P_糖蛋白抑制剂对蝙蝠葛碱跨膜转运的影响_高秀蓉

Key words： Dauricine； Caco － 2 model； P － gp； Substrate； Multidrug resistance； Menispermi Rhizoma CLC number： R96
北豆根 Menispermi Rhizoma 为防己科植物蝙蝠 葛 Menispermum dauricum DC． 的干燥根茎， 具有清热 解毒、 祛风止痛的功效， 临床用于治疗咽喉肿痛、 肠
Effects of P － glycoprotein inhibitors on the transport of dauricine through membrane
GAO Xiu － rong1 ，JIANG Xue － hua2 ，DU Qing － qing2 ， SONG Lin2
（ 1． The Department of Pharmacy，Chengdu Medical College，Chengdu，Sichuan， 610083 P． R． China； 2． The Department of Clinical Pharmacy and Pharmacy Administration， West China School of Pharmacy， Sichuan University， Chengdu， Sichuan， 610041 P． R． China） Abstract： OBJECTIVE line． METHODS RESULTS To investigate the effect of P － gp inhibitors on the transport of dauricine through membrane in Caco － 2 cell
华西药学杂志 W C J· P S
2013 ， 28 （ 2 ） ∶135 ～ 139
是比较了与 934 比较相似的 974 黏附力大小及对药 物释放的影响。卡波姆的黏附性与 Zeta 电位有关， 卡波姆和黏膜的 Zeta 电位与离子化程度相关， 故介 质的 pH 可改变卡波姆和黏膜的离子化程度， 从而 因此， 卡波姆的黏附性与 改变了卡波姆表面的电荷， ［4 ］ pH 。 有关 试验加入碳酸钙， 不仅可中和 介质的 胃酸， 亦起到了改变黏附片微环境的作用。 这可从 碳酸钙前期对药物释放的抑制作用和对黏附力的影 响看出。均匀设计 （ Uniform design ） 是将数论与多 元统计相结合， 在正交设计的基础上提出来的一种 试验次数少、 成本低且不失一般性的试验设计方法 。 通过多元回归， 可清楚地看出某个因素对指标的贡 献大小， 并可根据多元回归方程去预报实验结果 ， 从
P － 糖蛋白抑制剂对蝙蝠葛碱跨膜转运的影响
1 2 2 高秀蓉 ， 蒋学华 ， 杜青青 ， 宋
林
2
（ 1． 成都医学院药学院药剂教研室， 四川 成都 610083 ； 2． 四川大学华西药学院， 四川 成都 610041 ） 摘要： 目的 研究 Caco － 2 细胞模型中 P － 糖蛋白抑制剂对蝙蝠葛碱跨膜转运的影响 。方法 采用 HPLC 法测定转运液中蝙
HPLC was used to determine the concentration of dauricine； bidirectional transport of dauricine in Caco － 2 cell
model was used， and the effect of P － gp inhibitors Ver， CsA and Dex on the bidirectional transport of dauricine were studied． P － gp inhibitors， Ver， CsA and Dex all could promote Papp （ A － B） and reduce Papp （ B － A） of dauricine in Caco － 2 cell line． P － gp can excrete dauricine， and dauricine maybe the substrate of P － gp． Document code： A Article ID： 1006 － 0103 （ 2013 ） 02 － 0135 － 05 CONCLUSION
