代谢组学法研究三聚氰胺对儿童尿液代谢的影响

Vol .31
高等学校化学学报
No .1
2010年1月
CHE M I CAL JOURNAL OF CH I N ESE UN I V ERSI TI ES
57～60
代谢组学法研究三聚氰胺对儿童尿液代谢的影响
王　勇
1,2
,江芝婷
1,2
,梁琼麟2,王义明2,王　梅3,罗国安
1,2
(1.华东理工大学药学院,上海200237;2.清华大学化学系,北京100084;
3.长春市儿童医院急诊科,长春130051)
摘要　运用代谢组学方法研究了三聚氰胺对儿童尿液代谢的影响.通过超高效液相色谱2飞行时间质谱
(UP LC /T OF 2M S )法分析儿童尿样的代谢指纹图谱,质谱数据采用Marker Lynx 软件处理,然后使用主成分分
析和偏最小二乘判别分析法分析病例组和正常对照组之间的代谢物谱差异,并通过变量重要性投影(V I P )选取潜在的生物标志物,结合质谱同位素分析和数据库检索对潜在的生物标志物进行鉴定.结果表明,三聚氰胺通过肾结石导致的物理性损伤干扰了柠檬酸代谢.代谢组学法能够应用于三聚氰胺导致的代谢异常的研究及三聚氰胺导致肾损伤的无创检测.
关键词　代谢组学;超高效液相色谱2飞行时间质谱;三聚氰胺;肾脏损伤;柠檬酸代谢中图分类号　O657.63 文献标识码　A 文章编号　025120790(2010)0120057204
收稿日期:2009203230.
联系人简介:罗国安,男,教授,博士生导师,从事生命分析化学研究.E 2mail:luoga@tsinghua .edu .cn
三聚氰胺(Mela m ine,结构式见图1),简称三胺,学名三氨三嗪,又名氰尿酰胺,俗称蜜胺,是一F i g .1　Structure of m el am i n e 种重要的氮杂环有机化工原料,白色结晶粉末,无味.主要用来生产塑料、胶水和阻燃剂,并被用于木材加工、塑料及涂料等行业,目前是重要的尿素后加工产品.由于每个三聚氰胺分子中都含有6个氮原子,含氮比例高达6617%.在原料或食品中加入三聚氰胺,可造成蛋白含量虚假增高.但是三聚氰胺没有任何营养价值,且对动物和人体有害.2007年3月,美国发生多起猫、狗宠物中毒死亡事件.经美国食品药品管理局调查,初步认为宠物食品中含有的三聚氰胺是导致猫、狗中毒死亡的原因.三聚氰胺高温下可能分解产生氰化物,动物食用后可以使动物发生肾衰竭并导致死亡.2008年9月8日,我国甘肃省陆续报道多例婴幼儿泌尿系统结石病例,随后多个省份相继发现类似病例,调查发现与食用含有三聚氰胺的婴幼儿配方奶粉有关.代谢组学
[1,2]
是通过考察生物体系受刺激或扰动后其代谢产物的变化或其随时间的变化,
是研究生物体系代谢途径的一种技术.其研究平台主要有核磁共振(NMR )[3,4]、液相色谱2质谱(LC 2MS )[5～9]和气相色谱2质谱(GC 2MS )[10,11]法.通过代谢组学手段研究三聚氰胺对人体代谢的影响
尚未见报道.本文以三聚氰胺导致肾结石儿童和健康儿童的尿样为研究对象,采用代谢组学的研究方法,以超高效液相色谱2飞行时间质谱(UP LC /T OF 2MS )建立了尿样的代谢指纹谱,结合主成分分析和偏最小二乘判别分析进行数据分析,试图寻找三聚氰胺对人体代谢的影响和潜在的生物标志物.
1　实验部分
1.1　仪器与试剂
美国W aters Acquity UP LC 超高效液相色谱仪;美国W aters LCT Pre m ier XE 质谱仪.甲醇和乙腈均
为色谱纯,购自美国Baker 公司;甲酸(纯度98%)购自美国Sig ma 公司;超纯水(1812M Ω)由M illi pore (法国)系统制得.1.2　样本来源及处理
7名三聚氰胺导致肾病儿童和570名正常儿童尿液均来自长春市儿童医院,年龄分布在1～48个
月之间.
