《酶分子的化学修饰》PPT课件
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04酶分子的化学修饰
（三）酶的大分子修饰作用：可分为非共价 修饰和共价修饰两大类： 1、大分子非共价修饰：利用一些大分子试剂通
过与酶非共价相互作用，对酶进行有效的保护。 例如聚乙二醇、右旋糖苷等通过氢键固定于酶分 子的表面，同时又有效地与外部水相连，从而保 护酶的活力；一些多元醇、多糖、多聚氨基酸、 多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶活力；另 外一些蛋白质可以通过相互作用，排除分子表面 的水分子，降低介电常数，使酶的稳定性增加。
二、糖类的修饰反应： 右旋糖苷及右旋糖苷硫酸酯修饰反应：右旋糖苷是 由 -葡萄糖通过 -1，6-糖苷键连接而成的高分子 多糖，具有良好的生物相容性和水溶性，其双羟基 经过活化后可与酶分子上的游离氨基相结合。主要 的修饰方法有：溴化氰法、高碘酸氧化法。 糖肽（ Glycopeptide)的修饰反应: 糖肽是由人纤维 蛋白或 - 球蛋白经蛋白酶水解后得到的产物，其 分子上具有游离氨基，活化后可与酶分子上的氨基 反应。主要方法有：2，3- 异氰酸甲苯活化法、戊 二醛法。 聚乳糖修饰反应：聚乳糖在一定温度下，通过适当 的还原剂可与酶分子上氨基反应。
表6-3 天然酶和修饰酶抗失活因子能力比较
酶
过氧化氢酶 核糖核酸酶 溶菌酶 胰蛋白酶 - 葡萄糖苷酶 尿激酶
修饰剂
右旋糖苷 右旋糖苷 右旋糖苷 右旋糖苷 右旋糖苷 白蛋白
抗蛋白酶
抗胰蛋白酶 抗蛋白酶 抗糜蛋白酶 抗胰蛋白酶
第八章 酶分子的化学修饰
催化活性/非催化活性基团的修饰
对非催化基团修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对 特殊底物的束缚能力。 经常被修饰的残基是： 亲核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His 亲电的Tyr、Trp 对催化活性基团可以通过选择性修饰侧链成分来实现 氨基酸的取代。
根据氨基酸侧链R基的极性，20种氨基酸可分成4类。
NO2
I2＋
+ HI
R NH NH CH
2HC
R
C
C CH2 S CH3
C H
NH NH CH
2HC
C CH2
S+
C H
C O
O
O
C Br
N
HC Br-
N
CH3
(溴化氰基酸)
R H+ N NH CH
2HC
C CH C O
N
+
S CH3
C O
CH2
H2O
(溴化亚氨内酯)
甲基硫氰酸
R
R
H 2O
HN C CH2 CH2 COOH
修饰反应：酰基化与烷基化
酰基化修饰剂:
三硝基苯磺酸（TNBS）、丹磺酰氯（DNS）
烷基化修饰剂：
2，4－二硝基氟苯（DNFB）、碘乙酸、碘乙
酰胺、亚硝酸等
特定的氨基酸残基侧链基团的化学修饰
酶分子的化学修饰
•脂质体包裹 脂质体包裹
酶脂质体包埋属于固定化修饰之一。许多医 药酶，如SOD、溶菌酶等，由于分子量大，不 易进入细胞内，而且在体内半衰期短，产生 免疫原性反应。这些是酶在临床上必须解决 的问题。为此，可通过酶的表面化学修饰来 解决。例如：SOD用聚乙二醇(PEG)修饰后， 其在体内的稳定件及免疫原性都大大改善。 至于如何进入细胞内，用脂质体包裹是个有 效的方法。
最近，人们用抗体来稳定酶。抗体能在蛋白质开始伸 展部位或被蛋白酶水解的部位起作用，因而起到稳定 作用。例如：α-淀粉酶与其抗体的复合物在70℃半衰 期为16h，而天然酶仅为5min。 任何酶都有它相对应的抗体，制备亦较简单、迅速， 所以，用抗体稳定酶的方法较普遍。但制备抗体花费 较多，解决的办法是用微生物来生产。 最近报告表明，已经成功地由大肠杆菌生产具有完整 功能的重组抗体片段，而且用同一种微生物既能生产 目的蛋白又生产其抗体的可能性。另一个问题是解决 酶-抗体复合物在体内的抗原性。目前采用降低抗体分 子的大小制造嵌合抗体。
（4）固定化修饰
一般是通过酶表面的酸性或碱性氨基酸残基将酶 共价连接到惰性载体上，由于酶所处的环境的改 变，会使酶的性质，特别是动力学性质发生改 变．例如：固定在电荷载体上，由于介质中的质 子靠近载体，并与载体上的电荷发生作用，使酶 的最适pH向碱性(阴离子载体)或向酸性(阳离子载 体)方向偏移。这样，在生产工艺中需几个酶协同 作用时，由于固定化可使不同酶的最适pH彼此靠 近。例如：将糖化酶固定在阴离子载体上，其最 适pH由4.5升到6.5，与D-木糖异构酶的最适 PH(7.5)靠近，这样，可简化高果糖浆生产工艺。
酶分子的化学修饰
原酶PPL和修饰酶PA-PPL在20 ℃下存放时，酶活性的变化很小， 而在30 ℃下存放时酶活性明显降低，在40℃和50℃下存放时， 酶活性迅速降低．40℃ 时PA-PPL的半哀期为95min，较PPL的半 衰期延长了20min；50 ℃PA-PPL的半衰期为48 min，较PPL的半 衰期延长了1倍．可见原酶PPL经PA修饰后热稳定性也明显提高
