1.用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。
用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。
蛋白分子溶于酚相，而DNA 溶于水相。
使用酚的优点:有效变性蛋白质；抑制了DNase的降解作用。
缺点：能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA；不能完全抑制RNase的活性。
2.氯仿的作用？氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。
最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。
（酚易溶于氯仿中）用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡；降低表面张力，从而减少气泡产生；另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
CTAB法提取DNA简要步骤
1，取超低温保存的叶片样本，研钵磨碎后加入2.0ml离心管中(加入的叶片粉末量没过2.0ml 离心管的底部的尖端即可)。
2，迅速加入65℃预热过的CTAB 800μl（2%CTAB，使用前加入0.5-1% β-巯基乙醇），混合均匀后放入65℃水浴一小时。
每十分钟摇动一次，使CTAB与叶片样本充分混匀。
3，取出离心管至常温，放置2分钟后加入800μl氯仿/异戊醇（24:1）混合液，将混合液与CTAB混匀后缓缓摇动1-2分钟，使CTAB与氯仿充分接触。
4，12000rpm离心5-10分钟，小心吸取上清液至新的2.0ml离心管中，再次加入700μl氯仿/异戊醇混合液，缓缓混匀1-2分钟后，再次离心，吸取上清液至1.5ml离心管中。
5，迅速向1.5ml离心管中加入等体积的-20℃预冷过的异丙醇，混匀，-20℃放置2小时左右。
6，将-20℃保存的离心管取出，12000rpm离心5-10分钟，弃去液体，DNA应沉淀在离心管底部。
7，加入1ml 70%乙醇洗涤DNA沉淀（甩一下离心管让DNA沉淀飘起来就行），洗涤两次。
8，将乙醇洗涤过的DNA风干（超净工作台吹一下或者真空浓缩仪）。
9，风干后用50-80μl ddH2O溶解，待用。
本步骤一定不要多加水，SNP需要较高浓度DNA。
CTAB法抽提DNA
1.4M 0.2%(v/v)
称取 CTAB（十六烷基三甲基溴化铵） 2g，NaCl 8.18g，量取 1M pH8.0 Tris-HCl 母液 10mL，
0.5M pH8.0 EDTA 母液 4mL，巯基乙醇 0.2mL，加入超纯水定容至 100mL，于室温保存。
Edited by Jeff Zhan 2010-1-15
心 15min。 5、 用剪去枪尖的枪头吸取上清，转移至新的 EP 管中，用 P:C:I 再次抽提，12000rpm，4℃离
心 10min（一般用 P:C:I 抽提 2-3 次至无蛋白膜出现）。 6、 收集上清，转移至新的 EP 管中，加入等体积（600µL）的异丙醇，混匀，于-20 冰箱中 20min
第
五
工
作
室
CTAB 法提取细菌总 DNA
1、 菌体收集：将纯化的供试菌株分别接种到 5mL TY 培养液中，28℃、130r/min 震荡培养 3-5d, 8000r/min 离心，每次 5min,收集菌体于 1.5mL Eppendorf 管中。
2、 加入 2×CTAB 抽提 buffer 600µL 于 EP 管中。 3、 65℃水浴 30min，温浴过程中不时上下翻转 EP 管（防止后续加入 P:C:I 时喷出）。 4、 加入等体积（600µL）的 P:C:I（苯酚:氯仿:异戊醇 25:24:1），充分摇匀后 12000rpm，4℃离
小时，至无酒精味，管壁干燥。 10、加 50µL 超纯灭菌 ddH2O，轻敲离心管，溶解 DNA。 11、电泳检查，-20℃保存。
溶液配制
2×CTAB 抽提 buffer: 主要成分
终浓度
CTAB
2%(m/v)
Tris-HCl(pH8.0)
CTAB法提取DNA简要步骤
1，取超低温保存的叶片样本，研钵磨碎后加入2.0ml离心管中(加入的叶片粉末量没过2.0ml 离心管的底部的尖端即可)。
2，迅速加入65℃预热过的CTAB 800μl（2%CTAB，使用前加入0.5-1% β-巯基乙醇），混合
均匀后放入65℃水浴一小时。
每十分钟摇动一次，使CTAB与叶片样本充分混匀。
3，取出离心管至常温，放置2分钟后加入800μl氯仿/异戊醇（24:1）混合液，将混合液与
CTAB混匀后缓缓摇动1-2分钟，使CTAB与氯仿充分接触。
4， 12000rpm离心5-10分钟，小心吸取上清液至新的2.0ml离心管中，再次加入700μl氯仿/异戊醇混合液，缓缓混匀1-2分钟后，再次离心，吸取上清液至1.5ml离心管中。
5，迅速向1.5ml离心管中加入等体积的-20℃预冷过的异丙醇，混匀，-20℃放置2小时左
