人巨细胞病毒UL135基因在临床低传代分离株中的
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
由上海联合基因公司完成 。通过正反两个方向 分别对目的基因的正链及负链进行测序 ,以增加实 验结果的可信性 。 1. 5 序列分析 、提交
应用软件 DNAC lub、B ioEdit、Genedoc, DNASis、 DNAStar, Sequin等 。
2 结果
2. 1 HCMV UL135基因 PCR扩增结果 对 29株低传代临床分离株进行 HCMV UL135
(V irus Laboratory, The Second Affiliated Hosp ital, China Medical University, Shenyang 110004, China)
[ Abstract] O bjective: To investigate the polymorphism of human cytomegalovirus (HCMV ) UL135 gene in the low passage clinical isolates and to study the relationship between the polymorphism and diseases caused by congenital HCMV infection. M ethods: The en2 tire HCMV UL135 gene regions of 29 clinical isolates in which positive HCMV 2DNA was detected by using fluorescence quantitative pol2 ymerase chain reaction ( FQ 2PCR ) were amp lified by polymerase chain reaction ( PCR ). Amp lified PCR p roducts were sequenced, and the sequence were analyzed. Results: Of 29 isolates, 25 were amp lified successfully. The length of UL135 open reading frame (ORF) in these 25 clinical isolates was sim ilar to that of Toledo sequence. The nucleotide mutation rate of UL135 p rotein was 0. 1% to 2. 6%. Additional or deleted sites of posttranslational modification ofUL135 p rotein were found in all clinical isolates. Conclusion: A ll DNA and deduced am ino acid sequences of UL135 gene shared great sim ilarity among HCMV clinical isolates regardless of their polymor2 phism. No correlation was found between the polymorphism ofUL135 gene and the diseases caused by congenital HCMV infection. [ Key words] cytomegalovirus; UL135 gene; polymorphism
© 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
·18·
中 国 医 科 大 学 学 报
第 35卷
1 材料与方法
1. 1 标本来源 29株 HCMV 临床分离株均来自 1988 - 1993年
2. 2 HCMV UL135 基因编码区及编码产物的氨基 酸序列比较分析结果 2. 2. 1 核苷酸序列及其编码蛋白氨基酸序列多态 性 : Toledo 株 (参 考 株 , GenBank accession number U33331)及 25 株临床低传代分离株 UL135ORF 均 为 987 bp ,预测编码 329个氨基酸的蛋白 。应用 B i2 oEdit软件对 Toledo株及 25株临床分离株进行核苷 酸及氨基酸线形化比较分析 ,结果表明在临床分离 株中 UL135基因 DNA 序列比较保守 ,核苷酸变异均 为碱基替换 ,无插入及缺失突变 , 25 株临床分离株 核酸变异率为 0. 1% ～2. 6%。绝大部分的核苷酸 为错义突变 ,引起了编码氨基酸的改变 ,与 Toledo 株比较 , 25株临床分离株 UL135编码蛋白的氨基酸 变异率为 0. 3% ～2. 5% ,变异位点多集中于第 24 位 、28位 、100位 、161～163位 、171 位 、313 ～317 位 氨基酸位点 。半胱氨酸残基在氨基酸位点 75、77、 78、111、154、276、278均高度保守 ,没有变异 。 2. 2. 