western-blot实验步骤
western blot 实验步骤

Western blot 之生理宝典样品的制备1. 收细胞1.1 从-20℃取出细胞裂解液和蛋白溶解酶抑制剂片剂,每2毫升细胞裂解液加四分之一片蛋白溶解酶抑制剂片剂,置于4℃冰上,此步骤需新鲜配制;1.2 取出灭菌EP管,做好标记,置于4℃冰上;1.3 取出六孔板(含有培养细胞),去培养基,每孔用10ml移液管加入4℃PBS 1ml,移去,每孔用移液枪加入60-100微升细胞裂解液(已加入蛋白溶解酶抑制剂),吹打,用细胞刮将贴壁细胞刮下,吹打,用移液枪吸到已标记的EP管中,置于4℃冰上,注意细胞刮每次刮完一孔用纸巾擦净,再刮下一个,刮的时候要保证各个方向都刮到。
1.4 如需保存,将EP管置于-80℃。
2. 收组织2.1 向放有组织的EP管中加入细胞裂解液(含PMSF),每250mg组织加入1ml裂解液,不足100µl的,补至100µl。
2.2 将含有裂解液的组织用干净镊子或小剪刀剪碎,越碎越好。
(冰上操作)3. 提蛋白3.1 将含有裂解液的细胞液或组织悬浊液用超声仪裂解(4℃冰上操作),每支离心管超声10次,每次1s。
每管超声后,超声仪金属头部需用PBS或蒸馏水清洗(洗瓶清洗),再用滤纸吸干。
超声仪金属头部不可插入EP管过深,否则会有细胞液溅出。
3.2 充分裂解后,4℃、12000r离心10min,取上清,快速加入到已标记的EP管中。
4. 测蛋白浓度4.1细胞蛋白液细胞密集时,则从原液中抽出5µl,再加30µl PBS,稀释7倍;细胞稀疏时,则从原液中抽出7µl,再加28µl PBS,稀释5倍。
剩余母液放入4℃。
4.2 组织蛋白从原液中抽取2µl,再加38µl PBS,稀释20倍。
剩余母液放入4℃。
4.3 用倍倍稀释法,制作标准蛋白梯度,即0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.025µg/µl标准蛋白4.4 在96孔板内加入BCA工作液,每孔100µl,再将各浓度标准蛋白和稀释样品点入含有BCA液体的孔内,每孔10µl(BCA工作液配制时需要多配,以防不够用)。
Western-blot实验操作步骤

Western-blot实验操作步骤Western blot实验步骤一、制备蛋白样品(单层贴壁细胞总蛋白提取)1.倒掉细胞培养液,加3ml预冷的PBS洗涤细胞,重复两次,弃掉PBS 后将细胞培养瓶置于冰上。
2.裂解液RIPA(强)1ml +PMSF10ul(100:1),两者混匀后加入培养瓶中裂解细胞,冰上裂解30min,为使细胞充分裂解,培养瓶要经常来回摇动。
3.裂解完后,用细胞刮将细胞刮于一侧(动作要快),转移至ep管中.4.4度,12000rpm,离心5min.离心后取上清至新的ep管中,用于后续实验(-80保存)常用蛋白收样:倒掉细胞培养基后,预冷PBS洗涤细胞2次,弃去,再加入1ml PBS,用细胞刮轻轻刮取细胞,转移至1.5ml ep管中,12000rpm,离心5min,尽量吸净上清,沉淀于-80保存,用于后续实验。
融化蛋白样品,加入RIPA+PMSF细胞裂解液(200ul/ep管),充分混匀,冰上裂解20min,4度离心,5min ,12000rpm,小心吸取上清至新的ep管中。
二、蛋白浓度测定(BCA法)BCA(碧云天)蛋白浓度测定试剂盒灵敏度高,检测浓度下限达到25ug/ml,最小检测蛋白量达到0.5ug,待测样品体积为1-20ul。
在50-2000ug/ml浓度范围内有较好的线性关系。
标准蛋白BSA浓度:5mg/ml (-20保存) ,完全溶解蛋白标准品,取10ul 稀释至100ul,使终浓度为0.5mg/ml(ug/ul)。
蛋白样品在什么溶液中,标准品也宜用什么溶液稀释。
但为了简便起见,也可以用0.9%NaCl 或PBS稀释标准品。
1.配置BCA工作液A液: B液= 50 : 1 ,混匀 A液+B液=200ul (每个样本) 样本数量: 7个标准品 + N 个待测蛋白样本2.先将每孔加入200ul BCA工作液,再加入蛋白样本。
(96孔板),总体积为10ul.待测蛋白样本先10倍稀释。
WB实验步骤详解

WB实验步骤详解Western blotting(简称WB)是一种常用的蛋白质检测技术,通过将蛋白质分离、转移和检测,可以用来确定特定蛋白质的存在和表达水平。
本文将详细介绍WB实验的步骤,以帮助读者了解该技术的操作流程。
1. 细胞培养和蛋白提取。
首先,需要培养细胞并收集细胞样本。
将细胞样本离心,去除培养基,然后用PBS洗涤细胞。
接下来,加入细胞裂解液并振荡离心,收集上清液,即为蛋白提取物。
2. 蛋白质浓度测定。
使用BCA或Bradford方法测定蛋白提取物的浓度,以确保后续实验中使用的蛋白质量一致。
3. SDS-PAGE凝胶电泳。
将蛋白提取物加入蛋白负载缓冲液,然后加入SDS-PAGE凝胶槽中。
进行电泳分离蛋白质,根据蛋白质大小和电荷不同,蛋白质会在凝胶中形成不同的条带。
4. 蛋白质转印。
将SDS-PAGE凝胶中的蛋白质转移到膜上,通常使用半湿式或全湿式转印。
将蛋白质从凝胶转移到膜上,使得蛋白质可以与抗体结合。
5. 阻塞。
将膜放入含有蛋白质的溶液中,如5%脱脂奶粉或蛋白质阻塞缓冲液中,阻塞非特异性结合位点。
6. 一抗孵育。
加入第一抗体,孵育过夜。
第一抗体与目标蛋白结合,形成抗原-抗体复合物。
7. 洗涤。
用TBST或PBS洗膜,去除未结合的抗体。
8. 二抗孵育。
加入HRP标记的二抗,孵育1小时。
二抗与第一抗体结合,形成复合物。
9. 洗涤。
用TBST或PBS洗膜,去除未结合的二抗。
10. 显色。
加入ECL显色液,使得膜上的蛋白质产生发光反应。
将膜放入暗室中,用X光片曝光,然后用显影液显影。
11. 图像获取和分析。
将X光片放入X光片扫描仪中,获取蛋白质条带的图像。
使用图像分析软件,如ImageJ,分析蛋白质的相对表达水平。
以上就是WB实验的详细步骤,每一步都至关重要,需要严格按照操作规程进行。
希望本文能够帮助读者更好地理解WB实验的操作流程,并在实验中取得准确、可靠的结果。
westernblot法