右。
6，将-20℃保存的离心管取出，12000rpm离心5-10分钟，弃去液体，DNA应沉淀在离心
管底部。
7，加入1ml 70%乙醇洗涤DNA沉淀（甩一下离心管让DNA沉淀飘起来就行），洗涤两
次。
8，将乙醇洗涤过的DNA风干（超净工作台吹一下或者真空浓缩仪）。
9，风干后用50-80μl ddH2O溶解，待用。
本步骤一定不要多加水，SNP需要较高浓度DNA。
CTAB法抽提真菌DNA
提取液：
1M Tris.HCl pH8.0 10ml
0.5M EDTA pH8.0 4ml
CTAB 2g
NaCl 8.176g
巯基乙醇2ml（使用时加入）
加70ml ddH2O溶解定容至98ml
步骤：
1.在液氮中研磨菌丝体，直到菌丝体研磨成解决白色细粉
2.将菌丝体装入1.5ml离心管中，加入600μlCTAB提取液，于62-65℃水浴中加热1h，
间或振荡数次
3.加入600μlTris饱和酚：氯仿：异戊醇（25:24：1），【现用现配，按比例混匀后再加入
管中】，温和振荡几次，然后在12000rpm下离心15分钟
4.取上清至新的离心管中，然后加入1/10体积的3M/L NaAc，1倍体积的异丙醇，轻柔
混匀，在-20℃下静置30-60分钟，在12000rpm下离心5分钟
5.离心后去上清，沉淀用70％乙醇润洗2次
6.加入适量的TE缓冲液溶解沉淀，
7.加入1μl RNase（10mg/ml）37℃水浴1小时
8.加入1倍体积的饱和酚：氯仿：异戊醇（25:24：1），【现用现配，按比例混匀后再加入
管中】，温和振荡几次，然后在12000rpm下离心15分钟，取上清至新的离心管
9.加入1倍体积的氯仿，温和振荡几次，在12000rpm下离心15分钟，取上清至新的离
心管中
10.加入2倍体积无水乙醇，-20℃静置30分钟以上，8000rpm离心12分钟
11.去除上清，沉淀用70％乙醇润洗2次，加入100μl TE缓冲液溶解沉淀，放入-20℃存
放，待电泳检测。
CTAB法提取DNA
CTAB法提取DNA:1.一部分DNA提取缓冲液冰浴;2.将1.5%(w/v)CTAB加入另一部分DNA提取缓冲液充分溶解至提取液完全透明，于65“C左右加入1%琉基乙醇混匀;3.取39样品在研钵中加入液氮研磨;4.取20ML冰浴的DNA提取缓冲液加入到研磨好的样品，混匀，上下颠倒2 min;4000印m，4oC，离心15min;弃上清液;5.将20mlCTAB提取液加入离心管，混匀后放入65OC水浴60一90min，隔30，nin取出上下轻轻颠倒几次;6.水浴后，加入15ml氯仿:异戊醇(24:l)，上下晃动10min以上，4000印m常温离心巧min，吸取上清液至另一新50ml离心管中;7.重复步骤6;8.加入巧ml冷冻的异丙醇，轻轻颠倒数次，混匀后一20“C冰冻30min沉淀DNA;9.4000甲m离心10min，弃上清液，加入5ml76%乙醇(含10mMN玩Ac)浸泡过夜(中途换2一3次乙醇);10.8000甲m离心5min，弃乙醇风干沉淀约半小时，每管加入3mlTE和20林l 20、，g/ml洲aseA，37OC温浴过夜;11.将溶液转入一10ml离心管，加入3ml苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:l)充分颠倒混匀，4000rpm离心巧min，吸上清液于另一10ml离心管中;12.加入1ml5MNaCI和3ml水饱和乙醚，充分混匀，4000甲m离心10min;13.弃乙醚，用20闪枪头挡住离心管管口内侧，用力下压枪头，使枪头与管壁间形成一狭缝，使下清液从缝中流入另一10ml离心管;14.加入15ml冷冻的异丙醇，轻轻颠倒数次，混匀后一20OC冰冻30min，4000 rpm离心10min，弃上清液，加入3m170%乙醇浸泡过夜(中途换2一3次乙醇)。
DNA提取与纯化CTAB法
玉米基因组DNA的大量提取（改良的CTAB法）1. 取约5.0g玉米叶片于液氮中研磨，转入50ml 离心管中。
2. 加10ml预热至65℃的CTAB提取缓冲液，混匀。
3. 65℃水浴60-90分钟，不时小心摇动离心管。
4. 取出离心管，待冷至室温（25℃），加入等体积氯仿∶异戊醇（24∶1），小心充分摇动试管，至有机相呈深绿色。
5. 室温下8000rpm离心10分钟，用剪口的1ml枪头将上清转移到另一离心管中。
6. 加2/3体积预冷的异丙醇（–20℃），小心混匀，用剪口的1ml枪头吸出絮状DNA，用70%乙醇漂洗两遍。
7. 将DNA晾干，加入适量TE（pH8.0）溶解DNA。
8. 加入10μl 10mg/ml RNaseA小心混匀，37℃温育2小时。
9. 用等体积酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）和氯仿∶异戊醇（24∶1）各抽提一次，室温下8000rpm离心10分钟，吸取上清液，加1/10体积的3M NaAC（pH5.2）、2倍体积无水乙醇沉淀DNA。
10. 吸出絮状DNA，放入1.5ml离心管中，用70%乙醇洗涤一次，短暂离心，倒去乙醇，晾干DNA沉淀。