2 编码蛋白翻译后修饰位点分析结果 : 应用 Genedoc软件及 Prosite数据库预测 HCMV UL135基 因编码产物含有多个翻译后修饰位点 ( posttransla2 tional modification sites) , 包括 : N 相连糖基化位点 (ANS) 、cAM P / cGM P 依赖性蛋白激酶磷酸化位点 ( cAM P) 、蛋白激酶 C磷酸化位点 ( PKC) 、酪蛋白激 酶 Ⅱ磷酸化位点 ( CKP) 、酪氨酸激酶磷酸化位点 ( TPK) 、N 相连豆寇酰化位点 (M YR ) , 这些修饰位 点散在分布于整个氨基酸序列 。 25 株临床分离株 UL135编码蛋白在大部分位点均高度保守 。有 2个 临床分离株在 CKP和 PKC修饰位点缺失 ,并有 4个 临床分离株新增了 ANS、cAM P、CKP位点 。 2. 2. 3 编码蛋白二级结构及等电点预测结果 :应用 DNASis软件进行 UL135蛋白二级结构及等电点预 测 ,结果为 :全部 25个临床分离株由于第 28位氨基 酸由异亮氨酸 ( I)变为缬氨酸 (V ) , 171位氨基酸由 酪氨酸 ( Y)变为组氨酸 (H ) , 313位氨基酸由谷氨酰 胺 (Q )变为赖氨酸 ( K)导致临床分离株 UL135蛋白 二级结构出现新的构象 ,第 28 位氨基酸 、第 313 ～ 317位氨基酸由 α螺旋变为 β折叠 ,第 171 位氨基 酸由 β折叠变为 α螺旋 。25个临床分离株第 24位 异亮氨酸 ( I) 变为亮氨酸 (L ) ,第 100 位天冬氨酸 (D )变为丙氨酸 (A ) ,但并未引起其氨基酸二级结 构的改变 ,第 161～163位氨基酸虽然没有变化 ,其 由无规则卷曲变为 α螺旋 (图 1) 。
人巨细胞病毒 ( human cytom egalovirus, HCMV ) 在人群中感染非常普遍 。引起的先天性疾病或畸形 包括肝胆消化系统疾病或畸形 [ 1 ] ;神经系统疾病或 畸形 [ 2 ] 。有研究表明 , HCMV 不同分离株在致病性 方面表现出明显差异 ,提示来自于不同临床症状患 儿 HCMV 分离株的基因结构可能存在差异 。HCMV 的实验室株 AD169 (高 传 代 株 ) 的 全 序 列 测 序 于
在我院住院的患儿 ,年龄 < 14个月 。其中黄疸患儿 18例 ,小头畸形患儿 6例 ,先天性巨结肠患儿 5例 。 标本取自同时期的 HCMV 分离实验 , - 70 ℃保存 。 并于 2000 年应用荧光定量 PCR 方法检测 HCMV 2 DNA[ 3 ] ,结果均为阳性 。 1. 2 PCR扩增 1. 2. 1 标本处理 : 取 HCMV 低传代分离株细胞培 养上清液与等量裂解液 (华美生物工程公司 )混匀 后 ,煮沸 15 m in,作为扩增模板 。 1. 2. 2 引物设计 : 按照 Toledo株序列 ,应用引物设 计软 件 p rimer p rem ier 5. 0 设 计 用 于 扩 增 HCMV UL135序列的两对引物 ,扩增产物长度分别为 512 bp 和 728 bp。上游引物 : 5′TTCCAGAAATCCAAG2 GCATAA 3′, 下 游 引 物 : 5′GGTCGAGG ACGA2 CAAAGAGC3′; 上 游 引 物 : 5′TATCGAAATC2 CGAAAGAAGA CG 3′,下游引物 : 5′GGCGTGTGCT2 GCTATACAACT 3′,引物合成由北京奥科公司完成 。 1. 3 PCR全序列扩增
Polym orph ism of human cytom ega lov irus UL 135 gene in low pa ssage clin ica l isola tes
SUN Zheng2rong, RUAN Q iang, HE Rong, MA Yan2p ing, Q I Ying, J I Yao2hua
PCR 体系为 p romega公司产品 ,总反应体积为 50μl。PCR 循环条件如下 :预变性 95 ℃, 4 m in;变 性 96 ℃, 45 s,退火 50 ℃, 1 m in,延伸 72 ℃, 1 m in, 35个循环 ; 72 ℃延伸 10 m in。 1. 5%琼脂糖凝胶电 泳后 EB 染色 ,紫外检测仪下观察扩增结果 。所有 扩增阳性标本在预定处出现单一目的产物带 ,与预 期结果一致 。 1. 4 PCR扩增阳性标本测序
中国医科大学学报 J Chin M ed Univ 第 35卷 第 1期 2006年 2月
·17·
人巨细胞病毒 UL135基因在临床低传代分离株中的 多态性研究
孙峥嵘 ,阮强 ,何蓉 ,马艳萍 ,齐莹 ,吉耀华
(中国医科大学附属第二医院病毒研究室 ,辽宁 沈阳 110004)
[摘要 ] 目的 : 研究人巨细胞病毒 (HCMV ) UL135基因编码序列在临床低传代分离株中的多态性 ,探讨 HCMV 基因多态性与 其感染引起不同临床疾病之间的关系 。方法 : 对 29株经荧光定量 PCR方法检测 HCMV 2DNA 为阳性的临床低传代分离株的 细胞培养上清液进行 HCMV UL135全序列 PCR扩增 ,并对 PCR扩增阳性的 25例标本进行序列测定及分析 。结果 : 29株临床 低传代分离株有 25株 PCR扩增阳性 。25株分离株 UL135开放读码框架 (ORF)长度均与 Toledo株相同 ,其核苷酸的变异率 为 0. 1% ～2. 6%。与 Toledo株相比 ,部分分离株具有氨基酸翻译后修饰位点的新增或缺失 。25株临床分离株 UL135蛋白质 二级结构预测结果显示了第 28位 、313～317位 、161～163位 、171位氨基酸均有蛋白质结构二级的改变 。结论 : 25株 HCMV 临床低传代分离株 UL135基因及其编码产物的氨基酸序列比较保守 ,但仍存在一定程度的多态性 ,未发现 UL135基因的变化 与 HCMV先天感染导致的不同疾病存在着相关联系 。 [关键词 ] 巨细胞病毒 ; UL135基因 ;基因多态性 [中图分类号 ] R373 [文献标识码 ] A [文章编号 ] 0258 - 4646 (2006) 01 - 0017 - 03