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华西药学杂志
第 28 卷
Dau 具有逆转多种肿瘤细胞多药耐药 （ MDR ） 的作 ［3 ］ 推测 其 逆 转 作 用 可 能 是 通 过 同 外 排 转 运 体 用 ， P － 糖蛋白（ P － gp ） 结合， 抑制了 P － gp 作为外流泵 的活性。由于 P － gp 也存在于哺乳动物胃肠道上皮 Dau 是否与 P － gp 发生相 在口服吸收环节， 细胞中， 互 作 用 从 而 影 响 其 口 服 生 物 利 用 度 值 得 研 究。 Caco － 2 细胞模型是目前最为成熟和应用最多的体 外吸收模型， 表达了包跨 P － gp 外排泵在内的一些 活性转运蛋白， 可用于研究 P － gp 与药物间相互作 ［4 ］ 用 。现采用 Caco － 2 细胞模型研究蝙蝠葛碱跨膜 转运特性， 从细胞水平研究考察 P － gp 抑制剂对蝙 从而考察 P － gp 对蝙蝠葛 蝠葛碱跨膜转运的影响， 碱口服吸收的影响， 为深入研究蝙蝠葛碱的口服吸 收机制提供依据。
A
下色谱条件进行测定， 记录蝙蝠葛碱峰面积， 代入标 准曲线计算蝙蝠葛碱的浓度。 1． 2． 5 “ 1． 2． 3” “1． 2． 4 ” 专属性考察 采用 项下方 法， 分别检测空白 HBSS 缓冲液、 空白 HBSS 缓冲液
加蝙蝠葛碱、 样品液， 色谱图见图 1 。 可见缓冲液及 样品中各成分对蝙蝠葛碱的分析均不产生干扰 ， 蝙 用于吸收研究的 CaB
Caco － 2 细胞的培养
蝠葛碱 t R 为 13． 5 min， 表明方法专属性良好。
C
0
5
10
15 0
5 t/min
10
15
0
5
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15
图1 Fig 1
空白转运液（ A） 、 空白转运液加蝙蝠葛碱 （ B） 和转运样品（ C） 的色谱图 Chromatograms of blank transport solution（ A） ，transport medium solution spiked with dauricine （ B） and sample solution（ C）
co － 2 细胞的传代数为 JHJ passage25 ～ 35 ， 使用空 5 －1 白培养液将其制成约 2 × 10 ·mL 细胞的混悬液， 接种在 Transwell 6 孔板上 （ 每个孔由聚碳酯膜分隔 成为上下两个室， 上侧室为肠腔侧 （ AP ） ， 下侧室为 基底 侧 （ BL ） 。 将 接 种 好 的 Transwell 6 孔 板 置 37 ℃ 、 5% CO2 孵箱静置培养， 每天更换 1 次培养 液， 直至形成完全致密的单层细胞膜 （ 约 21 d） 。 1 ． 2 ． 2 Caco － 2 细胞模型的评价 可通过测量单 细胞层的跨膜电阻来评价 Caco － 2 细胞是否分化形 TEER 值 大 于 400 Ω· 成完整的 单 层 膜， 一 般 而 言， cm2 时， 即表明 Caco － 2 细胞完全分化。试验中采用 电位仪监测 Caco － 2 细胞在聚碳酯膜上生长 21 d TEER 值 大 于 400 Ω·cm2 并 趋 于 恒 定 时 TEER 值， 时， 即 用 于 转 运 试 验。 通 常 采 用 甘 露 醇、 菊 粉、 PEG － 4000 和荧光素钠等放射性标记物或荧光物质 当 Caco － 2 细胞融合形成 测量细胞单层的通透量， 完整单层后， 此类物质均不易透过， 故可作为检测细 胞单层完整性的标志物。采用甘露醇作为标志物检 符合要求的细胞用于实验。 测所培养细胞的完整性， 1． 2． 3 色谱条件 采 用 Sepax C18 色 谱 柱 （ 250 mm × 4． 6 mm， 5 μm ） ， 流动相为甲醇 － 水 （ 76∶24， 0． 21% 磷酸） ， 含 1% 三乙胺、 流速 1． 0 mL· －1 min ， 检测 波 长 284 nm， 柱 温 30 ℃ ， 进 样 体 积 20 μL。 1． 2． 4