11. 加入适量TE（pH8.0）缓冲液，充分溶解DNA。
12. 琼脂糖检测DNA质量。
13. 检测DNA浓度，存在-20℃冰箱中备用。
注：红色部分为DNA纯化程序DNA纯化步骤1、DNA提取晾干后，加入适量TE（pH8.0）溶解DNA。
2、加入10μl 10mg/ml RNaseA小心混匀(1min慢摇)，37℃温育2小时。
3、用等体积酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）和氯仿∶异戊醇（24∶1）各抽提一次。
1）如DNA每管加TE50ul,则每管加以上混合液总体积也为50ul2）加入混合液后慢摇10min,室温下8000rpm离心10分钟，此时可提前将2ml 离心管写好编号3）吸取上清液（用剪好口的黄枪头）。
4）注意：用氯仿和异戊醇抽提时，上清液体积减小，加混合液的体积也相应减小。
CTAB法提取微生物DNA
CTAB法提取微生物DNACTAB法提取细菌DNA一.细菌总DNA提取1.将菌株接种于液体LB培养基中，37℃震荡培养过夜。
2.取1.5ml培养物12000rpm离心2min。
3.沉淀物加入567μl的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30μl 10%SDS和15μl的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h。
4.加入100μl 5mol/L NaCl，加入80μl CTAB/ NaCl溶液，混匀后65℃温育10min。
5.加入等体积酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min，将上清转入另一只离心管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混匀直到DNA沉淀下来，沉淀可稍微离心。
6.沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇，在洁净工作台稍加干燥，重溶于20μl TE缓冲液（含RNaseA＜25ng/ml）中，准备电泳检测。
二．琼脂糖凝胶电泳。
1. 制胶：称取琼脂糖粉末，置于三角瓶中，加入TAE缓冲液配成0.8%的浓度，加热脂使琼脂糖全部融化于缓冲液中，待溶液温度降至65℃时，立即倒入制胶槽中，插入样品梳。
在室温放置0.5-1h，待凝胶全部凝结后，轻轻拔出样品梳。
然后在电泳槽中加入电泳缓冲液直到没过凝胶为止。
2.加样：取0.5-1 ug 左右的样品，体积为10-20ul，加入1/4体积的溴酚兰-甘油指示剂，混匀后小心地加到样品槽中。
同时另取一个已知分子量的标准DNA 水解液，在同一凝胶板上进行电泳。
3. 电泳：维持恒压100V，电泳0.5-1h，直到溴酚兰指示剂移动到凝胶底部，停止电泳。
4. 染色：将凝胶取出后浸入0.5mg/ml 溴乙啶溶液中，染色0.5-1h。
染液可反复多次使用。
5. 观察：将凝胶板置于254nm波长紫外灯下进行观察。
DNA存在的位置呈现橙黄色荧光。
CTAB法提取真菌DNA1. 真菌培养菌丝，真空抽滤后，无菌水洗涤3次，再用80％乙醇洗1次。
2. 取50mg左右吸干的新鲜菌丝，加入600ul2×CTAB 提取缓冲液(含0.7mol/L NaC1，100mmol/L Tris-HC1 pH8.0，20 mmol/L EDTA ，10 g/L PVP-360，20g/LCTAB ,0.1％13-巯基乙醇) ，少许灭菌石英砂，在研钵中将菌丝充分研磨。
CTAB法提取细菌Total_DNA原理
CTAB法提取细菌Total DNA原理CTAB法原理CTAB(Hexadecyltrimethy Ammonium Bromide，十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。
阳离子表面活性剂，呈白色或浅黄色结晶体至粉末状。
易溶于异丙醇，可溶于水，熔于热水、乙醇、三氯甲烷，微溶于丙酮，不溶于醚和苯。
在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。
通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
CTAB提取缓冲液的经典配方：Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNA充分溶解于液相；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除；PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
1.用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。
用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。