实验步骤：脂肪酶PPL的PA修饰→PA.PPL修饰度 的测定→脂肪酶水解活性的测定→酶的pH稳定 性和热稳定性测定 细节注意：1.修饰度测定采用三硝基苯磺酸分光 光度法测定（确定酶已修饰） 2.酶活采用橄榄油乳化液法测 定．在40℃、pH 7.0的条件下，将每分钟从橄 榄油中释放1 umol脂肪酸的酶量定义为一个酶 活性单位(U）。
二、原理、修饰剂及反应
1、化学修饰原理
1）增强酶天然构象的稳定性与耐热性
修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶 形成多点交联。使酶的天然构象产生 “刚性”结构。
2）保护酶活性部位与抗抑制剂 部 大分子修饰剂与酶结合后，产生的空 间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖” 了酶的活性部位。
3）维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶
几种重要的修饰反应： 烷基化反应 酰化反应 氧化还原反应 芳香环取代反应
烷基化反应
酰基化反应
氧化还原反应
连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基。
实验步骤：脂肪酶PPL的PA修饰→PA.PPL修饰度 的测定→脂肪酶水解活性的测定→酶的pH稳定 性和热稳定性测定 细节注意：1.修饰度测定采用三硝基苯磺酸分光 光度法测定（确定酶已修饰） 2.酶活采用橄榄油乳化液法测 定．在40℃、pH 7.0的条件下，将每分钟从橄 榄油中释放1 umol脂肪酸的酶量定义为一个酶 活性单位(U）。
二、原理、修饰剂及反应
1、化学修饰原理
1）增强酶天然构象的稳定性与耐热性
修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶 形成多点交联。使酶的天然构象产生 “刚性”结构。
2）保护酶活性部位与抗抑制剂 部 大分子修饰剂与酶结合后，产生的空 间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖” 了酶的活性部位。
3）维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶
几种重要的修饰反应： 烷基化反应 酰化反应 氧化还原反应 芳香环取代反应
烷基化反应
酰基化反应
氧化还原反应
连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基。
第四章：酶分子修饰
修饰剂
常使用的水溶性大分子修饰剂主要有： ①相对分子质量为1000—10000聚乙二醇(PEG)； 其次是多糖类，如右旋糖苷(dextran)、聚蔗糖 （ficoll）、淀粉、壳聚糖、β－环糊精，琼脂糖等； ②同源蛋白质及人工合成的多肽类，如牛血清白 蛋白、免疫球蛋白、聚丙氨酸、聚赖氨酸等； ③长链脂肪酸类以及聚烯属烃基氧化物等，如硬 脂酸、月桂酸、棕榈酸等。
OH B O
NH2 ENZ N C NH2
+
O O
pH7～9 25℃
OH
OH
HN NH C N ENZ
硼酸盐
HN NH C N ENZ
（4）巯基修饰
定义: 定义:使酶分子侧链上巯基改变，从而改变酶的空间 构象、特征及功能。 修饰剂：5 5′－二硫代－双（2 修饰剂：5，5′－二硫代－双（2－硝基苯甲酸） DTNB，巯基乙醇，硫带硫酸盐，硼氢化钠等。 DTNB，巯基乙醇，硫带硫酸盐，硼氢化钠等。
复习思考题
1 2
3
4
酶分子修饰的概念和作用。 酶分子修饰的概念和作用。 何谓金属离子置换修饰？ 何谓金属离子置换修饰？简述其主要修 饰过程和作用？ 饰过程和作用？ 何谓大分子结合修饰、 何谓大分子结合修饰、肽链有限水解修 氨基酸置换修饰和核苷酸置换修饰？ 饰、氨基酸置换修饰和核苷酸置换修饰？ 简述定点突变技术的主要技术过程。 简述定点突变技术的主要技术过程。
现代酶工程-5-酶分子的化学修饰
缺点： 由于它来源于微生物，对人而 言是一种外源性蛋白，有较强的免 疫原性，临床上常见进行性免疫反 应和全身性过敏反应，而限制了其 临床应用。
改进方法 ——利用聚乙二醇修饰后的天冬 酰胺酶不仅可降低或消除酶的抗 原性，而且可以提高酶的抗蛋白 水解的能力，延长酶在体内半衰 期，提高药效。
结果 美国FDA正式批准的用于治疗急性淋 巴细胞白血病的培门冬酶（Pegaspargase, 商品名为Oncaspar）即为L-天冬酰胺酶的 聚乙二醇螯合物，该产品已于1994年首先 在美国上市。
一般在开始设计酶化学修饰反应时须对被 修饰酶的活性部位、稳定条件、侧链基团性质 等应尽可能全面掌握。
在此基础上选择合适的化学修饰剂进行化 学修饰，在选择化学修饰剂时，除了需要考虑 修饰剂的种类、修饰剂上的反应基团的数目和 位置以及修饰剂上反应基团的活化方法和条件 以外，还需要考虑修饰剂的分子量等其它可能 会影响修饰反应的因素。
大分子共价修饰：
