不结球白菜游离小孢子培养及再生植株的倍性鉴定
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从表２可以看出，在不同开花时期进行培养， 小孢子胚诱导率差异显著。第ｌ朵花蕾开花后６～ １０ ｄ培养，胚诱导率最高可达３．０８爪／蕾，ｌ １一 １５ ｄ次之。在开花后不到５ ｄ和１６—２０ ｄ两个时期
培养，胚诱导率分别为１．１７爪／蕾和１．５０似蕾。
开花前（小于０ ｄ）和大于２０ ｄ接种胚诱导率较 低。这可能由于在开花初期和末期，同一花蕾中小 孢子发育的同步性较差，单核靠边期的小孢子占的 比例较小，相应小孢子胚诱导率也较低。
不结球白菜（口麟５池ｃ口碑聊￡巾ｓｓｐ．ｃ＾ｉ聊瑚厶Ｍａｋｉｎｏ）原产中国，是长江中、下游地区人们喜食的 蔬菜。在蔬菜周年供应上，尤其是淡季供应上占有重要的地位。不结球白菜是异花授粉植物，天然杂交 率高，在育种上获得一个纯系需要５～６年的时间。游离小孢子培养可以获得双单倍体植株，大大节省 纯化时间和工作量。小孢子还是一种优良的转化受体，它具备了单细胞和单倍体两个特性，不会获得杂 合体或嵌合体，因此是突变体筛选和基因工程研究的理想材料。曹鸣庆等…首次报道不结球白菜游离 小孢子培养获得成功。李岩等口］、卢钢等旧】、蒋武生等Ｈ１和耿建峰等”ｏ获得不结球白菜小孢子再生植 株，并对影响培养的基本因素进行了分析。但与结球白菜、甘蓝、花椰菜、甘蓝型油菜等作物相比，不 结球白菜游离小孢子培养研究起步较晚，技术还不完善，可重复性不高。本研究以１０份不结球白菜品 种为材料，在前人研究基础上，对在不同开花时期取样和不同质量浓度琼脂上培养的小孢子胚再生进行 研究，获得了大量子叶形胚状体和再生植株，并分析其倍性组成，为不结球白菜小孢子培养及其应用提 供依据。
ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｆ而ｍ ８ ｇ－Ｌ一１ ｔｏ １２ ｇ·Ｌ－。ｃｏＩＩｌｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃ明ｔｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｌｌｅ ｒｅｇｅｎｅｍｔｉｏｎ ０ｆ ｅｆＩｌｂｒｙ∞． Ｂ踞ｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｎｏｗ ｃｙｔｏｍｅｎ了彻ｄ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｌＩｅ ｍｏｒＰｈｏＩｏ百ｃａｌ ｃｈａｒ跚ｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ａ ｈｊｇＩｌ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｔＩｌｅ ｓｐｏｎｔａＩＩ鲫ｕｓ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｅ硒ｃｉｅｎｃｙ如ｍ ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｌａｎｔｓ
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ｃｅ鹏ｔｉｃｓ蚰ｄ咖ｌａｓｍ ＣＨＥＮＧ Ｙ加，ＢＡＮ Ｑｉｎｇ·ｙｌｌ，ＷＡＮＧ Ｑｉ粕，ＨＯＵ ｘｉ·ｌｉｎ’