Western blot,也称为蛋白质印迹或免疫印迹,是一种常用的生物化学技术,用于分析样品中特定蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。
下面是Western blot的基本步骤和注意事项:一、实验步骤蛋白样品制备:从细胞或组织中提取蛋白质样品,常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。
蛋白定量:使用BCA蛋白浓度测定法等对蛋白质样品进行定量,以便后续的Western blot分析。
凝胶电泳:将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离,根据蛋白质的大小和电荷进行分离。
转膜:将电泳分离后的蛋白质样品转移到硝酸纤维素膜上,以便进行后续的免疫检测。
免疫检测:使用特异性抗体对转移后的蛋白质样品进行免疫检测,抗体与目标蛋白质结合后,通过显色反应呈现阳性结果。
数据分析:对免疫检测结果进行定量和定性分析,如条带大小、灰度值等。
二、注意事项实验前要充分了解实验原理和操作流程,确保实验的正确性和可行性。
蛋白样品制备过程中要保证细胞或组织充分裂解和匀浆,以获得更纯的蛋白质样品。
在进行Western blot分析前,要对蛋白质样品进行定量,以保证实验结果的准确性。
在转膜过程中,要选择合适的转移缓冲液和转移时间,以保证蛋白质样品的完整转移。
在免疫检测过程中,要选择合适的抗体和显色试剂,以保证免疫检测结果的特异性。
在数据分析过程中,要选择合适的分析方法和软件,以保证数据分析的准确性和可靠性。
总之,Western blot是一种常用的生物化学技术,在蛋白质分析领域具有广泛的应用价值。
在进行Western blot实验时,要严格遵守实验步骤和注意事项,以保证实验结果的准确性和可靠性。
western blot实验步骤

一、提取组织蛋白新鲜肺组织取20-30mg,减去气管,组织匀浆机研磨,100W超声3S,12000r/min离心37℃孵育30min,测OD562。
按所得结果定量到50微升计算上样量,将20微升上清分装到一个1.5ml的EP管,加5微升上样缓冲液,-20℃冻存。
二、煮样95℃,煮10min,待温度降到室温关闭机器,煮后的组织离心7500r/min,1min备用三、安装玻璃板,倒入电泳缓冲液,拔梳子,用进样针吸取计算的上样量上样,装好正负极,倒满电泳液,设置80V,30min跑条带,结束后100V,60min,没跑到底酌情延长时间(30min),准备转膜所需工具:1.剪好6片滤纸,转膜液湿润海绵及滤纸,赶气泡。
2.PVDF膜,准备甲醇激活膜2min,蒸馏水5min电泳时间到关闭电源,取出玻璃板,准备切胶,切好后,按形状切稍大一圈的PVDF膜,覆盖到切好的胶上,标记好上下。
安好夹子,放入电泳槽准备转膜,转膜需冰浴。
四、转膜结束后,将膜取下,TBST清洗3遍,每遍5min。
五、7%牛奶(1.75g,加TBST 25毫升),封闭2小时,慢摇。
六、封一抗内参:β-actinα-SMA:1:10000配制波形蛋白:1:5000制备杂交袋,放入膜,滴入抗体,封口,4℃过夜七、将过夜的膜放入37℃恒温箱中孵育30min,结束后回收一抗,标记好第几次用,TBST清洗膜3遍,每遍10min。
八、封二抗:羊抗兔HRP(1:5000)稀释,配制10ml,慢摇1小时后回收二抗,标记好第几次。
TBST清洗膜3遍,每遍15min。
九、1:1配制发光液(避光保存),准备眼科镊、滤纸、托盘、曝光,先曝背景再报条带,先自动后手动。
WB实验步骤

Western blot 实验步骤及注意事项1.细胞蛋白提取1)25ml培养瓶弃干净培养基,可倒置于吸水纸或正立使液流至瓶底,用枪头吸净;再用预冷的PBS清洗3次,枪头吸净。
2)配制细胞裂解液RIPA:PMSF=100:1(PMSF使用浓度为1mM,由17.4mg PMSF粉末和1ml异丙醇配制),每培养瓶加200μl细胞裂解液。
于冰上裂解30min,为使细胞充分裂解,培养瓶要经常来回摇动。
3)裂解完后,用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧(动作要快),然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5ml 离心管中。
(整个操作尽量在冰上进行)4)于4℃下 12000rpm 离心 15min。
(提前开离心机预冷)5)将离心后的上清分装转移至0.5min 的离心管中放于-80℃保存。
6)蛋白变性:蛋白上清与5x SDS蛋白上样缓冲液按4:1混合(即每100μl蛋白中加25μl缓冲液),置于100℃水浴箱中水浴5min使之充分变性,置于-20℃保存。
2.制胶与上样1)清洗玻璃板:扣紧玻璃板用洗洁精轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲,再用蒸馏水超纯水冲洗干净后立在筐里晾干。
a 测漏实验(那个玻璃板装好,再整体装在板子上)2)灌胶与上样:(从一侧加入胶液9混匀,匀速加入)①10% SDS--- SDS 10g+水100ml (将10g SDS加到90ml水中,加热溶解,然后定容至100ml,室温保存;常温放置若出现沉淀,可放37℃水浴箱中温浴)②10%过硫酸铵(AP)---过硫酸铵 0.1g+超纯水10ml (溶解后,4℃保存,保存时间为1w)③根据分离胶及浓缩胶表的浓度制胶,分离胶灌胶后用无水乙醇或水压胶,灌浓缩胶后马上放梳子。
(胶一定要平,不留气泡)④配制电泳液:1L纯水+3.03g Tris+18.77 Glycine+1g SDS,溶解后室温保存。
⑤将玻璃板放入电泳槽中(小玻璃板向内,大玻璃板向外)。
加入足够电泳液,最少没过小玻璃板,两手捏住梳子两边轻轻拔出。
Western Blot实验详细步骤