实验前,将尿样在室温下解冻,移取200μL 于离心管中,加入4倍量(800μL )甲醇,涡旋2m in,于4℃下以13000r/m in 离心15m in,上清液加超纯水稀释1倍,过012μm 滤膜后检测.1.3　UP LC /T O F 2M S 分析
UP LC 条件:W aters ACQU I TY BEH C 18色谱柱(100mm ×211mm ,117μm );流动相A:011%甲
酸水溶液,流动相B:乙腈;流速015mL /m in;柱温:50℃;梯度洗脱:0～5m in,流动相B 由5%(体积分数)线性增至50%(体积分数),到7m in 时增至95%.进样量:4μL.
T OF 2MS 条件:W aters LCT Pre m ier XE T M
型飞行时间质谱仪,W 负离子模式;毛细管电压2200V;
锥孔电压35V;离子源温度120℃;脱溶剂气温度350℃;脱溶剂气流量700L /h;锥孔气流量40L /h;质量扫描范围m /z 50～1000;扫描时间012s;以亮氨酸2脑啡肽进行实时精确质量校正([M -H ]-=55412615).1.4　数据分析
质谱数据采用Marker Lynx (v411,W aters )软件进行峰提取、峰对齐及归一化等处理.将处理后的数据导入SI M CA 2P (v1115,Umetrics )中进行分析.采用t 检验考察代谢物组间差异的显著性.
2　结果与讨论
2.1　UP LC /T O F 2M S 代谢指纹谱分析
方法学考察结果表明,本方法具有较好的精密度和重现性(峰面积RS D <5%,n =7),满足代谢组学研究的要求.表1列出了精密度考察的结果,表中数值为随机选取的几个代谢物的峰面积.典型的尿样总离子流(TI C )图如图2所示.
Table 1　Results of prec isi on
t R /m in 0158016501711186118721303134313531544159m /z
29219452641997335104527122263107735010966001286542125553912546131362Sa mp le 2121279113060188491365716842122331375313223919061125Sa mp le 2221269118664113471625711840151301975018123618759122Sa mp le 2321128717962120511285616640198321195017123319860103Sa mp le 2421379019262126481196318539155311955013623415958197Sa mp le 2521349113265171471305612738191321525110623918358176Sa mp le 2621338912161151481435811140129301905116723813462184Sa mp le 2721368415961168461655813639148311694918122318657197RS D (%)
3181
2192
2171
3117
4139
2176
2173
2122
2137
2180
F i g .2　UP LC 2M S BP I chro ma togram of a ur i n e s am ple
2.2　病例组和对照组代谢指纹谱差异
图3为主成分分析(PCA )和偏最小二乘判别分析(P LS 2DA )得到的得分矩阵投影图.从图3(A )中
可以看出,病例组与对照组差异并不明显,采用PCA 无法将两组样本完全分开.改用P LS 2DA 对数据进行处理,分离效果大大改善,基本能够实现完全分离.采用P LS 2DA 对实验数据进行分析,分离结果
如图3(B )所示.
根据P LS 2DA 分析中变量重要性投影(Variable i m portance in p r ojecti on,V I P )值的顺序,结合f 检验和t 检验的方法,筛选病例组和对照组中具有明显差异的化合物,并结合质谱同位素匹配结果和H MDB 代谢物数据库检索,对各化合物进行鉴定,结果见表2.
85高等学校化学学报 Vol .31　
F i g .3　Results of PCA(A)and P L S 2DA ana lysis(B)Table 2　I den ti f i ca ti on results of the poten ti a l b i o markers
t R /m in
m /z
Component I dentificati on result Sa mp le gr oup
(Mean ±S D )Contr ol gr oup
(Mean ±S D )017317310036C 6H 6O 6([M -H ]-)Aconitic acid 29166±1916963134±39110118417810060C 9H 9NO 3([M -H ]-)H i ppuric acid 52190±1818691163±54173015819110135C 6H 8O 7([M -H ]-)Citric acid /Is ocitric acid
42195±1814613714±10311112219410495C 9H 9NO 4([M -H ]-
)Salicyluric acid /α2Hydr oxyhi ppuric acid
29191±1419460186±36151018420510353C 7H 10O 7([M -H ]-)Homocitric acid 20192±1813343167±341491141
18819930
C 6H 6O 7([M -H ]-)
Oxal osuccinic acid
32165±31117
73108±44171
据文献[12]报道,三聚氰胺在机体内的代谢属于不活泼代谢或惰性代谢,即它在机体内不会迅速发生任何类型的代谢变化.动物实验表明,三聚氰胺在猪体内快速清除,28h 排出约99%,不会在体内广泛分布.成年雄性Fischer 344大鼠的实验研究表明,三聚氰胺在大鼠体内经过24h 后,约90%以原形态从尿中排出,血浆消除半衰期约217h,尿中清除半衰期约3h [13]
.临床研究证明,人口服三聚
氰酸后24h 排出98%,半衰期为3h
[14]
.