——利用一些可溶性大分子，通过共价 键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖 层，形成的可溶性酶具有许多有用的性 质。例如用聚乙二醇共价修饰超氧化物 歧化酶（SOD），不仅可以降低或消除酶 的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力， 延长了半衰期，从而提高了药效。
（四）分子内交联 ——增加酶分子表面的交联键数 目是提高酶稳定性的有效方法之 一，例如胰凝乳蛋白酶上的羧基 经过羰二亚胺活化后，可以与一 系列二胺发生作用，使酶的稳定 性得到改善。
酶的化学修饰
（2）蛋白主链的修饰：蛋白主链的 修饰主要靠酶法。比如猪和人的胰 岛素仅在B链羧基端有一个氨基酸的 差别。用蛋白水解酶将猪胰岛素B链 末端的天冬氨酸（Ala）水解下来。 在在一定的条件下，将同一个酶色 氨酸Thr接上去，就可以将猪胰岛素 转变成人胰岛素。
催化活性集团的修饰：如果把一 种氨基酸侧链化学转变为另一种 新的氨基酸侧链的方法叫做化学 突变。
酶化学修酶的局限性
（1）某种修饰剂对某一氨基酸侧链 化学的修饰专一性是相对的，很少 有对某一氨基酸侧链绝对专一的化 学修饰。 （2）化学修饰后酶的构象或多或少 有一些改变。
3）酶的化学修饰只能在有极性 的氨基酸上进行。而其它氨基酸 侧链在维持空间构象方面也起着 重要作用且从种属上分析，他们 在进行中比较保守。
4）酶化学修饰的结果对于研究酶的 结构与功能的关系提供一些信息， 但是缺乏准确性。
化学修饰的前景 化学修饰法可以改变天然美的一些特性，扩 大酶得一些应用范围，化学修饰法是改变酶 分子的有效方法，而且已获得了一定的规律 性和普遍性，据有广泛的应用前景。但是并 不是所有的酶经过化学修饰后都能改变其天 然的不足，及化学修饰法并不适应所有的酶； 也不是经过化学修饰后，酶的所有特性均得 到改善，又是修饰的结果难以预测，不易解 释。基因工程法、人工模拟法、某些物理修 饰方法，各有优点，可以弥补化学方法的不 足。
与辅因子有关的修饰：1、对依 赖辅因子的酶可用两种方法进行 化学修饰。一、如果辅因子与酶 的结合不是共价的，则可将辅因 子共价结合在没上。引入新的或 修饰过具有强反应性的辅因子。
第五章：(酶工程) 酶分子修饰
20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基 酸的侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。
•几种重要的修饰反应类型： 烷基化反应 酰化反应 氧化还原反应 芳香环取代反应
1. 化学修饰反应的类型
1) 烷基化反应
试剂特点：烷基上带活泼卤素，导致酶分子的亲核基
团（如－NH2，-SH等）发生烷基化。
可作用基团：
氨基（Lys，Arg），巯基（Cys），羧基（Asp、Glu）， 甲硫基（Met），咪唑基（His）。
氨基酸或核苷酸的置换修饰可以采用化学修饰方法，例如，Bender 等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换 为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出 现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化学修饰法难度大，成 本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以 工业化生产。
合）。 (5)酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水
作用等次级键结合。
Active site
The active site is the region of the enzyme that binds the substrate, to form an enzyme-substrate complex, and transforms it into product. The active site is a three-dimensional entity, often a cleft or crevice on the surface of the protein, in which the substrate is bound by multiple weak interactions.
•几种重要的修饰反应类型： 烷基化反应 酰化反应 氧化还原反应 芳香环取代反应
1. 化学修饰反应的类型
1) 烷基化反应
试剂特点：烷基上带活泼卤素，导致酶分子的亲核基
团（如－NH2，-SH等）发生烷基化。
可作用基团：
氨基（Lys，Arg），巯基（Cys），羧基（Asp、Glu）， 甲硫基（Met），咪唑基（His）。
氨基酸或核苷酸的置换修饰可以采用化学修饰方法，例如，Bender 等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换 为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出 现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化学修饰法难度大，成 本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以 工业化生产。