蝠葛碱的含量； 采用 Caco － 2 细胞模型双向转运实验， 考察不同浓度维拉帕米 、 环孢素 A 和醋酸地塞米松 3 种 P － 糖蛋白抑制 剂对蝙蝠葛碱跨膜转运的影响 。结果 碱可能为 P － 糖蛋白底物。 关键词： 蝙蝠葛碱； Caco － 2 细胞模型； P － 糖蛋白； 底物 ； 多药耐药； 北豆根 中图分类号： R94 文献标志码： A 文章编号： 1006 － 0103 （ 2013 ） 02 －剂后， 蝙蝠葛碱的 Papp （ A － B） 均有一定程度增加， 而 Papp （ B － A） 外排转运体 P － 糖蛋白对蝙蝠葛碱有外排作用， 蝙蝠葛 均有显著降低（ P ＜ 0． 05 ） ， 即均抑制了蝙蝠葛碱的外排转运 。 结论
道痢疾和风湿痹痛
。蝙蝠葛碱（ dauricine， Dau） 是 北豆根主要的有效成分之一， 具有保护心血管系统、
［1 ］
抗菌和抗癌等药理作用， 但口服生物利用度 ＜ 20% 。
基金项目： 成都医学院院级科研课题（ 编号： CYZ09 － 008 ） 作者简介： 高秀蓉（ 1978 —） ， 女， 博士， 讲师， 从事药物新剂型设计及药动学的研究工作。Email： gaomuxouzi@ 126． com
位仪（ 美国密理博） ； THZ － 100 型恒温摇床 （ 上海一 恒科学仪器有限公司） 。Caco － 2 细胞株 （ 美国模式 ATCC ） ； 蝙 蝠 葛 碱 原 料 药、 培养物 集 存 库， 对照品 （ 色谱级纯度 ＞ 98% 、 99% ， 深圳市维琪生物科技有 限公司） ； 甘露醇（ 成都科龙化学试剂厂 ） ； 维拉帕米 （ Ver， 武汉银河化工有限公司， 纯度 99． 0% ） ； 环孢 湖北武汉远成药业有限公司， 纯度 99% ） ； 素（ CsA， 醋酸地塞米松 （ Dex， 珠海远城医药化工有限公司， 纯度 99% ） ； 达尔伯克改良伊格尔培养基 （ DMEM ） 、 HBSS 缓冲液、 胎牛血清（ FBS） （ 美国 Gibco － BRL ） ； HPLC 用有机溶剂为色谱纯； 水为二次重蒸水； 其余 试剂为分析纯。 1 ． 2 方法与结果 1． 2． 1
4 · min － 1 样品的处理 转运样品经 1． 3 × 10 r “ 1． 2． 3 ” 离心 10 min 后， 取上清液 20 μL 进样， 按 项
1
1． 1
实验部分
仪器与试药 LC － 2010C HT 高效液相色谱仪 （ 日本岛津 ） ； 倒置相差显微镜（ 日本奥林巴斯） ； Millicell － ERS 电
而优化实验。文中还可通过方程来检测药物整个释 从而对优化实验方案提供理论依据 。 放过程， 参考文献：
［ 1］ ［ 2］ ［ 3］ 章灵 华， 肖 培 根， 黄 艺， 等． 丹 皮 酚 的 药 理 与 临 床 研 究 进 展 ［J］． 中国中西医结合杂志， 1996 ， 1 （ 3 ） ： 187 － 190． 李瑞雪． 均匀设计在药物研究开发中的应用［M］． 成都： 四川 2000 ： 96 － 127． 科学技术出版社， 张志荣， 付劼， 黄园， 等． 卡泊姆与羟丙基甲基纤维素在体内 ． 药 学 学 报， 2001 ， 36 外与大鼠胃 肠 黏 膜黏附 性 的 考 察［J］ （ 7 ） ： 543 － 546． ［ 4］ Khalid Mahrag， Tur， Hung － Seng Ch ’ ng． Evaluation of possible mechanism（ s） of bioadhesion［J］． Int J Pharm， 1998 ， 160 ： 61 － 74． 收稿日期： 2012 － 03 － 08