Western Blot实验详细步骤Western Blot实验技术一、制胶SDS-PAGE分离胶配方表1、检查制胶器是否漏水,吸干玻璃中水分2、配置分离胶,加入玻璃板中(注意:不能有气泡和杂物),距离玻璃上口1.5mL 停止加胶。
3、再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡,凝胶后倒掉水,吸干水到浓缩胶插梳。
二、上样1、先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。
2、拔梳子时垂直向上拔出,不可左右摇晃梳子。
3、拔完梳子后观察梳子孔,是否有缺口和歪,用针头拨正。
4、上样时从左到右依次上样。
5、若上样组不多时,左右第一孔不加样。
6、要预留Marker的上样孔。
三、电泳四、转膜PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride)是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。
PVDF膜是疏水性的,膜孔径有大有小,随着膜孔径的不断减小,膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。
(转膜缓冲液:需4度预冷,现配现用,不能放太久。
)1、转印滤纸:全胶长8.5cm,宽5.5cm,需剪裁成7层滤纸,压平后约3mm。
需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。
2、海绵垫:在转膜液中平衡浸泡备用。
3、PVDF膜:剪裁8.5cm*5.5cm ,需在甲醇中浸润2min(活化膜上正电基团),然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。
4、凝胶:凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3-5分钟。
否则在转膜过程中会出现皱缩,导致出现转移的条带变形。
三明治夹心法:负极(黑)-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极(白)转膜时间:通电恒流,60V,一个槽100mA左右,1h (注意:在操作过程中用玻棒赶走气泡。
装置转膜仪时注意黑对黑(负对负),白对红(正对正)。
装置运行时需冰浴。
)五、封闭在进行抗体杂交之前,需要先对转印膜进行封闭,以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。
封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂,本实验室常用的有5%BSA,10%脱脂奶等,至于选择哪一类封闭液,首先应考虑与检测目的相适应(做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fat milk 封闭)。
Western Blot实验详细步骤

Western Blot实验技术一、制胶SDS-PAGE分离胶配方表1、检查制胶器是否漏水,吸干玻璃中水分2、配置分离胶,加入玻璃板中(注意:不能有气泡和杂物),距离玻璃上口1.5mL 停止加胶。
3、再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡,凝胶后倒掉水,吸干水到浓缩胶插梳。
二、上样1、先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。
2、拔梳子时垂直向上拔出,不可左右摇晃梳子。
3、拔完梳子后观察梳子孔,是否有缺口和歪,用针头拨正。
4、上样时从左到右依次上样。
5、若上样组不多时,左右第一孔不加样。
6、要预留Marker的上样孔。
三、电泳四、转膜PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride)是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。
PVDF膜是疏水性的,膜孔径有大有小,随着膜孔径的不断减小,膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。
(转膜缓冲液:需4度预冷,现配现用,不能放太久。
)1、转印滤纸:全胶长8.5cm,宽5.5cm,需剪裁成7层滤纸,压平后约3mm。
需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。
2、海绵垫:在转膜液中平衡浸泡备用。
3、PVDF膜:剪裁8.5cm*5.5cm ,需在甲醇中浸润2min(活化膜上正电基团),然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。
4、凝胶:凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3-5分钟。
否则在转膜过程中会出现皱缩,导致出现转移的条带变形。
三明治夹心法:负极(黑)-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极(白)转膜时间:通电恒流,60V,一个槽100mA左右,1h(注意:在操作过程中用玻棒赶走气泡。
装置转膜仪时注意黑对黑(负对负),白对红(正对正)。
装置运行时需冰浴。
)五、封闭在进行抗体杂交之前,需要先对转印膜进行封闭,以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。
封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂,本实验室常用的有5%BSA,10%脱脂奶等,至于选择哪一类封闭液,首先应考虑与检测目的相适应(做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fat milk 封闭)。
westernblot实验步骤

westernblot实验步骤Western blot实验是一种常用的免疫学检测方法,适用于分析特定蛋白质的存在量、大小和结构等。
下面将介绍Western blot实验的主要步骤,以及注意事项。
1. SDS-PAGE凝胶电泳Western blot实验首先需要进行SDS-PAGE凝胶电泳。
SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis)是一种分离蛋白质的方法,可以根据蛋白质的大小将其分离离子定位在凝胶中相应的位置。
在SDS-PAGE中,蛋白质会被特定化学物质SDS (十二烷基硫酸钠)包裹,其带负电荷的端口相互排斥,并使蛋白质在电场中沿着凝胶运行,根据大小排序在不同位置。
2.转移蛋白质到膜上SDS-PAGE电泳完毕后,需要将蛋白质迁移到聚丙烯腈或硝酸纤维素膜上。
转移可以采用湿式或半干燥式方法,膜的种类和转移缓冲液的浓度、pH值等因素都会影响转移效果。
3.蛋白质与抗体结合膜上的蛋白质需要与浓度足够的抗体进行结合,使其出现颜色。
抗体可以是多克隆或单克隆抗体,通常由动物免疫学制备而成。
在结合抗体之前,膜需要被阻断,以避免非特异性的背景信号。
4.识别蛋白质识别特定蛋白质需要使用标记有酶、荧光体或放射同位素等的二抗或底物。
蛋白质与特定抗体形成复合物后,可以使用二抗结合在蛋白质与一抗之间。
底物是标记于蛋白质特定抗体上的酶,在底物的作用下,可生成可见信号,如液态手套(ECL)。
注意事项:1.蛋白质的提取和纯化,提取方式会影响到实验结果,选择适当的提取方法是十分重要的。
2.涉及到蛋白质电泳和转移过程,准确控制电泳时间和电压,转移条件、时间以及温度都会影响转移效果和转移后的后续步骤。
3.在结合抗体前,必须阻断膜上的未被结合的蛋白质,减小背景信号。
通常使用酵素或乳清蛋白等物质进行阻断,以避免非特异性结合。
4.选择合适的底物,控制反应条件,避免过度堆积或实验时间不够导致底物显色偏低。
WB实验步骤详解