合）。 (5)酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水
作用等次级键结合。
Active site
The active site is the region of the enzyme that binds the substrate, to form an enzyme-substrate complex, and transforms it into product. The active site is a three-dimensional entity, often a cleft or crevice on the surface of the protein, in which the substrate is bound by multiple weak interactions.
酶分子修饰
大分子修饰(共价)的过程
修饰剂的选择：大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。例 如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖 、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。要根据酶分子的 结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。
修饰剂的活化：作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的 基团进行反应而结合在一起。在使用之前一般需要经过活化，然后 才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。
Protein Engineering）和酶分子组成单位置换修 酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行，目前还不能用化学修饰的方法研究非极性氨基酸残基在酶结构与功能关系中
的作用。
饰中常用的技术。定点突变技术，为氨基酸或核 酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行，目前还不能用化学修饰的方法研究非极性氨基酸残基在酶结构与功能关系中
应用最广的修饰剂
聚乙二醇是线性分子，溶解度高，具有良 好的生物相容性，在体内无毒性、无残留、 无抗原性，分子末端有可活化的羟基，活 化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛 用于酶的修饰。
可用多种不同试剂活化，修饰不同基团 聚乙二醇均三嗪、聚乙二醇琥珀酰亚胺 聚乙二醇马来酸酐、聚乙二醇胺
(四) 氨基酸置换修饰
将酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸 的修饰方法称为氨基酸置换修饰
1.化学修饰方法氨基酸置换
4酶的分子修饰
(3) 酶分子的侧链基团修饰
采用一定的方法（一般为化学法） 使酶蛋白的侧链基团发生改变，从 而改变酶分子的特性和功能的修饰 方法。
可以用于研究各种基团在酶分子中 的作用及其对酶的结构、特性和功 能的影响。在研究酶的活性中心中 的必需基团时经常采用。
酶有蛋白类酶和核酸类酶两大类别。它们 的侧链基团不同，修饰方法也有所区别。
破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除
“遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合
2. 大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表 面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化， 维持酶活性部位微环境相对稳定。
4.2 酶分子修饰的基本要求和条件
对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件的 选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。
(2) 酶的大分子修饰
采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价 结合，使酶分子的空间构象发生改变，
从而改变酶的特性与功能的方法
非共价修饰
使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加 物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通过氢键固定在酶分子表 面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。