ＣＡ ＤＦＣ２９０显微镜下观察游离小孢子的发育情况。２５ ｄ后统计子叶形胚数。于７个不同开花时期（开花 前、开花１—５ ｄ、６一ｌＯ ｄ、ｌｌ—１５ ｄ、１６—２０ ｄ、２ｌ～２７ ｄ、＞２８ ｄ）取样，单株开第ｌ朵花为第ｌ天。 １．３小孢子胚的再生成苗
子叶形胚转绿后转移到固体培养基上（Ｂ５＋Ｏ．２ ｍｇ·Ｌ－１ ６一ＢＡ＋Ｏ．０２ ｍｇ·Ｌ。１ ＮＡＡ＋３０ ｇ·Ｌ一蔗 糖＋琼脂（８、ｌＯ、１２ ｇ·Ｌ一））进行分化培养。每处理接种１５瓶。４周后，统计小孢子胚的成苗率。
２结果与分析
２．１小孢子离体培养的发育情况 刚分离＿｝ｌ：的小孢子形状为圆球形，有３条明显的萌发沟，正处于单核靠边期（图１一Ａ），高温热激
后细胞膨大并启动分裂（图１一Ｂ），培养５ ｄ时分裂成多细胞团（图１一Ｃ），ｌＯ ｄ后肉眼可见到圆球形 胚形成（图ｌ—Ｄ），继ｎｌｉ发育成心形胚（图１一Ｅ）、鱼雷形胚（图１一Ｆ）、子叶形胚（图ｌ—Ｇ）。将生 长良好的小孢子胚转移到固体培养基中（图ｌ—Ｈ），部分胚玻璃化、褐化死亡（图ｌ—Ｉ），多数胚开始 直立生长，子叶膨大，生长点萌动，逐渐长出真叶（图ｌ—Ｊ）。经过多次继代诱导生根后进行驯化移栽 （图１一Ｋ），最后将小孢子植株移人人阳乍长（图１一Ｌ），
将生根良好的再生植株炼苗ｌ周左右，移栽到基质中（ｙ（草炭）：ｙ（蛭石）：ｙ（珍珠岩）＝ ３：３：１）。２周后移栽到大田，管理措施同普通植株。 １．４小孢子再生植株的倍性鉴定
在试管苗移栽２周后，选取暑绿和黄帮小孢子再生植株各３０株参照张振超等∞！的测定方法，采用 美国Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ公司生产的Ｅｐｉｃｓ ｘＬ型流式细胞仪测定ＤＮＡ含量，以普通二倍体材料作为对照。 开花期对所有再生植株进行形态鉴定。
成妍，班青宇，王倩，侯喜林＋
（南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室，江苏南京２１００９５）
摘要：对影响不结球白菜小孢子培养和植株再生的几个因素及再生植株的倍性进行分析。结果表明：基因型是影响小孢
子胚诱导率的最重要因子，正反交材料的胚诱导率无显著差异；供体植株开花后６一１０ ｄ培养可获得高的胚诱导率；琼
对再生植株用流式细胞仪进行倍性检测（图２为流式直方图），二倍体对照与双单倍体的分离峰都
矿
１９
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万方数据
２００
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荧光强度 ｎｕｏ坤ｓ伸ｎＰＰ ｉｎｔ帅Ｂｉｔｙ
荧光强度
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图２不同倍性植株的ＤＮＡ含量峰值
ｐＩ蛐 ｎ孚２ ＤＮＡ∞咄ｎｔ ｏｆ ｍ岫ｂ啪山ｄｉｍ阳ｎｔ
图ｌ不结球白菜小孢子在离体培养中的发育过程
ｎ蛋ｌ Ｄｌｅｖｄｏｐｍｅｎｔ ｐｒｏｃｅ鲻ｏｆ ｌＩｌｉｃｒ惦ｐｏｒｅ ｏｆ ｎｏｎ．ｈ∞ｍｎｇ Ｃｈｉｎｅ∞ｃａｂｂａｇｅ如ｐ咖
