布鲁氏菌病与结核病快速诊断技术的研究

中文摘要
布鲁氏菌病是由布鲁氏菌属的细菌侵入机体， 进而引起传染变态反应性的人畜共患 传染病。布鲁菌可感染人类、多种家畜和野生动物，导致巨大的经济损失和严重的公共 卫生问题。因此对该病及时作出诊断有利于降低经济损失。为此，国内外学者相继建立 了很多方法，但是这些方法或技术性强不适于基层使用，或价格昂贵，操作复杂，或结 果不稳定。所以，建立敏感性高，特异性强，操作简便，便于基层推广使用的诊断方法 是非常有必要的。本研究应用胶体金免疫层析法（GICA）研制一种布鲁氏菌病多联蛋 白快速诊断试剂条，为布病的快速诊断提供了技术支持。 结核病是由结核分枝杆菌感染所导致的呼吸系统感染为主的人畜共患慢性传染病， 对人畜健康损害严重。全世界目前约有三分之一的人感染该病。目前，结核病呈现出扩 大趋势。 但现有的用于诊断结核感染的方法都存在或多或少的缺陷， 突出问题是灵敏度、 特异性低。因此需要一种新的诊断技术以称补现有方法的不足。据此，根据相关文献报 道， 本实验建立了基质金属蛋白酶 1 和 γ-干扰素体外释放试验， 该法具有较高的敏感性 和特异性，为结核病的早期诊断提供新的技术方法。现将主要研究成果报告如下： 1. 布鲁菌外膜蛋白 OMP31 的表达、纯化：通过分子克隆技术对目的基因 omp31 进 行扩增，然后将 omp31 目的基因连接到 PMD18-T 载体上，经过 PCR、酶切和 DNA 测序鉴定正确后，构建 pET-32a-omp31 重组质粒，转化到 DE3 表达菌中进 行经 IPTG 诱导表达， 最后进行 western blot 检测。 SDS 结果显示成功表达了 omp31 融合蛋白，并获得了高表达量和高纯度的蛋白， western blot 检测结果证明了 omp31 融合蛋白具有较高的免疫原性，为后续的免疫学检测奠定了试验基础。 2. 检测布鲁氏菌多联蛋白试纸条的制备：用柠檬酸三钠还原剂制备胶体金溶液，在 此基础上摸索胶体金标记金黄色葡萄球菌 A 蛋白的最佳条件；并对其进行质量 鉴定。用透射电镜和紫外/可见光谱仪（400nm-700nm）分析显示，制备的胶体 金颗粒大小均一，约为 20nm，适合免疫标记。胶体金标记金黄色葡萄球菌 A 蛋 白最 pH 为 6.2，最适稳定浓度为 6µg/ml。最佳抗原包被量为 1µL/cm，人 IgG 的 最佳包被浓度为 2 mg/ml。用研制的 OMP31 和 BP26 多联蛋白试纸条与仅有 OMP31 或 BP26 蛋白作为单一检测线的试纸条对 15 份布鲁氏菌标准阳性血清进 行检测，多联蛋白试纸条阳检率为 100%，与仅有 OMP31 或 BP26 蛋白作为单一 检测线检测结果相同，与用琥红平板试验（RBPT）符合率为 100%。检测其他血 清结果显示该试纸条具有良好的特异性。 试纸条可检出稀释 125 倍的羊布鲁氏菌 标准阳性血清。本试纸条在 4℃可保存 6 个月，表明该检测方法具有较高的稳定 性 。 3. 建立肺结核 IFN-γ 和基质金属蛋白酶 1 体外释放试验诊断方法： 分离提取结核病 患者（结核组，20 例）和健康人（健康对照组，20 例）外周血淋巴细胞；用结 核杆菌侵染 12h 后， 采用酶联免疫吸附测定 （ELISA） 法检测培养上清液中 MMP-1
中国· 新疆· 石河子 2012 年 6 月
Established Fluorescent quantitative detection of Brucella and Immunochromatographic Strip for Diagnosis of Brucella serum
A Dissertation Submitted to Shihezi University In Partialents for the Degree of Master of Agriculture
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By
Lu Zhizi
(Basic Veterinary Science)
Dissertation Supervisor: Prof. Chen Chuangfu
June, 2012
学位论文独创性声明
本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除 文中已经注明引用的内容外 ， 本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。 对本文的研究 做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。
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课题来源
973 计划项目 项目名称：重要人兽共患胞内寄生菌病流行特征及病原致 病机制研究；项目编号：2010CB530200
十一五国家重大疫病防控专项 项目名称：结核病分子标识和诊断技术及产品 的研究；项目编号：2008ZX10003-003
分类号： 学 号：2009108020
密
级：
单位代码：10759
石河子大学
硕 士 学 位 论 文
布鲁氏菌病与结核病快速诊断技术的研究
学 位 申 请 人 指 导 教 师
鲁芝子 陈创夫 教授 农 学 硕 士
申请学位门类级别 学科、专业名称 研 所 究 在 方 学 向 院
基础兽医学 动物疾病病理学 动物科技学院
II
Abstract
Brucellosis， brucellosis bacteria，cause an infection allergic of both human beings and livestock with infectious diseases. Bloom bacteria can infect the human, the many kinds of livestock and wild animals, which cause huge economic losses and serious public health problem，so the diagnosis of the disease in time may reduce the economic loss. Some domestic and foreign scholars have established a lot of methods, but these methods or technicals are not suitable for basic use, due to expensive, complex operation or unstable result. Therefore, a high sensitivity and specificity is strong, simple operation and easy to popularize the use of basic diagnostic method is very necessary. These study applies colloidal gold immune chromatography (GICA) develop a brucellosis split protein fast article diagnosis reagent, the positive rate for the rapid diagnosis provides technical support. Tuberculosis is a mycobacterium tuberculosis infection in the respiratory infection both human beings and livestock primarily with chronic infection for human health seriously damage. About one-third of all people are infected with the disease in the world. At present, tuberculosis present a enlarging trend. But in the current the diagnosis method of tuberculosis infection has more or less defects, outstanding problems is sensitivity, low specificity. Therefore a new diagnostic technology to say the shortcomings of the methods was needed. Accordingly, according to relevant reports in the literature, this experiment set up matrix metalloproteinases 1 and gamma-interferon in vitro release test, the method has higher sensitivity and specificity for the early diagnosis of tuberculosis provide new technology. Now the main research reports as follows: 1. According to the nucleotide sequences of Brucella 16M published in GenBank. The omp31 gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR). The PCR product was cloned into the pMD18-T simple vector and then sequenced. The prokaryotic expression vector pET32a-OMP31 was constructed by using the purified OMP31 gene that was subcloned into the expression vector pET32a.The resultant pET32a-OMP31 was transformed into E.coli BL21 and induced by IPTG. The result of SDS-PAGE and Western-blot indicated that an approximately exogenous protein was observed. The protein was purified with Ni-NTA Agaros and the purified pET32a-OMP31 fusion protein was obtained. These results provided a basis for futher study of Brucellosis diagnosis. 2. Brucellosis test bacteria split protein dipsticks preparation: with citric acid sodium three reductant preparation colloidal gold solution on the basis of colloidal gold for mark staphylococcus aureus protein A the best conditions; And the quality appraisal. The preparation of colloidal gold uniform particle size, about 20 nm, which suitable for immune mark, were showed by using transmission electron microscopy and uv/visible spectrometer (400 nm-700 nm) analysis. Colloidal gold mark staphylococcus aureus protein A the pH is 6.2,