+ HI
7）酚羟基的化学修饰
来源：Tyr 修饰反应：芳香环取代反应 修饰剂：碘、硝化试剂（四硝基甲烷）
（1）蛋白类酶主要由蛋白质组成，酶蛋白的侧链基团是指 组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。主要包括氨基、 羧基、巯基、胍基、酚基、咪唑基、吲哚基等。这些基 团可以形成各种副键，对酶蛋白空间结构的形成和稳定 有重要作用。侧链基团一旦改变将引起酶蛋白空间构象 的改变，从而改变酶的特性和功能。
6.酶的化学修饰
孙利芹 2013制作
2.静电相互作用
带电的修饰剂能被选择性吸附到蛋白质源自文库面带相反电荷 的部位，静电相互作用可使修饰剂向多功能部位中的一个 残基定位或向多功能基的一侧定向。
例如，碘乙酸和碘乙酰胺烷基化的速度和烷基化部位的 差异,就是静电影响造成的.究竟是烷化N1上的咪唑还是N3上 的，这是由静电相互作用而决定的。
咪唑基、酚羟基、咪唑基、吲哚基、胍基、甲硫基等。
修饰反应
酰化反应、烷基化反应、氧化和还原反应、芳香环 取代反应等类型。
孙利芹 2013制作
1.羧基的修饰
其中水溶性的碳二亚胺类 特定修饰已成为最普遍的 标准方法。可以在较温和的条件下进行，但一定条件下， Ser、Cys和Tyr也可反应。
R
O
ENZ C
确定必需基团的性质和数据
1961年，Ray 等提出用比较一级
动力学常数的方法；
1962年，邹承鲁建立邹氏作图法
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§4.3 酶蛋白的修饰
化学修饰的措施
修饰酶的特性
蛋白质化学修饰的局限性
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一、化学修饰的措施
(一）酶蛋白侧链的修饰
修饰酶的功能基团
酶蛋白侧链上的功能基： -NH3、 -SH 、 -COOH
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二、修饰剂反应性的决定因素
1.选择吸附
2.静电相互作用
带电的修饰剂能被选择性吸附到蛋白质源自文库面带相反电荷 的部位，静电相互作用可使修饰剂向多功能部位中的一个 残基定位或向多功能基的一侧定向。
例如，碘乙酸和碘乙酰胺烷基化的速度和烷基化部位的 差异,就是静电影响造成的.究竟是烷化N1上的咪唑还是N3上 的，这是由静电相互作用而决定的。
咪唑基、酚羟基、咪唑基、吲哚基、胍基、甲硫基等。
修饰反应
酰化反应、烷基化反应、氧化和还原反应、芳香环 取代反应等类型。
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1.羧基的修饰
其中水溶性的碳二亚胺类 特定修饰已成为最普遍的 标准方法。可以在较温和的条件下进行，但一定条件下， Ser、Cys和Tyr也可反应。
R
O
ENZ C
确定必需基团的性质和数据
1961年，Ray 等提出用比较一级
动力学常数的方法；
1962年，邹承鲁建立邹氏作图法
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§4.3 酶蛋白的修饰
化学修饰的措施
修饰酶的特性
蛋白质化学修饰的局限性
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一、化学修饰的措施
(一）酶蛋白侧链的修饰
修饰酶的功能基团
酶蛋白侧链上的功能基： -NH3、 -SH 、 -COOH
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二、修饰剂反应性的决定因素
1.选择吸附
酶分子的化学修饰
如何化学修饰
如何化学修饰
1.2羧基的化学修饰
羧基的化学修饰主要是对酶分子的谷氨 酸和天冬氨酸残基 进行修饰，修饰产物一般是含酯类或酰 胺类的修饰酶，由 于羧基是一个不太活泼的功能团，使得 利用羧基进行修饰的方法非常有限，图 5—2所示为几种修饰剂与羧基的反应
如何化学修饰
如何化学修饰
1.3巯基的化学修饰
巯基在维持酶分子亚基间的相互作用和 酶的催化过程中起 着重要作用，因此开发了许多修饰巯基 的特异性试剂，酶 分子的巯基具有很强的亲核性，半胱氨 酸残基是酶分子中 最容易起反应的侧链功能团。
如何化学修饰
如何化学修饰
1.4组氨酸咪唑基的化学修饰
许多酶的活性中心具有组氨酸残基，咪 唑基的常用修饰剂有焦碳酸二乙酯(DPC) 和碘乙酸(IAA)(图5—4)。DPC在近中性 的pH下对组氨酸残基有较好的专一性， 产物240nm处有最大光吸收，可以跟踪 反应进程和定量分析。焦碳酸二乙酯和 碘乙酸都能修饰咪唑环上的两个氮原子，
如何化学修饰
MPEG氨基类衍生物 MPEG与亮氨 酸的a一氨基或赖氨酸的 a一氨基 和e一氨基反应，制备出 MPEG的 氨基酸类衍生物再通过 N．-羟基 琥珀酰亚胺活化。蜂巢 MPEG聚乙 醇与马来酸酐形成的共 聚物(PM) 具有多个反应位点，呈
如何化学修饰
如何化学修饰