三聚氰胺无法参与代谢,也就无法直接与体内代谢物发生相互作用.关于三聚氰胺的毒性,动物实验研究表明,三聚氰胺所导致的尿道损伤是由结石的刺激引起的,而非三聚氰胺或其代谢物与膀胱上皮细胞相互作用的结果.还有研究表明,急性肾衰与肾脏的物理性堵塞有关.
通过对以上代谢物所涉及到的代谢循环进行分析发现,差异代谢物主要集中于柠檬酸代谢循环.柠檬酸主要在近端部分被肾小管重吸收,且其代谢与清除受机体酸碱平衡的影响,机体代谢性酸中毒
会导致柠檬酸排泄减少.在机体代谢过程中,产生大量的酸(H +)、碱(HCO -3)等物质,通过肾脏等调节系统的调节,能够使体液的pH 值维持在7135～7145的正常范围.如果因为肾功能不良等原因,使机体的酸碱代谢紊乱超过了自身调节能力,体内H +
增加而HCO -
3减少,血液pH 值下降在7135以下,临床上称之为代谢性酸中毒.研究表明,代谢性酸中毒导致柠檬酸进入线粒体基质增加,细胞质中柠檬酸水平提高,肾小管对柠檬酸的吸收增加,清除率降低.
肾脏是机体维持水、电解质和酸碱平衡的重要器官,肾脏的损伤很容易导致代谢性酸中毒的形成.许多研究
[15～19]
结果显示,尿中柠檬酸水平降低是肾脏病变或损伤的一个重要指标.本研究中柠檬
酸等代谢物水平的降低,与上述研究结果相一致,从代谢层面上反映了三聚氰胺结石导致的肾脏损伤,以及该损伤对机体代谢的影响.上述结论仅为本研究的部分结果,对于三聚氰胺对机体影响的全面深入的研究及结合动物实验从定量、代谢组学以及常规病理学等角度的研究工作尚在进行中.
上述实验结果表明,基于UP LC 2T OF /MS 对于尿样的分析可以应用于三聚氰胺导致的代谢异常的研究.结石对于肾脏的损伤导致了代谢物水平的变异,因而本方法可以应用于三聚氰胺导致肾损伤的无创检测.
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　王　勇等:代谢组学法研究三聚氰胺对儿童尿液代谢的影响
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WANG Yong1,2,J I A NG Zhi2Ting1,2,L I A NG Q i ong2L in2,
WANG Yi2M ing2,WANG Mei3,LUO Guo2An1,23
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2.D epart m ent of Che m istry,Tsinghua U niversity,B eijing100084,China;
3.Em ergency D epart m ent,Children Hospital of Changchun,Changchun130051,China)
Abstract　The metabonom ics method was e mp l oyed t o investigate the possible influence of mela m ine t o the u2 rine metabolis m of the children.U rine sa mp les of7mela m ine affected children and570healthy children were collected fr om the Children Hos p ital of Changchun.The p r ofiles of the collecteed urine sa mp les were obtained with ultra perf or mance liquid chr o mat ography coup led with ti m e2of2flight mass s pectr ometry(UP LC/T OF2MS). The data were firstly p r ocessed with the s oft w are Marker Lynx,then analyzed with p rinci p le component analysis(PCA)and partial least squares discri m inant analysis(P LS2DA).The potential bi omarkers were screened out according t o the V I P(variable i m portance in p r ojecti on)value and identified with i2fit and data2 base.Most of the metabolites of significant intergr oup differences were finally found t o be in the tricarboxylic acid cycle.According t o the bi ol ogical functi ons of the obtained potential bi omarkers,it was deduced that the citric acid metabolis m was disturbed by mela m ine thr ough its kidney injury effect.The results suggest that the metabonom ics method can be utilized t o investigati on of the influence of mela m ine t o the metabolis m as well as the noninvasive exa m inati on of the mela m ine caused kidney injury.
Keywords　Metabonom ics;UP LC/T OF2MS;Mela m ine;Kidney injury;Citric acid metabolis m
(Ed.:H,J,Z)。