WB实验步骤详解WB实验(Western Blotting)是一种用于检测和鉴定蛋白质的实验技术。
在WB实验中,通常将目标蛋白质从混合蛋白样本中分离出来,然后通过电泳将其分离在聚丙烯酰胺凝胶上,并利用蛋白质转印技术将蛋白质迁移到膜上。
最后,使用特异性抗体进行免疫染色来检测目标蛋白质。
下面是WB实验的详细步骤:1.提取蛋白质:首先,从细胞、组织样本中提取蛋白质。
这个步骤可以使用不同的方法,例如细胞裂解、组织切碎和离心等。
提取的蛋白质可以用于整个WB实验的下一步。
2.蛋白质电泳分离:将提取的蛋白质样本与样品缓冲液混合,然后加载到聚丙烯酰胺凝胶上。
通常使用的凝胶是SDS-(聚丙烯酰胺凝胶电泳),该凝胶根据蛋白质的分子量将其分离开来。
样品加载完毕后,通电进行电泳分离。
较小的蛋白质会迁移到凝胶的上部,较大的蛋白质会停留在凝胶的下部。
3.转印:将电泳分离后的蛋白质转移到膜上。
通常使用的膜是聚偏氟乙烯(PVDF)或硝酸纤维素膜。
在转印之前,通常将凝胶浸泡在转移缓冲液中以增强转印效果。
然后,将凝胶与膜、滤纸层堆叠在一起,将其放置在转印装置中,施加电流进行蛋白质转印。
4.阻断:将转印完成的膜孔洞中的非特异性结合位点进行阻断。
阻断是为了防止以后的抗原-抗体反应受到非特异性结合的干扰。
最常用的阻断剂是1%-5%的非脂牛奶粉或5%-10%的牛血清蛋白。
5.抗体孵育:使用特异性的抗体来检测目标蛋白质。
首先将抗体稀释在主抗体稀释液中,然后将其加到阻断后的膜上进行孵育。
通常在4℃下过夜孵育,使抗体与目标蛋白质结合。
选择合适的抗体对于获得准确的结果非常重要。
6.辅助抗体孵育:将特异性抗体之外的次级抗体添加到膜上,用于识别已结合的主抗体。
这些次级抗体通常与酶(如辣根过氧化物酶)或荧光染料标记进行共轭,以便于标记的抗体的检测。
次级抗体与主抗体结合形成复合物。
7.检测:使用特定的检测方法来显示已结合的抗体。
这些方法可以使用酶标法(如辣根过氧化物酶反应和色素显色)或荧光技术(如荧光染料)。
Western blot实验步骤

聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)原理
• 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS-PAGE )是蛋白质 分析过程中最常用的技术。
• 蛋白质在电泳分离时,其迁移率主要取决于蛋白质本 身所带的电荷多少、分子量大小和形态。但如在 PAGE 中加入阴离子去污剂 SDS, SDS 将蛋白质的二硫键、氢 键及疏水键打开,使蛋白质变性, SDS 将包裹在变性 蛋白表面,使蛋白质成为刚性分子,同时,由于SDS带 有大量负电荷,使蛋白质本身带有的电荷可忽略。这 样,不同蛋白质分子的迁移率主要决定于蛋白带有的 SDS 量,而 SDS 与蛋白结合的量与蛋白的分子量成正比, 即迁移率决定于蛋白质分子量大小 。因此利用 SDSPAGE可测定蛋白质的分子量。
SDS-PAGE 蛋白电泳试剂
1. 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体溶液(Acr和Bis):
丙烯酰胺30g ,甲叉双丙烯酰胺0.8g,加水100ml ,滤 纸过滤后储存于棕色瓶中,4℃避光保存,pH不得超过 7.0。(光催化或碱催化其发生脱氨基反应)
• 2. 4x分离胶缓冲液 :Tris 18.17g, 10% SDS 4ml, HCl调pH至8.8, 定容到100ml。
• 5. 10×电极缓冲液:称取Tris 30g、甘 氨酸144g,加入10%SDS 100ml,定容至 1000ml, pH8.8
• 6. 2X样品缓冲液:甘油2ml(或称取蔗糖2g ),加 入10%SDS 2ml,溴酚蓝0.25mg,浓缩胶缓冲液2.5ml、 ß -巯基乙醇0.5ml,加水定容至10ml。 • (加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子, 可以自由通过凝胶孔径, 所以它显示着电泳的前沿位 置,当指示剂到达凝胶底部时, 即可停止电泳)
• 蛋白质样品在上样电泳前均需变性。
Western Blot实验步骤