2.2右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯对酶的修饰
第六章 酶分子化学修饰
（二）小分子修饰 （酶蛋白侧链基团修饰）
•定义：通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分
子侧链上特定的功能基团发生化学反应。
•侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。
主要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。
•侧链基团修饰剂：采用的各种小分子化合物。
20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基 酸的侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。
酶的活性中心(active
center):
由必需基团构成的与酶催化活性有关的 特定区域.
非必需基团
酶 分 子
必需基团
活性中心外 必需基团
结合基团
活性中心 必需基团
催化基团
活 性 中 心
维持酶活 性中心应 有空间构 象所必需 的基团
影响底物中某些 与底物相 化学键的稳定， 结合，使底 催化底物发生化 物与酶的一 学反应并将其转 定构象形成 化成产物
酰基化修饰剂:
常用焦碳酸二乙酯（diethyl paracarbonate）
+
+ C2H5OH +CO2
烷基化修饰剂：碘乙酸
+ ICH2COOH + HI
7）酚羟基的化学修饰 来源：Tyr 修饰反应：芳香环取代反应 修饰剂：碘、硝化试剂（四硝基甲烷）
8）吲哚基的化学修饰
来源：Trp 修饰反应：氧化反应
第七章酶分子工程-化学修饰
2）大分子共价修饰：利用一些可溶性大分子，通 过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖 层，形成的可溶性酶具有许多有用的性质。
例如：用聚乙二醇共价修饰SOD，不仅可以降低或消除 酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了半衰 期，从而提高了药效。
聚乙二醇（PEG）
___常使用的水溶性大分子修饰剂
7.反相胶团微囊化：
– 这是近年来发展起来的酶在有剂相中进行催化的技
术，反相胶团中酶的稳定性大大提高；一些表面活 性剂溶解在非极性有机溶剂中时可自发地形成近似 球状的反相胶团，反相胶团是表面活性剂的疏水尾 部朝外而极性头部朝内的微胶团，其内部可容纳一 定量的水，酶溶解在其中避免变性。
加H2O
加酶液
催化活性基团的修饰：通过选择性修饰催化活性氨基 酸的侧链来实现氨基酸残基的取代，使一种氨基酸侧 链转化为另一种氨基酸侧链，这种方法又称为化学突 变法。 肽链伸展后的修饰：酶蛋白经过脲、盐酸胍处理，使 肽链充分伸展，对酶分子内部的疏水基团进行修饰， 然后在适当条件下，重新进行折叠
（三）与辅因子相关的修饰
1.选择修饰剂要考虑的问题
实际要根据修饰目的来选择：
–
– –
1）：如：对氨基的修饰可有几种情况：
修饰所有氨基，而不修饰其它基团；
仅修饰α-氨基； 修饰暴露的或反应性高的氨基以及修饰具有催化活性的氨基等。
第六章_酶分子修饰
（3）酶的主要动力学性质的不适应
（Km值大，与底物的亲和力小）
米氏常数Km值过大，使反应在低底物浓度下不能 高速进行，由于体内各种代谢物质的浓度较低， 对Km较大的酶用于临床检测或治疗时，影响就更 大。
（4）临床应用的特殊要求
绝大多数酶来自动、植物及微生物，对人体来说 这些酶都是外源蛋白质，具有抗原性，都有可能 引起人体的过敏反应。
可与酶蛋白侧链上的羧基发生反应的小分子化合物， 发生羧基酯化、酰基化，或结合生成其他物质，改 变酶pr.的空间构象，从而改变酶的某些特性和功能。
修饰剂: 碳化二亚胺（CDC）、乙醇-HCl、异恶唑 盐、甲醇－HCl酯化
含有羧基的氨基酸：天门冬氨酸、谷氨酸等
3、胍基修饰剂
精氨酸残基含有一个强碱性的胍基，很难被修饰， 而一些二羰基化合物能够在中性或弱碱性条件下 与精氨酸反应。
第六章 酶分子修饰
一、酶分子修饰的原因
酶在生物技术中占有核心地位 酶具有反应专一性、催化效率高及反应条件温
和等优点，在工业、农业、医药等方面得到越 来越多的应用。
大规模应用的酶及酶工艺尚不够多，导致这种现 象的原因是多方面的，这主要表现在：
(1) 稳定性
酶是生物活性大分子。一旦离开生物细胞，离开 其本身特定的作用环境，在发酵分离提纯、反应、 制剂及固定化等过程中，常常显得不够稳定，不 能适应大量生产条件的需要。
酶化学修饰
PEG的应用
(a) L-天冬酰胺酶 L-天冬酰胺酶具有较强的抗肿瘤作用，它能
将肿瘤细胞生长所需的L-天冬酰胺水解为天冬氨 酸和氨，从而特异并有效地抑制肿瘤细胞的恶性 生长。天然的L-天冬酰胺酶制剂静脉注射过后清 除速率过快，根据酶来源不同和个体的差异，酶 在体内的半衰期只有6-20h，反复注射还会刺激人 体的免疫系统产生抗原-抗体反应，增加酶的清除 速率，并可能产生严重的过敏反应。采用PEG进 行修饰不仅可降低或消除酶的抗原性，且可以提 高酶的抗蛋白质水解的能力，延长酶在体内的半 衰期，提高药效。