[基金项目 ] 国家自然科学基金资助项目 (30170986) [作者简介 ] 孙峥嵘 ( 1970 - ) ,女 ,副研究员 ,博士. 研究方向 : 医学
分子病毒学. [通讯作者 ] 阮强 , E2mail: ruanq@ cmu2h. 1996年 , CHA 等几位学者 [ 2 ]又 证实低传代实验室株 Toledo株和临床分离株 UL / b′ 区域 有 19 个 ORFs ( UL133 ～ 151 ) 在 实 验 室 AD169株中不存在 。根据小鼠动物模型 , Toledo株 比实验室株 AD169 株复制水平至少高 3 倍 , 由此 推测可能是由于实验室株 AD169 株在反复传代过 程中出现了 UL / b′区遗传信息的丢失和重排 , 并导 致其毒力和致病性的明显减弱 , 因而这 19 个 ORF 很可能在 HCMV 感染的致病性方面起重要作用 。 我们应用 PCR 及 DNA 测序技术 , 研究 HCMV UL / b′区域的 UL 135 基因在临床患儿低传代分离株中 的多态性 。
全序列 PCR 扩增 ,结果 25株阳性 ,阳性率 86. 2% , 其中黄疸 15株 ,小头畸形 6株 ,先天性巨结肠 4株 。 25株阳性临床分离株全部完成了 HCMV UL135 基 因全序列测定 , 25 株 HCMV UL135 ORF 序列已被 GenBank收录 ,序列号为 : AY7145932AY714617
应用软件 DNAC lub、B ioEdit、Genedoc, DNASis、 DNAStar, Sequin等 。
2 结果
2. 1 HCMV UL135基因 PCR扩增结果 对 29株低传代临床分离株进行 HCMV UL135
(V irus Laboratory, The Second Affiliated Hosp ital, China Medical University, Shenyang 110004, China)
[ Abstract] O bjective: To investigate the polymorphism of human cytomegalovirus (HCMV ) UL135 gene in the low passage clinical isolates and to study the relationship between the polymorphism and diseases caused by congenital HCMV infection. M ethods: The en2 tire HCMV UL135 gene regions of 29 clinical isolates in which positive HCMV 2DNA was detected by using fluorescence quantitative pol2 ymerase chain reaction ( FQ 2PCR ) were amp lified by polymerase chain reaction ( PCR ). Amp lified PCR p roducts were sequenced, and the sequence were analyzed. Results: Of 29 isolates, 25 were amp lified successfully. The length of UL135 open reading frame (ORF) in these 25 clinical isolates was sim ilar to that of Toledo sequence. The nucleotide mutation rate of UL135 p rotein was 0. 1% to 2. 6%. Additional or deleted sites of posttranslational modification ofUL135 p rotein were found in all clinical isolates. Conclusion: A ll DNA and deduced am ino acid sequences of UL135 gene shared great sim ilarity among HCMV clinical isolates regardless of their polymor2 phism. No correlation was found between the polymorphism ofUL135 gene and the diseases caused by congenital HCMV infection. [ Key words] cytomegalovirus; UL135 gene; polymorphism
© 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
·18·
中 国 医 科 大 学 学 报
第 35卷
1 材料与方法