Western Blot实验步骤蛋白抽提①把组织剪切成细小的碎片。
②融解Western及IP细胞裂解液,混匀。
取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM。
③按照每20毫克组织加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液(如果裂解液不充分可以适当添加更多的裂解液,如果需要高浓度的蛋白样品,可以适当减少裂解液的用量)。
④用玻璃匀浆器匀浆,直至充分裂解。
在冰上放置30min。
⑤充分裂解后,4o C 13000g离心30分钟,取上清,其中一部分按1uL样品+4uLPBS 稀释后取2uL用于测蛋白浓度。
另一部分煮沸10分钟-20o C保存。
蛋白质定量:采用BCA蛋白测定法①根据样品数量,按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液,充分混匀。
BCA工作液室温24小时内稳定。
②完全溶解蛋白标准品,取10微升稀释至100微升,使终浓度为0.5mg/mL。
用PBS稀释标准品。
③将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20微升加到96孔板的标准品孔中,加用于稀释标准品的溶液补足到20微升。
④加上述稀释5倍的样品2uL加到96孔板的样品孔中,加用于稀释标准品的溶液到20微升。
⑤各孔加入200微升BCA工作液,37o C放置30分钟。
注:也可以室温放置2小时,或60o C放置30分钟。
BCA法测定蛋白浓度时,吸光度会随着时间的延长不断加深。
并且显色反应会因温度升高而加快。
如果浓度较低,适量在较高温度孵育,或延长孵育时间。
⑥测定A562的波长,根据标准曲线计算出蛋白浓度。
SDS-PAGE电泳①根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度,配制SDS-PAGE浓缩胶与分离胶:本实验浓缩胶为3.9%,分离胶为8%和10%。
使用Whatman 3 mm 滤纸吸去分离胶上层覆盖的所有溶液,如上配制浓缩胶。
用10mL注射器将浓缩胶加入板中至顶端,小心插入梳子,注意不要产生气泡。
Western Blot 步骤

Western Blot 步骤:1、样品处理(细胞样品的处理):1)培养细胞或药物处理2)弃上清,1*PBS漂洗细胞2遍,去尽残留培养基3)加入1*SDS电泳缓冲液,刮落细胞,转移到EP管中(注意冰上操作)4)4摄氏度下搅拌30分钟5)4摄氏度离心,转速和时间根据细胞不同进行改变,一般是12000转/分,20min。
6)离心管取出,置于冰上,吸取上清,其余丢弃。
7)测定蛋白浓度(BSA、BCA、Lowry、Bradford法),-20摄氏度或-70摄氏度冻存备用。
8)加入Loading Buffer, 95~100摄氏度煮沸5min,若测多种蛋白时,70摄氏度加热5~10分钟更为合适。
2、配胶:将两块玻璃清洗干净,先用洗洁精,再用70%乙醇,最后用ddH20,有Bio-Bad字样朝上,完成后加入H2O,约10分钟,确认无漏水后倒出H20,残留的用滤纸吸干(不要伸到里面去,倾斜后在边缘吸)。
3、根据分子量大小配分离胶:在干净的15mL离心管内配制(过硫酸铵APS最后加入,且需分装),混匀,用1mL枪加至绿线下方1~2mm处,注意不要将液体全打出来,防止气泡产生,从一边到另一边缓缓加入无水乙醇,ddH20溢出后,室温放置25~30分钟,可看到分离胶与ddH20之间有一条清晰的分界线,倒出上层的乙醇,并用ddH2O洗涤两遍,用滤纸吸去残留的水。
(Tris pH:8.8,配制10mL的量)4、配制浓缩胶:APS最后加入,快速加至液体溢出,将清洗干净的梳子水平插入,擦干外面,静置60分钟后应用于下一步试验;或4摄氏度冰箱过夜。
(Tris pH:6.8,一般配制4mL的量)分离胶与浓缩胶的pH一定要调准,否则严重影响实验结果。
APS1周内使用。
5、加样:将配制好胶的玻璃板轻轻取出,不可分离,放入电泳仪,矮面朝内,放平加紧,倒入1*电泳缓冲液,最好内外液面基本持平,或外液面稍矮,放置检查有无漏电泳液,电泳液配制约1000mL,如果电泳仪有漏液情况,则配制1200mL,使内外液面基本持平。
完整版WesternBlot免疫印迹法实验方法步骤

Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤发布日期:2008-8-25 热门指数:4360Western Blot(免疫印迹法)主要包括以下4个基本步骤:n 样品制备n 电泳分离n 蛋白的膜转移n 免疫杂交与显色――蛋白检测溶液和试剂n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS)n Modified RIPA bufferTris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;PMSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mMn 1X SDS 样品缓冲液62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝n 转移缓冲液25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3)n 10X Tris缓冲盐(TBS)准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6n 脱脂奶粉或BSAn 甲醇n TBS/T缓冲液1X TBS, 0.1% Tween-20)TBS/T封闭缓冲液(n1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSAn 一抗的稀释1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗)Note: 一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体,脱脂奶粉用于单克隆抗体,这样可得到较高的信噪比。
抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。
n 预染的蛋白质Marker,可用于监测转膜的效率样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白,以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法,其余的样品制备方法参阅相关文献。
Western Blot 步骤

Western Blot 步骤
(1) 灌制12%的分离胶和5%的浓缩胶。
将蛋白样品与上样缓冲液混匀,煮沸5min,冷却至室温,加入凝胶板上样孔中,上样量约为40~60μg。
(2) SDS-PAGE电泳,90 V稳压电泳约30min,待蛋白样品至分离胶和浓缩胶界面时,换用120 V稳压电泳,至溴酚蓝前缘移动到凝胶底部,约1.5h,取出凝胶。
(3) 根据蛋白Marker条带的大小,在预计位置将含目的蛋白的凝胶切下,置于转膜缓冲液中浸泡。
将PVDF膜先在甲醇中浸泡5 min,再放入转膜缓冲液中平衡15min。
(4) 将PVDF膜平铺在凝胶上,PVDF膜和凝胶两侧各放三层滤纸,凝胶在负极,PVDF膜在正极,放入电转仪中,4℃、100~250mA,转移时间1.5~3h。
(5) 取出PVDF膜,置于5%脱脂奶粉的TTBS中,37℃封闭1h。
(6) 将封闭后的PVDF膜置入用TTBS适当稀释的一抗中,4℃缓慢摇动孵育过夜。
(7) 取出PVDF膜,用TTBS洗涤10 min×3次后,置于TTBS稀释的红外荧光标记的相应二抗(稀释比例为1:20 000)中,37℃孵育2h。
(8) TTBS洗膜20 min×3次,成像仪器进行检测分析。
Western blot实验步骤