/%
20 21 22 23 24 25 26 27
天然酶 0
100
﹢﹢﹢﹢﹢﹢ ﹢ ﹢
﹢﹢﹢﹢﹢﹢ ﹢ ﹢
﹢﹢﹢﹢﹢﹢ ﹢ ﹢
右旋糖 69.8+0.28 酐T40 修饰酶
21.3+0.6
﹢﹢﹢﹢﹢﹢ ﹢ ﹢ ﹢﹢﹢﹢﹢﹢ ﹢
32.0+0.6
80.0+0.39 ﹢ ﹢ ﹢ ﹢ ﹢ ﹢ — — ﹢﹢﹢ ﹢
饰，发现不同的修饰剂可在不同程度降低 抗原性，抗原性降低程度与氨基酸修饰程 度成正相关，氨基修饰程度越高，解除抗 原性越好。但是不同分子质量的修饰酶， 其抗原性的降低与酶活力的减少均与修饰 剂分子大小有关 。
表1 右旋糖酐修饰L-天冬酰胺酶的抗原性
样品
-NH2修饰率 酶活力/% 抗原-抗体结合能力/%
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2. 无电荷的极性R基氨基酸（共7种）：
丝氨酸(Serine,Ser,S), 苏氨酸(Threonine,Thr,T), 酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y), 半胱氨酸(Cysteine,Cys,C), 天冬酰胺(Asparagine,Asn,N), 甘氨酸(Glycine,Gly,G), 谷氨酰胺(Glutamine,Gln,Q)
8.3 酶分子的侧链基团修饰
通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链 上特定的功能基团发生化学反应，从而改变酶分 子的特性和功能的修饰方法。
可以用于研究各种基团在酶分子中的作用及其对 酶的结构、特性和功能的影响。在研究酶的活性 中心中的必需基团时经常采用。
酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基 上的功能团。主要包括氨基、羧基、巯基、胍基、 酚基等。这些基团可以形成各种副键，对酶蛋白 空间结构的形成和稳定有重要作用。侧链基团一 旦改变将引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变 酶的特性和功能。
酶分子修饰的意义
提高酶的活力 activity 增强酶的稳定性 stability 降低或消除酶的抗原性 immunological property 研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子
和各种物理因素对酶分子空间构象的影响 structure
8.2 酶分子化学修饰的方法学
对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件的选 择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。
Chapter 8 Modification of Enzyme Molecule
酶分子的化学修饰
Contents of chapter 8
Go 1、酶分子化学修饰的基本原理 Go 2、酶分子化学修饰的方法学 Go 3、肽链有限水解修饰 Go 4、酶分子的侧链基团修饰 Go 5、大分子的结合修饰 Go 6、亲和标记
几种重要的修饰反应：
烷基化反应 酰化反应 氧化还原反应 芳香环取代反应 磷酸化反应
酰化及其相关反应
O
O
C
R
OH O
E
20种不同氨基酸侧链基团中只有极性氨基酸侧链 易被修饰，它们一般具有亲核性。
催化活性/非催化活性基团的修饰
对非催化基团修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对特 殊底物的束缚能力。
经常被修饰的残基是： 亲核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His 亲电的Tyr、Trp
对催化活性基团可以通过选择性修饰侧链成分来实现氨 基酸的取代。
8.3 肽链有限水解
利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构 发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。
酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/酶原激活法。
a、胃蛋白酶原的激活
胃蛋白酶原 HCl pH1.5～2
胃蛋白酶（从N端失去44个氨基酸残基）
自身激活
酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况 中的一种：
1 引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。
2 仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。
3 有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部 位，酶活力提高。