Ａ．刚游离的小孢子（ｘ４００）Ｆｒｅｓｈ ｍｉｃｍ８Ｉ，‘，”；Ｂ．膨大的小饱子（ｘ４００）Ｓｗｅｌｌｉｎｇ ｍｉｒｎＨｐｏｒｅ；Ｃ．分裂成细胞团（×２００）Ｄｉｖｉｄ． ｉｎｇ １０ ｃｅｌｌ ａｇｆ；ｌｏｍＰｍ旧；Ｄ．圆球形胚（×４０）Ｇ１０ｂｕｌⅡｅｍｂｒｙｏ；Ｅ．心形胚（×２０）Ｈｅａｎ ｓＩａｇｅ ｅｍｂｒｙｏ；Ｆ．鱼雷形胚（×２０）Ｔｏｒｐｅｄｏ ｓｌａ矿 ｅｍｂｒｙｏ；Ｃ．子叶形胚（×６．３）Ｃｏｔｙｌｅｄｏ”ａｒｙ ｅｍｂｒｙｏｓ；Ｈ．小孢子胚再生Ｅｍｂｒｙ∞ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ；１．再生中玻璃化Ｖ“６ｃａ６０ｎ；Ｊ．再，￡植 株Ｒｅｇｅｎｅｒａｌｅｄ ｐｌａｎＩｌＰｌ‘；Ｋ．移栽成陌ＰｌａｎｔｌＰｈ ａｎＰｒｌｒａｎ５ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ；Ｌ田问生长状况Ｐｌａｎｔ ｇｒ０诵ｎｇ ｉｎ ｎｅｌｄ
南京农业大学学报２００９，３２（２）：２５—２９
Ｊ０ｕ舢ｆ矿№咖增船廊础ｕ划‰ｉ眦ｓ毋
ｈｎｐ：／／ｎａｕｘｂ．１１ｊａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
成妍，班青宇，王倩，等．不结球白菜游离小孢子培养及再生植株的倍性鉴定［Ｊ］．南京农业大学学报，２００９，３２（２）：２５—２９
不结球白菜游离小孢子培养及再生植株的倍性鉴定
收稿日期：２００７一１１—０５ 基金项目：国家８６３计划项目（２００６ＡＡＩ∞ｌ嬲， 作者简介：成妍，博士研究生。‘通讯作者：侯喜林，教授，从事蔬菜遗传育种及分子生物学研究，Ｅ一毗ｉｌ：ｈｘｌ＠ｎｊ毗ｅｄｌＬ蜘。
万方数据
南京农业大学学报
第３２卷
１．２小孢子的分离和培养 小孢ｆ分离参照耿建峰等’５。的方法。每皿接４个花蕾：３３℃培养２４ ｈ后转入２５℃黑暗培养。在ＬＥＩ－
２８
南京农业大学学报
第３２卷
出现在荧光强度为１４０处（图２一Ａ），单倍体的分离峰都出现在荧光强度为７０处（图２一Ｂ）；若分离 峰出现在其他位置则为其他倍性的材料，若出现多个分离峰则为混倍体。追踪这些植株于抽薹开花时进 行形态鉴定，单倍体植株矮小细弱、分枝多、叶片细长、无花粉或败蕾；双单倍体植株同二倍体对照， 生长发育良好、有花粉。两种倍性分析方法结果一致，表明通过流式细胞仪可以准确鉴别小孢子再生植 株的倍性。由表４可知，获得的再生株大多数为双单倍体，说明不结球白菜在小孢子培养过程中自然加 倍率较高，其中暑绿的双单倍体比率高达９０％。这町能是由于单倍体植株忍受田间不利环境的能力较 差，死苗率高，而双倍体植株相对健壮，存活率高。基因型差异在再生株的自然加倍率上也有体现，在 相同的培养与生长条件下，黄帮比暑绿的双单倍体比率低很多（表４）。本试验中没有发现混倍体或其 他倍性较高的植株。
脂在８一１２ ｇ·Ｌ“范围内，随着质量浓度的提高可显著提高小孢子胚再生率。结合流式细胞仪和植株形态鉴定，不结球
白菜小孢子再生植株自然加倍率总体水平较高，有的高达９０％，但不同基因型间有明显差异。
关键词：不结球白菜；小孢子培养；再生植株；倍性鉴定
中图分类号：Ｓ６３４．３
文献标志码：Ａ
文章编号：１０００一２０３０（２００９）０２—００２５—０５
Ｅ融ｔ ＴａＭｅ ３
ｏｆ ａ韵ｒ ｃｏｎｃｅｎｔ均ｔｉ仙ｏｎ ｒｅｇｅｎｅｒａ廿ｏｎ ０ｆ
ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｅ ｅｍｂｒｙ惦
２．４琼脂质量浓度对小孢子胚再生植株的影响 从表３可以看出，在不同质量浓度琼脂的培养基上，小孢子胚再生率差异显著。当琼脂为８ ｇ·Ｌ一
时，多数小孢子胚玻璃化，有些甚至褐化死亡，只有少数胚能直接成苗，大多数胚产生愈伤后才分化成 苗。接种在琼脂为ｌＯ ｇ·Ｌ。１和１２ ｇ·Ｌ’１的培养基上，２种材料小孢子胚的再生率都明显提高。相同条 件下黄帮的小孢子胚再生率低于暑绿。黄帮在琼脂浓度为１０ ｇ·Ｌ‘１和１２ ｇ·Ｌ一时，小孢子胚再生率没 有显著差异。 ２．５小孢子再生植株的倍性分析