Western blot实验步骤(1)将玻璃板刷洗干净,用双蒸水冲净,凉干。
配10%过硫酸铵(最好先用现配)。
在凝胶架上安装玻璃板,带有凹槽的向里。
加入少量的去离子水,看是否漏水。
如漏,则重新安装;不漏,则开始配胶。
(2)配分离胶胶、灌胶、水封面。
配12%的分离胶:凝胶储存液2 ml,分离胶缓冲液1.25 ml,双蒸水1.75 ml,10%APS 25μl,TEMED 2.5μl。
轻轻振荡溶液使混匀(过量气泡会影响胶聚合)。
用1000µl枪注胶。
如分离胶液面不平,用手振荡一下凝胶架,振平胶面[19]。
然后用200µl枪在胶上面加去离子水封面(沿玻璃板横着遛着加,避免水冲面),可加至水满这样可将胶表层小气泡赶出。
待分离胶凝固后(约15分钟会再次重现折光面,再过5分钟等胶充分凝固)倾去水并用滤纸吸干。
(3)配5%的浓缩胶:凝胶储存液0.575 ml,浓缩胶缓冲液0.1675 ml,双蒸水0.25 ml,10%APS 7.5μl,TEMED 1.25μl。
配置浓缩胶,用1000µl枪将其缓慢加入到分离胶上面,然后插上梳子,要避免气泡(插梳子时,可将梳子稍倾斜)。
浓缩胶凝固后,样品中用加入上样缓冲液,在沸水浴中煮5-7 min取出,放于冰上冷却至少5 min。
之后10 000 g离心10 min除去不溶杂质。
玻璃板转移至电泳槽中,加少许缓冲液检查是否漏。
如漏,卸下重新安装;不漏,慢慢加电泳缓冲液至加满内槽。
垂直拔出梳子。
然后用20µl枪将样品逐一加入,取15µl 样品上样。
完毕后续加电泳缓冲液,液面要低于分离胶面2 cm,并把内槽中补满液体(电泳缓冲液应在冰箱中提前放置一段时间预冷)。
然后装上电泳仪,将电压量程调为600 V。
先于80 V电压下电泳11 min左右,待样品压成一条线并即将进入分离胶时,切换至120 V电压。
当溴酚蓝刚跑出分离胶时,切断电流。
Western_Blot过程步骤详解

做了五个月的Western Blot ,有一点点小心得,给新手点经验.蛋白提取:1.总蛋白提取(胞膜,胞浆,胞核):组织匀浆后,15000g, 4度, 20分钟后,取上清.Buffer:NP40 750ul, 脱氧胆酸钠0.5克, SDS 0.1克, 加1*PBS 至100ml. 再加入PMSF(7.4mg/ml) 0.1ml. (现用现加)7.4mg/ml PMSP异丙醇溶液: 取A mg PMSF 加A/7.4 ml 异丙醇.工厂-20度储存2.组织膜蛋白提取:所在操作冰上进行(1)取组织,用PBS冲洗干净组织上的血液. 加入10ml Buffer A , 用剪刀尽可能剪碎组织,于冰上充分匀浆。
每次30秒,重复3-5次.(2)离心机1000rpm,4℃离心10min 后,所得上清液转入超速离心管。
(去掉大块组织及结缔组织)(3)100000g,4℃离心1hr, 弃去上清.(此为胞浆蛋白,若只提取胞浆蛋白,可用10000rpm, 4度, 30分钟离心,取上清即可)。
沉淀用适量的Buffer B重悬,4度过夜后,分装至EP管,Eppendorf 台式离心机10000rpm,4℃离心30min。
(4)收集所得上清液即为膜组份。
Buffer A:0.32M 蔗糖,5mM Tris-HCl(PH 7.5),120mM KCl,1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。
冰上预冷。
Buffer B 20mM HEPES(PH 7.5),10% 甘油,2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM,PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。
冰上预冷。
所得蛋白分装EP管(每管约50ul),取一管测蛋白浓度,其它放入-70度深冻冰箱保存。
Western Blot实验详细步骤

Western Blot实验技术一、制胶SDS-PAGE分离胶配方表1、检查制胶器是否漏水,吸干玻璃中水分2、配置分离胶,加入玻璃板中(注意:不能有气泡和杂物),距离玻璃上口停止加胶。
3、再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡,凝胶后倒掉水,吸干水到浓缩胶插梳。
二、上样1、先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。
2、拔梳子时垂直向上拔出,不可左右摇晃梳子。
3、拔完梳子后观察梳子孔,是否有缺口和歪,用针头拨正。
4、上样时从左到右依次上样。
5、若上样组不多时,左右第一孔不加样。
6、要预留Marker的上样孔。
三、电泳四、转膜PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride)是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。
PVDF膜是疏水性的,膜孔径有大有小,随着膜孔径的不断减小,膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。
(转膜缓冲液:需4度预冷,现配现用,不能放太久。
)1、转印滤纸:全胶长,宽,需剪裁成7层滤纸,压平后约3mm。
需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。
2、海绵垫:在转膜液中平衡浸泡备用。
3、PVDF膜:剪裁* ,需在甲醇中浸润2min(活化膜上正电基团),然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。
4、凝胶:凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3-5分钟。
否则在转膜过程中会出现皱缩,导致出现转移的条带变形。
三明治夹心法:负极(黑)-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极(白)转膜时间:通电恒流,60V,一个槽100mA左右,1h(注意:在操作过程中用玻棒赶走气泡。
装置转膜仪时注意黑对黑(负对负),白对红(正对正)。
装置运行时需冰浴。
)五、封闭在进行抗体杂交之前,需要先对转印膜进行封闭,以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。
封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂,本实验室常用的有5%BSA,10%脱脂奶等,至于选择哪一类封闭液,首先应考虑与检测目的相适应(做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fat milk 封闭)。
western blot步骤