后两种情况，肽链的水解在限定的肽键上进行， 称肽链有限水解。
b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活
c、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活
8.1 酶分子化学修饰的基本原理
通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变 酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。即： 在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物 质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接， 从而改变酶的结构和性质。
1、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成 多点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结 构。
根据氨基酸侧链R基的极性，20种氨基酸可分成4类。
1. 非极性R基氨基酸（共8种）：
丙氨酸(Alanine,Ala,A), 亮氨酸(Leucine,Leu, L), 缬氨酸(Valine,Val,V)), 异亮氨酸(Isoleucine,Ile,I), 苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe,F), 色氨酸(Tryptophan,Trp,W), 甲硫氨酸(Methionine,Met,M), 脯氨酸(Proline,Pro,P)
3.带正电荷的极性R基氨基酸（wenku.baidu.com3种）：
赖氨酸(Lysine,Lys,K), 精氨酸(Arginine,Arg,R), 组氨酸(Histidine,His,H)
4.带负电荷的极性R基氨基酸（共2种）：
天冬氨酸(Aspartic acid,Asp,D), 谷氨酸(Glutamic acid,Glu,E)
（1）酶的稳定性 热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、抑制剂等。
（2）酶活性中心的状况 活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、 亚基数等。
酶分子修饰的条件
修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶 活性功能的必需基团，使修饰率高，同时酶的活力回收 高。 （1）pH与离子强度 pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由 于它们的解离状态不同，反应性能也不同。 （2）修饰反应的温度与时间 严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专 一性的修饰反应。 （3）反应体系中酶与修饰剂的比例
2. 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减 少了受蛋白水解酶破坏的可能性。
四、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境
1. 酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成 了共价键。
破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除
“遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合
2. 大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表 面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化， 维持酶活性部位微环境相对稳定。
2、如何保护酶活性部位与抗抑制剂 大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍 或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活 性部位。
三、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水 解酶
酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：
1. 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶 接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭 破坏。