１材料与方法
１．１材料 供试不结球白菜材料为暑绿、寒笑、矮抗五号、矮抗六号、黄邦、Ｎ１４一１７×Ｎ２９一１６８、Ｎ２９一１６８×
Ｎ１４一１７、苏州青、二青、Ｎ３０一２５。于２００５年１０月上旬育苗，１１月上旬移栽于南京农业大学园艺学 院江浦试验站，２００６年３月上旬进人花期，栽培管理措施同一般大田。
（Ｓｔａｔｅ Ｋｅ）ｒ Ｉａｂｏ阳ｔｏｒｙ ０ｆ Ｃｒｏｐ
Ｅｎｈ锄ｃｅｍｅｎｔ，ＮａｎｊｉＩＩｇ Ａ鲥ｃｕｌｔｕｒａＩ Ｕｌｌｉｖｅ嵋时，№ｎｊｉＩｌｇ ２１００９５，Ｃｌｌｉｍ）
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２．２不同基因型小孢子胚诱导率的差异比较 从表１可以看出，供试的１０个基因型都获得了胚状体，但不同基因型小孢子胚胎发生能力差异很
万方数据
第２期
成妍，等：不结球白菜游离小孢子培养及再生植株的倍性鉴定
２７
大，出胚率最高的基因型Ｎ２９—１６８×Ｎ１４一１７ （２７．５个／蕾）是苏州青（０．１４个／蕾）的近２００ 倍。方差分析显示，正反杂交组合基因型Ｎ１４— １７×Ｎ２９—１６８、Ｎ２９一１６８×Ｎ１４一１７问小孢子胚诱 导率无显著差异。 ２．３不同开花时期对小孢子胚诱导率的影响
表２ 开花时期对小孢子胚诱导率的影响 Ｔｈｂｋ ２ ｈ田ｕｅｎｃｅ ｏｆ ｉｎｎｏｒｅ虻ｅｎｃｅ ａ鸯ｅ ｏｎ ｉｎｄｕｃｅ瑚哪毗ｒ砒ｅ
ｏｆ ＩＩＩｉｃｒｏｓｐｏｒｅ ｅｍｂｒｙ惦
表ｌ 不同基因型小孢子胚诱导率的比较
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ｂｒｙ惦ｉｎ ｄｉ仃ｅｒｅｎｔ ｇｅｎｏｔｙｐ鹤
注：不同Ｊ二标字母表示在Ｏ．０５水平差异显著。 Ｎｏｔｅ：１１１ｅ ｄｉ雎ｒｅｎｔ ｓｕｐｅＭｒｉｐＩｌｅｔｔｅ舟ｉｎｄｉｃａｔｅ ８ｉ和雠∞ｌ ｄｉＩＸ眦ｍｅ
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表３琼脂质量浓度对小孢子胚再生的影响
ｇｅ肿呻幅． ｗ晒ｏｂｓｅｎｒｅｄ ｉｎ ｎｏｎ－ｈｅａｄｉｎｇ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｃａｂｂａｇｅ，ｅｖｅｎ ｌｏ ９０％，柚ｄ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｏｂｖｉｏｕｓ ｄｉ仃ｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ 蛋沁ｙ ｗｏｒｄｓ：蜀＿０黯缸Ｄ ｃ口删螂ｔｒ厶Ｂｓｐ．ｃ＾洫ｗ厶；Ｉｎｉｃｒ∞ｐｏｒｅ ｃｌｌｌｔｕ阳；ｍｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｐｌ锄ｔ８；ｐ１０ｉｄｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
培养，胚诱导率分别为１．１７爪／蕾和１．５０似蕾。
开花前（小于０ ｄ）和大于２０ ｄ接种胚诱导率较 低。这可能由于在开花初期和末期，同一花蕾中小 孢子发育的同步性较差，单核靠边期的小孢子占的 比例较小，相应小孢子胚诱导率也较低。