提取细胞蛋白步骤:1、配蛋白裂解液(蛋白酶抑制剂:RIPA裂解液=1:100)2、培养瓶弃去培养液,用PBS冲洗2遍3、用枪吸干PBS,加入80μl裂解液4、用刮刀刮下壁上细胞,吸入置于1.5ml EP管中5、超声,每次6-8下,间隔5min,2次-3次6、裂解30min,离心,13500转,10min7、铺96孔板中测蛋白浓度,每孔19μl裂解液,1μl样品,200μl工作液(A液:B液=50:1)8、96孔板于培养箱中孵育30min9、放入酶标仪中测浓度10、剩余蛋白吸入0.6ml EP管于-80℃中冻存提取组织总蛋白:取材时,应涮去组织表面的血,影响吸光度。
步骤:1、配裂解液(裂解液:10%SDS:蛋白酶抑制剂=60:40:1)2、研磨组织块,加300μl裂解液3、超声,3次,每次间隔5min4、冰中静置30min,裂解5、4℃离心13500转25min,吸取上清液至1.5mlEP管6、配工作液:BCA试剂A液:B液=50:17、铺入96孔板,依次加入19μl RIPA裂解液/PBS、1μl样品、200μl工作液,混匀(枪头在液面下,不产生气泡)放入37℃孵育20min8、放入酶标仪中测蛋白浓度:96孔板放入酶标仪中,进板—开始检测—bca562—read plate—Read—完成—结果(不能时间过长,否则检测的OD值偏高)9、剩余样品分装(避免蛋白降解)于0.6ml EP管,50μl/管10、保存于-80℃Western blot步骤:一、配胶,准备样品(10%的胶)1、胶板中倒入去离子水,静置5min,观察是否漏水,并用滤纸垫脚调平2、弃去去离子水,加入分离胶(10%),用去离子水封口3、40min左右,分离胶凝固,倒去去离子水,加入积层胶4、快速插入梳子(以免积层胶凝固,梳子要用去离子水冲洗干净,并将去离子水甩掉,否则会在胶板上留下不能用的孔道)5、20min左右,将胶板置于去离子水中4℃保存,防止胶中的水分蒸发,发生缩胶现象。
Western Blot 实验步骤及注意事项