蛋白分子溶于酚相，而DNA 溶于水相。
使用酚的优点:有效变性蛋白质；抑制了DNase的降解作用。
缺点：能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA；不能完全抑制RNase的活性。
2.氯仿的作用？氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。
最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。
（酚易溶于氯仿中）用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡；降低表面张力，从而减少气泡产生；另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
(完整版)实验一CTABNaCl法细菌基因组DNA提取
实验一CTAB/NaCl 法细菌基因组DNA提取一、培养基A. LB培养基（1L）胰蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g pH调至7.0二、菌种大肠杆菌野生型三、缓冲液A. 1M Tris-HCl ( pH 8.0, 1L)1.称量121.1 g Tris置于l L烧杯中，加入约800 ml的ddH2O，充分搅拌溶解，加浓HCl约42ml，将溶液定容至1 L。
C. TE缓冲液（pH 8.0）10 mmol/L Tris-Cl (pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)D. 10% SDS溶液10 gSDS，定容至100mlE. CTAB/NaCl缓冲液CTAB 4gNaCl 16.364 g1M Tris-HCl 20ml ( PH8.0)0.5M EDTA 8ml先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌，冷却后0.2-1% β-巯基乙醇（400ul）。
F. 5mol/L NaCl溶液292.5 gNaCl了，定容至1LG. 氯仿：异戊醇（24：1）480ml氯仿+20ml异戊醇，混匀存放至棕色瓶备用。
H. 酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）250mlTris饱和酚+240ml氯仿+10ml异戊醇，混匀存放至棕色瓶备用。
I. 上样缓冲液（6×）0.25%溴酚蓝，20%蔗糖J. 电泳缓冲液（1×, 1L）Tris碱10.8g，硼酸5. 5g，0.5mol/L EDTA （pH8.0）4ml, 用ddH2O定容至1L。
K. 0.7%琼脂糖凝胶（100 ml）0.7 g琼脂糖凝胶, 加入1×电泳缓冲液，微波炉加热至凝胶完全融化即可三、实验具体步骤1、接种一单菌落于5mlLB中, 30℃培养过夜,2、取1ml种子培养液接入100ml LB中, 37℃、220r/min培养16小时;3、5000r/min离心10分钟,弃去上清。
4、加入10mlTE离心洗涤后,用10mlTE溶解菌体,混匀。
CTAB提取DNA
植物基因组DNA的提取与纯化（改良的CTAB法）：步骤：1)取新鲜叶片放入1.5ml离心管，加液氮研磨成粉末状；2)加600μl预热的（65℃）2%CTAB，摇匀后，置65℃水浴中1h。
期间，倒转离心管数次，1h后从水浴中拿出，冷却至室温；3)加600μl氯仿/异戊醇（24:1）混匀，12000rpm离心10min（室温）；4)小心吸取上清，加入到含有2倍体积预冷（-20℃）无水乙醇的1.5ml离心管中，充分静置至白色絮状沉淀出现；5)用白色枪头挑出沉淀，放入1.5ml离心管中，用70%的乙醇（500μl）冲洗两次，再用无水乙醇冲洗一次，自然干燥；6)加入100μl 0.1×TE溶解DNA；7)加入1-2μl RNase（1mg/ml），37℃水浴1h后冷却；8)加入400ulddH2O,再加入500μl氯仿/异戊醇（24:1）充分混匀后，12000rpm离心10min（4℃）；9)小心吸取上清，加入到已加入2倍体积预冷（-20℃）无水乙醇和1/10体积3M乙酸钠（pH 5.2）或NH4AC（10M）的1.5ml离心管中，充分静置至沉淀出现；10)12000rpm离心10min（4℃），小心倒去乙醇，用70%的乙醇冲洗沉淀两次后再用无水乙醇冲洗一次，自然干燥；11)最后，加入100μl 0.1×TE充分溶解，取部分溶液用0.8%的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计法检测DNA的浓度和纯度，最后置于-20℃冰箱中保存备用。
2.3.2 DNA的鉴定：DNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。
因此，可以在260nm波长下进行分光测定DNA浓度，OD 值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。