不结球白菜（口麟５池ｃ口碑聊￡巾ｓｓｐ．ｃ＾ｉ聊瑚厶Ｍａｋｉｎｏ）原产中国，是长江中、下游地区人们喜食的 蔬菜。在蔬菜周年供应上，尤其是淡季供应上占有重要的地位。不结球白菜是异花授粉植物，天然杂交 率高，在育种上获得一个纯系需要５～６年的时间。游离小孢子培养可以获得双单倍体植株，大大节省 纯化时间和工作量。小孢子还是一种优良的转化受体，它具备了单细胞和单倍体两个特性，不会获得杂 合体或嵌合体，因此是突变体筛选和基因工程研究的理想材料。曹鸣庆等…首次报道不结球白菜游离 小孢子培养获得成功。李岩等口］、卢钢等旧】、蒋武生等Ｈ１和耿建峰等”ｏ获得不结球白菜小孢子再生植 株，并对影响培养的基本因素进行了分析。但与结球白菜、甘蓝、花椰菜、甘蓝型油菜等作物相比，不 结球白菜游离小孢子培养研究起步较晚，技术还不完善，可重复性不高。本研究以１０份不结球白菜品 种为材料，在前人研究基础上，对在不同开花时期取样和不同质量浓度琼脂上培养的小孢子胚再生进行 研究，获得了大量子叶形胚状体和再生植株，并分析其倍性组成，为不结球白菜小孢子培养及其应用提 供依据。
ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｆ而ｍ ８ ｇ－Ｌ一１ ｔｏ １２ ｇ·Ｌ－。ｃｏＩＩｌｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃ明ｔｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｌｌｅ ｒｅｇｅｎｅｍｔｉｏｎ ０ｆ ｅｆＩｌｂｒｙ∞． Ｂ踞ｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｎｏｗ ｃｙｔｏｍｅｎ了彻ｄ
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子叶形胚转绿后转移到固体培养基上（Ｂ５＋Ｏ．２ ｍｇ·Ｌ－１ ６一ＢＡ＋Ｏ．０２ ｍｇ·Ｌ。１ ＮＡＡ＋３０ ｇ·Ｌ一蔗 糖＋琼脂（８、ｌＯ、１２ ｇ·Ｌ一））进行分化培养。每处理接种１５瓶。４周后，统计小孢子胚的成苗率。
２结果与分析
２．１小孢子离体培养的发育情况 刚分离＿｝ｌ：的小孢子形状为圆球形，有３条明显的萌发沟，正处于单核靠边期（图１一Ａ），高温热激
后细胞膨大并启动分裂（图１一Ｂ），培养５ ｄ时分裂成多细胞团（图１一Ｃ），ｌＯ ｄ后肉眼可见到圆球形 胚形成（图ｌ—Ｄ），继ｎｌｉ发育成心形胚（图１一Ｅ）、鱼雷形胚（图１一Ｆ）、子叶形胚（图ｌ—Ｇ）。将生 长良好的小孢子胚转移到固体培养基中（图ｌ—Ｈ），部分胚玻璃化、褐化死亡（图ｌ—Ｉ），多数胚开始 直立生长，子叶膨大，生长点萌动，逐渐长出真叶（图ｌ—Ｊ）。经过多次继代诱导生根后进行驯化移栽 （图１一Ｋ），最后将小孢子植株移人人阳乍长（图１一Ｌ），
将生根良好的再生植株炼苗ｌ周左右，移栽到基质中（ｙ（草炭）：ｙ（蛭石）：ｙ（珍珠岩）＝ ３：３：１）。２周后移栽到大田，管理措施同普通植株。 １．４小孢子再生植株的倍性鉴定
在试管苗移栽２周后，选取暑绿和黄帮小孢子再生植株各３０株参照张振超等∞！的测定方法，采用 美国Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ公司生产的Ｅｐｉｃｓ ｘＬ型流式细胞仪测定ＤＮＡ含量，以普通二倍体材料作为对照。 开花期对所有再生植株进行形态鉴定。
成妍，班青宇，王倩，侯喜林＋
（南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室，江苏南京２１００９５）
摘要：对影响不结球白菜小孢子培养和植株再生的几个因素及再生植株的倍性进行分析。结果表明：基因型是影响小孢