Western Blot 实验步骤及注意事项western blot的实验步骤及注意事项一、实验步骤1.缓冲液配制(1) Transfor Buffer: 2.9g Glycine, 5.8gTris, 0.37g SDS(可不加), 200ml Methanol(临用前加),ddH2O to 1L(2)10×TBS: 1 M Tris・HCl(pH 7.5)100 mL, 88 g NaCl, ddH2O to 1L (3)TBST: 1×TBS中加入1/1000的Tween (4)封闭液:脱脂奶粉5%(w/v),用TBST配制 2. SDS-PAGE电泳电压:积层胶电泳电压80V左右,分离胶电泳电压110V~120V 3.免疫印迹(1) SDS 聚丙烯酞胺凝胶电泳结束后,将胶放至转移缓冲液中浸泡15m in,切6张Whatman 3mm滤纸和1张PVDF膜,与凝胶大小相符合。
将PVDF膜事先用甲醇浸泡,再用转移缓冲液浸泡。
(2) 将凝胶及PVDF膜以“三明治”状(即3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸)逐层铺于转印仪上,凝胶一面连接阴极,100 V转移40 min(根据转移蛋白的分子量确定转移时间)。
(3) 将膜放入小盒中,加入5 mL封闭液,摇床上温育1 h。
(4) 以1/1000的比例,加入5 μL第一抗体,4 ℃温育过夜。
(5) TBST溶液洗膜10 min,轻倒,重复3次。
(6)加入 5 mL TBST溶液,以1/2000的比例,加入2.5 μL第二抗体,温育1 h。
(7) TBST溶液洗膜5min,轻倒,重复3次。
(8)加入2 mL显色底物温育3 min,将薄膜封入保鲜袋中,压平,尽可能不留空气,滤纸吸干显色底物。
放入夹板中。
(9)配制显影液和定影液。
暗室操作:将X光片放入夹板中,曝光5 s(根据荧光强度确定),然后放入显影液中,至出现明显的条带取出,水洗后放入定影液中,定影一段时间,取出用水冲洗干净。
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Western bolt
一、实验目的
通过实验了解western blot技术的原理和操作。
二、实验原理
SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。
PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基硫酸钠),SDS会与变性的多肽,并使蛋白带负电荷,由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关,因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关,在达到饱和的状态下,每克多肽可与1.4g去污剂结合。
当分子量在15KD到200KD之间时,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,符合下式:logMW=K-bX,式中:MW为分子量,X为迁移率,k、b均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane,简称NC膜),在胶体金试纸中用做C/T线的承载体,同时也是免疫反应的发生处。
NC膜是生物学试验中最重要的耗材之一。
第一抗体就是能和特异性抗原特异性结合的蛋白。
第二抗体是能和抗体结合,即抗体的抗体,其主要作用是检测抗体的存在,放大一抗的信号。
化学发光HRP底物(辣根过氧化物酶底物,也常被称为ECL试剂)是目前Western blot检测中最为灵敏的试剂。
显影液的A液主要成分为鲁米诺(Luminol)及发光增强剂,B液主要成分为过氧化物溶液。
二抗上含有HRP(辣根过氧化物酶),可以催化A液和B液反应发光。
三、实验器材
1.电泳槽,胶板架子
2.转膜仪
3.NC膜
4.电泳电源
5.滤纸
6.摇床
7.X射线摄影暗匣
8.X射线胶片
9.塑料薄膜
四、实验试剂
1.runningbuffer
5xrunningbuffer(1L)
Tris 15.1g
Glycine 94.0g
SDS 5.0g
ddH2O 定容至1L
使用前稀释5倍
2.Transfer buffer
10×Transfer buffer(1L)
Tris 30.3g
Glycine 144.0g
ddH2O 定容至1L
使用前稀释10倍,加入1/4体积的甲醇
3.TBS
10×TBS(500mL)
Tris 12.1g
Nacl 40.0g
ddH2O 定容至500mL
用HCl调节溶液的pH值至7.6
4.TBST(1L)
1×TBS:Tween-20=1000:1
ddH2O定容至1L
5.5%的脱脂奶粉溶液(50ml)
脱脂奶粉 2.5g
TBST 定容至50ml
6.一抗溶液
7.二抗溶液
8.显影液现配现用,溶液A:溶液B=1:1配置。
9.SDS-PAGE(配方见下一页)
五、操作步骤
1.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
1.1SDS-PAGE胶的配置
①先清洗胶板,用去离子水冲洗后放在架子上待干。
②准备好试剂。
③计算所需要使用试剂的量。
例:6%的分离胶,每块胶板分离胶约需要7ml,10块胶,共需要70ml
④将胶板安装在架子上,较低的板朝外,注意底部要平,以防漏胶。
较高的板有正反之分,上面的“up”朝上。
⑤准备配胶按照上面配方依次添加。
注意:1.添加量少的试剂要注意混匀
2.TEMED,APS要最后加
⑥配好分离胶,将胶液注入胶板缝隙中。
注意速度不能太慢,否则胶液会凝,越是浓度高的胶液凝的越快。
⑦分离胶加入后,用异丙醇或水封平胶面,注意在加入异丙醇或水的时候要缓慢
不要过分冲击胶,否则容易导致分离胶的液面两边凹陷或不平整。
⑧半小时后观察分离胶是否凝结,左右轻轻倾斜胶板看是否有出现胶面晃动。
凝结后,将异丙醇或水到掉,将架子倒置去除多余的异丙醇或水。
⑨配置浓缩胶,同配置分离胶相似,配方不同。
配好后倒胶。
每块胶用约3ml。
注意不要到过多的浓缩胶,以防插梳子后胶会溢出,倒置在之后用胶前拔梳子的时候出现上扬孔破损现象。
且倒胶后应尽快插梳子,注意梳子有正反。
A.分离胶
B.浓缩胶
1.2 凝胶电泳
①将电泳槽和胶板架子用去离子水清洗干净,把事先准备好的胶板和电泳槽与胶板架子组装好。
注意:胶板较短的一侧朝内。
②往电泳槽内注入running buffer,如果胶板架子和胶板组装的不是很严密需要将running buffer加超过上样孔,但也不要漫过胶板最上方。
③根据自己需求上样。
④盖上电泳槽的盖子,注意电极的正负。
插上电源,打开电源,设置时间和电压。
一般需要设置两次时间,浓缩胶100v,0.5h;分离胶要根据分离胶的浓度和实验的需求而定。
分离胶浓度越低,蛋白样跑的越快。
⑤开始电泳。
2.转膜(半干转)
①转一张膜需准备2张比分离胶部分略大的滤纸和1张与滤纸相同大小的NC 膜。
切滤纸和膜时一定要戴手套,因为手上的蛋白会污染膜。
在转膜前要将NC 膜先放在去离子水中浸泡几分钟,因为直接将NC膜泡在Transferring buffer 中会导致NC膜变的很皱。
(用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里,要使膜浮于水上,只有下层才与水接触。
这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。
若膜沉入水里,膜与水之间形成一层空气膜,这样会阻止膜吸水。
)
②在加有Transferring buffer 的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、一支试管、滤纸和浸过的膜。
③将转膜仪打开,在上面垫浸泡过的滤纸,用试管取一些Transferring buffer
轻轻倒在上面,再用试管来回擀几遍以擀走里面的气泡。
④在滤纸上摆放好NC膜,注意膜的中间先与滤纸接触,然后两边慢慢放下。
⑤将玻璃板撬掉才可剥胶,撬的时候动作要轻,要在两个边上轻轻的反复撬。
撬一会儿玻璃板便开始松动,直到撬去玻板。
(撬时一定要小心,玻板很易裂。
)除去小玻璃板后,将浓缩胶轻轻刮去(浓缩胶影响操作),要避免把分离胶刮破。
记住正反面,切去一角已标记方向。
⑥小心剥下分离胶去离子水中清洗掉上面的废胶,后用手拿着胶的轻轻置于NC 膜上,注意胶的中间要先与NC膜接触,然后慢慢放下,以防有气泡。
用手调整使其与NC膜对齐,轻轻用玻棒擀去气泡。
⑦在最上面铺上最后一层滤纸。
⑧用纸吸取多余的Transferring buffer。
⑨盖上转膜仪的盖子,插上电源,打开电源,设置时间和电压,25v,45min。
3.免疫反应
1.取出NC膜于,用剪刀减去多余的NC膜部分,用同样的方法剪去一个角,标记正反。
将NC膜置于TBS中在摇床上摇3次,10分钟/次,倒去TBS液。
2.封闭:加入5%的脱脂奶粉溶液,1h,倒去。
3.一抗(1:10000)孵育4℃过夜。
4.取出NC膜,用TBST在摇床上洗三次,每次15min。
5.封闭:加入5%的脱脂奶粉溶液,1h,倒去。
6.用同样的方法,二抗(1:10000)孵育,1h。
7.取出NC膜,用TBST洗三次,每次15min。
4.显影
①取两张塑料膜,剪成比膜大的相同的大小。
将其中一张铺在X射线摄影暗匣里。
②按照1:1配制好显影液,混匀。
③将NC膜平铺在第一张塑料膜上,将显影液均匀的铺在NC膜上,左右摇晃X射线摄影暗匣使显影液尽量铺满NC膜。
④将第二张塑料膜从左到右或从上到下铺在最上面,用胶布粘住四边固定。
盖好夹子。
⑤在暗室里,打开夹子,取四张X射线胶片将其小心盖在塑料膜上,覆盖住NC 膜。
注意当X射线胶片盖上后就不能再横向移动,否则荧光会错位影响结果。
⑥在暗室里观察荧光情况,若所用的标签蛋白比较亮,就计时1min;否则,计时10min。
盖上夹子,计时。
⑦小心取出X射线胶片,减掉一个角以表明正反。
然后放入自动显影机中显影。
⑧拿到显影后的X射线胶片,用标签笔标记时间,Marker大小,上样信息等必要的数据。