如用1cm光径，用H2O稀释DNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA(mg/ml) =50×OD260读数×稀释倍数/1000。
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C T A B法提取细菌
D N A
【目的和要求】
1. 学会CTAB法提取细菌总DNA。
2. 掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳法。
【实验原理】
DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在的，因此提取出脱氧核糖核蛋白复合物后，必须将其中蛋白质去除。
CTAB（溴代十六烷基三甲胺）是一种去污剂，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中可溶并且稳定存在，若降低盐浓度，CTAB与核酸的复合物会沉淀出来，而大部分蛋白和多糖仍溶于溶液中。
DNA的电泳原理与蛋白质的电泳原理基本相同。
DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
由于DNA分子或DNA片断的分子量差别，电泳后呈现迁移位置的差异。
【实验试剂和器材】
（一）试剂：
菌株（E.coli）；蛋白酶K（20mg/ml）；琼脂糖；标准DNA水解液
1. 10%SDS
2．酚/氯仿/异戊醇（1/1/1）
3. 异丙醇；70%乙醇
4．LB培养基：蛋白胨10g, 酵母粉5g, NaCl 10g加蒸馏水至1升，然后灭菌备用。
5．TE缓冲液：10mM Tris• HCl, 0.1mM EDTA (pH8.0)。
6． CTAB/NaCl溶液(5% w/v)：5g CTAB 溶于100ml 0.5M NaCl溶液中，需要加热到65℃使之溶解，然后室温保存。
7．TAE缓冲液（50×） (pH8.0)：每升溶液中含有242g Tris, 57.1ml 冰乙酸，100ml 0.5mol/L EDTA。
电泳时稀释成1×浓度使用。
8．溴酚兰-甘油指示剂：先配制0.1%溴酚兰水溶液，然后取1份0.1%溴酚兰溶液与等体积的甘油混合即成
9．0.5ug/ml 溴乙啶染液：称取5mg溴乙啶，用重蒸水溶解定容到10ml, 取1ml 此溶液用1xTAE缓冲液稀释到1升，最终浓度为0.5ug/ml。
（二）器材：
锥形瓶（250ml），1.5ml 离心管，水浴锅，离心机，电泳槽，电泳仪，摇床，移液枪，洁净工作台，电磁炉，紫外成像仪
【实验方法】
（一）细菌总DNA的提取
1. 将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。
2. 取1.5ml培养物12000rpm离心2min。
3. 沉淀物加入567 ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul 10%SDS 和15ul的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h.。
4. 加入100ul 5mol/L NaCl, 充分混匀，再加入80ul CTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。
5. 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min, 将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。
6. 沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇，在洁净工作台中稍加干燥，重溶于20ul TE缓冲液(含RNaseA﹤25ng/ml)中，准备电泳检测。
（二）琼脂糖凝胶电泳
1. 制胶：称取琼脂糖粉末，置于三角瓶中，加入TAE缓冲液配成0.8%的浓度，加热使琼脂糖全部融化于缓冲液中，待溶液温度降至65℃时，立即倒入制胶槽中，插入样品梳。
在室温放置0.5-1h，待凝胶全部凝结后，轻轻拔出样品梳。
然后在电泳槽中加入电泳缓冲液直到没过凝胶为止。
2. 加样：取0.5-1 ug 左右的样品，体积为10-20ul，加入1/4体积的溴酚兰-甘油指示剂，混匀后小心地加到样品槽中。
同时另取一个已知分子量的标准DNA 水解液，在同一凝胶板上进行电泳。
3. 电泳：维持恒压100V，电泳0.5-1h，直到溴酚兰指示剂移动到凝胶底部，停止电泳。
4. 染色：
将凝胶取出后浸入0.5mg/ml 溴乙啶溶液中，染色0.5-1h。
染液可反复多次使用。
5. 观察：
将凝胶板置于254nm波长紫外灯下进行观察。
DNA存在的位置呈现橙黄色荧光。
【注意事项】
1. 溴乙啶有毒，配制和使用溶液时要戴手套，勿将溶液滴洒在台面或地面上。
溴乙啶溶液于室温保存在棕色瓶中。
2. 倒凝胶板时不要太厚，否则影响电泳效果。