子胚诱导率的最重要因子，正反交材料的胚诱导率无显著差异；供体植株开花后６一１０ ｄ培养可获得高的胚诱导率；琼
对再生植株用流式细胞仪进行倍性检测（图２为流式直方图），二倍体对照与双单倍体的分离峰都
矿
１９
Ｏ ０
万方数据
２００
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枷８００
荧光强度 ｎｕｏ坤ｓ伸ｎＰＰ ｉｎｔ帅Ｂｉｔｙ
荧光强度
Ｆｌ山Ⅱｔ卵ｅｎＰＰ ｍ啮ｉｔｙ
图２不同倍性植株的ＤＮＡ含量峰值
ｐＩ蛐 ｎ孚２ ＤＮＡ∞咄ｎｔ ｏｆ ｍ岫ｂ啪山ｄｉｍ阳ｎｔ
图ｌ不结球白菜小孢子在离体培养中的发育过程
ｎ蛋ｌ Ｄｌｅｖｄｏｐｍｅｎｔ ｐｒｏｃｅ鲻ｏｆ ｌＩｌｉｃｒ惦ｐｏｒｅ ｏｆ ｎｏｎ．ｈ∞ｍｎｇ Ｃｈｉｎｅ∞ｃａｂｂａｇｅ如ｐ咖
Ａ．刚游离的小孢子（ｘ４００）Ｆｒｅｓｈ ｍｉｃｍ８Ｉ，‘，”；Ｂ．膨大的小饱子（ｘ４００）Ｓｗｅｌｌｉｎｇ ｍｉｒｎＨｐｏｒｅ；Ｃ．分裂成细胞团（×２００）Ｄｉｖｉｄ． ｉｎｇ １０ ｃｅｌｌ ａｇｆ；ｌｏｍＰｍ旧；Ｄ．圆球形胚（×４０）Ｇ１０ｂｕｌⅡｅｍｂｒｙｏ；Ｅ．心形胚（×２０）Ｈｅａｎ ｓＩａｇｅ ｅｍｂｒｙｏ；Ｆ．鱼雷形胚（×２０）Ｔｏｒｐｅｄｏ ｓｌａ矿 ｅｍｂｒｙｏ；Ｃ．子叶形胚（×６．３）Ｃｏｔｙｌｅｄｏ”ａｒｙ ｅｍｂｒｙｏｓ；Ｈ．小孢子胚再生Ｅｍｂｒｙ∞ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ；１．再生中玻璃化Ｖ“６ｃａ６０ｎ；Ｊ．再，￡植 株Ｒｅｇｅｎｅｒａｌｅｄ ｐｌａｎＩｌＰｌ‘；Ｋ．移栽成陌ＰｌａｎｔｌＰｈ ａｎＰｒｌｒａｎ５ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ；Ｌ田问生长状况Ｐｌａｎｔ ｇｒ０诵ｎｇ ｉｎ ｎｅｌｄ
南京农业大学学报２００９，３２（２）：２５—２９
Ｊ０ｕ舢ｆ矿№咖增船廊础ｕ划‰ｉ眦ｓ毋
ｈｎｐ：／／ｎａｕｘｂ．１１ｊａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
成妍，班青宇，王倩，等．不结球白菜游离小孢子培养及再生植株的倍性鉴定［Ｊ］．南京农业大学学报，２００９，３２（２）：２５—２９
不结球白菜游离小孢子培养及再生植株的倍性鉴定
收稿日期：２００７一１１—０５ 基金项目：国家８６３计划项目（２００６ＡＡＩ∞ｌ嬲， 作者简介：成妍，博士研究生。‘通讯作者：侯喜林，教授，从事蔬菜遗传育种及分子生物学研究，Ｅ一毗ｉｌ：ｈｘｌ＠ｎｊ毗ｅｄｌＬ蜘。
万方数据
南京农业大学学报
第３２卷
１．２小孢子的分离和培养 小孢ｆ分离参照耿建峰等’５。的方法。每皿接４个花蕾：３３℃培养２４ ｈ后转入２５℃黑暗培养。在ＬＥＩ－
２８
南京农业大学学报
第３２卷
出现在荧光强度为１４０处（图２一Ａ），单倍体的分离峰都出现在荧光强度为７０处（图２一Ｂ）；若分离 峰出现在其他位置则为其他倍性的材料，若出现多个分离峰则为混倍体。追踪这些植株于抽薹开花时进 行形态鉴定，单倍体植株矮小细弱、分枝多、叶片细长、无花粉或败蕾；双单倍体植株同二倍体对照， 生长发育良好、有花粉。两种倍性分析方法结果一致，表明通过流式细胞仪可以准确鉴别小孢子再生植 株的倍性。由表４可知，获得的再生株大多数为双单倍体，说明不结球白菜在小孢子培养过程中自然加 倍率较高，其中暑绿的双单倍体比率高达９０％。这町能是由于单倍体植株忍受田间不利环境的能力较 差，死苗率高，而双倍体植株相对健壮，存活率高。基因型差异在再生株的自然加倍率上也有体现，在 相同的培养与生长条件下，黄帮比暑绿的双单倍体比率低很多（表４）。本试验中没有发现混倍体或其 他倍性较高的植株。
脂在８一１２ ｇ·Ｌ“范围内，随着质量浓度的提高可显著提高小孢子胚再生率。结合流式细胞仪和植株形态鉴定，不结球
白菜小孢子再生植株自然加倍率总体水平较高，有的高达９０％，但不同基因型间有明显差异。
关键词：不结球白菜；小孢子培养；再生植株；倍性鉴定
中图分类号：Ｓ６３４．３
文献标志码：Ａ
文章编号：１０００一２０３０（２００９）０２—００２５—０５
Ｅ融ｔ ＴａＭｅ ３
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ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｅ ｅｍｂｒｙ惦
２．４琼脂质量浓度对小孢子胚再生植株的影响 从表３可以看出，在不同质量浓度琼脂的培养基上，小孢子胚再生率差异显著。当琼脂为８ ｇ·Ｌ一
时，多数小孢子胚玻璃化，有些甚至褐化死亡，只有少数胚能直接成苗，大多数胚产生愈伤后才分化成 苗。接种在琼脂为ｌＯ ｇ·Ｌ。１和１２ ｇ·Ｌ’１的培养基上，２种材料小孢子胚的再生率都明显提高。相同条 件下黄帮的小孢子胚再生率低于暑绿。黄帮在琼脂浓度为１０ ｇ·Ｌ‘１和１２ ｇ·Ｌ一时，小孢子胚再生率没 有显著差异。 ２．５小孢子再生植株的倍性分析
１材料与方法
１．１材料 供试不结球白菜材料为暑绿、寒笑、矮抗五号、矮抗六号、黄邦、Ｎ１４一１７×Ｎ２９一１６８、Ｎ２９一１６８×
Ｎ１４一１７、苏州青、二青、Ｎ３０一２５。于２００５年１０月上旬育苗，１１月上旬移栽于南京农业大学园艺学 院江浦试验站，２００６年３月上旬进人花期，栽培管理措施同一般大田。
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２．２不同基因型小孢子胚诱导率的差异比较 从表１可以看出，供试的１０个基因型都获得了胚状体，但不同基因型小孢子胚胎发生能力差异很
万方数据
第２期
成妍，等：不结球白菜游离小孢子培养及再生植株的倍性鉴定
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大，出胚率最高的基因型Ｎ２９—１６８×Ｎ１４一１７ （２７．５个／蕾）是苏州青（０．１４个／蕾）的近２００ 倍。方差分析显示，正反杂交组合基因型Ｎ１４— １７×Ｎ２９—１６８、Ｎ２９一１６８×Ｎ１４一１７问小孢子胚诱 导率无显著差异。 ２．３不同开花时期对小孢子胚诱导率的影响
表２ 开花时期对小孢子胚诱导率的影响 Ｔｈｂｋ ２ ｈ田ｕｅｎｃｅ ｏｆ ｉｎｎｏｒｅ虻ｅｎｃｅ ａ鸯ｅ ｏｎ ｉｎｄｕｃｅ瑚哪毗ｒ砒ｅ
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表ｌ 不同基因型小孢子胚诱导率的比较
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注：不同Ｊ二标字母表示在Ｏ．０５水平差异显著。 Ｎｏｔｅ：１１１ｅ ｄｉ雎ｒｅｎｔ ｓｕｐｅＭｒｉｐＩｌｅｔｔｅ舟ｉｎｄｉｃａｔｅ ８ｉ和雠∞ｌ ｄｉＩＸ眦ｍｅ
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表３琼脂质量浓度对小孢子胚再生的影响
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