1. 1 标本来源 29株 HCMV 临床分离株均来自 1988 - 1993年
2. 2 HCMV UL135 基因编码区及编码产物的氨基 酸序列比较分析结果 2. 2. 1 核苷酸序列及其编码蛋白氨基酸序列多态 性 : Toledo 株 (参 考 株 , GenBank accession number U33331)及 25 株临床低传代分离株 UL135ORF 均 为 987 bp ,预测编码 329个氨基酸的蛋白 。应用 B i2 oEdit软件对 Toledo株及 25株临床分离株进行核苷 酸及氨基酸线形化比较分析 ,结果表明在临床分离 株中 UL135基因 DNA 序列比较保守 ,核苷酸变异均 为碱基替换 ,无插入及缺失突变 , 25 株临床分离株 核酸变异率为 0. 1% ～2. 6%。绝大部分的核苷酸 为错义突变 ,引起了编码氨基酸的改变 ,与 Toledo 株比较 , 25株临床分离株 UL135编码蛋白的氨基酸 变异率为 0. 3% ～2. 5% ,变异位点多集中于第 24 位 、28位 、100位 、161～163位 、171 位 、313 ～317 位 氨基酸位点 。半胱氨酸残基在氨基酸位点 75、77、 78、111、154、276、278均高度保守 ,没有变异 。 2. 2. 2 编码蛋白翻译后修饰位点分析结果 : 应用 Genedoc软件及 Prosite数据库预测 HCMV UL135基 因编码产物含有多个翻译后修饰位点 ( posttransla2 tional modification sites) , 包括 : N 相连糖基化位点 (ANS) 、cAM P / cGM P 依赖性蛋白激酶磷酸化位点 ( cAM P) 、蛋白激酶 C磷酸化位点 ( PKC) 、酪蛋白激 酶 Ⅱ磷酸化位点 ( CKP) 、酪氨酸激酶磷酸化位点 ( TPK) 、N 相连豆寇酰化位点 (M YR ) , 这些修饰位 点散在分布于整个氨基酸序列 。 25 株临床分离株 UL135编码蛋白在大部分位点均高度保守 。有 2个 临床分离株在 CKP和 PKC修饰位点缺失 ,并有 4个 临床分离株新增了 ANS、cAM P、CKP位点 。 2. 2. 3 编码蛋白二级结构及等电点预测结果 :应用 DNASis软件进行 UL135蛋白二级结构及等电点预 测 ,结果为 :全部 25个临床分离株由于第 28位氨基 酸由异亮氨酸 ( I)变为缬氨酸 (V ) , 171位氨基酸由 酪氨酸 ( Y)变为组氨酸 (H ) , 313位氨基酸由谷氨酰 胺 (Q )变为赖氨酸 ( K)导致临床分离株 UL135蛋白 二级结构出现新的构象 ,第 28 位氨基酸 、第 313 ～ 317位氨基酸由 α螺旋变为 β折叠 ,第 171 位氨基 酸由 β折叠变为 α螺旋 。25个临床分离株第 24位 异亮氨酸 ( I) 变为亮氨酸 (L ) ,第 100 位天冬氨酸 (D )变为丙氨酸 (A ) ,但并未引起其氨基酸二级结 构的改变 ,第 161～163位氨基酸虽然没有变化 ,其 由无规则卷曲变为 α螺旋 (图 1) 。
人巨细胞病毒 ( human cytom egalovirus, HCMV ) 在人群中感染非常普遍 。引起的先天性疾病或畸形 包括肝胆消化系统疾病或畸形 [ 1 ] ;神经系统疾病或 畸形 [ 2 ] 。有研究表明 , HCMV 不同分离株在致病性 方面表现出明显差异 ,提示来自于不同临床症状患 儿 HCMV 分离株的基因结构可能存在差异 。HCMV 的实验室株 AD169 (高 传 代 株 ) 的 全 序 列 测 序 于
在我院住院的患儿 ,年龄 < 14个月 。其中黄疸患儿 18例 ,小头畸形患儿 6例 ,先天性巨结肠患儿 5例 。 标本取自同时期的 HCMV 分离实验 , - 70 ℃保存 。 并于 2000 年应用荧光定量 PCR 方法检测 HCMV 2 DNA[ 3 ] ,结果均为阳性 。 1. 2 PCR扩增 1. 2. 1 标本处理 : 取 HCMV 低传代分离株细胞培 养上清液与等量裂解液 (华美生物工程公司 )混匀 后 ,煮沸 15 m in,作为扩增模板 。 1. 2. 2 引物设计 : 按照 Toledo株序列 ,应用引物设 计软 件 p rimer p rem ier 5. 0 设 计 用 于 扩 增 HCMV UL135序列的两对引物 ,扩增产物长度分别为 512 bp 和 728 bp。上游引物 : 5′TTCCAGAAATCCAAG2 GCATAA 3′, 下 游 引 物 : 5′GGTCGAGG ACGA2 CAAAGAGC3′; 上 游 引 物 : 5′TATCGAAATC2 CGAAAGAAGA CG 3′,下游引物 : 5′GGCGTGTGCT2 GCTATACAACT 3′,引物合成由北京奥科公司完成 。 1. 3 PCR全序列扩增
Polym orph ism of human cytom ega lov irus UL 135 gene in low pa ssage clin ica l isola tes
SUN Zheng2rong, RUAN Q iang, HE Rong, MA Yan2p ing, Q I Ying, J I Yao2hua
PCR 体系为 p romega公司产品 ,总反应体积为 50μl。PCR 循环条件如下 :预变性 95 ℃, 4 m in;变 性 96 ℃, 45 s,退火 50 ℃, 1 m in,延伸 72 ℃, 1 m in, 35个循环 ; 72 ℃延伸 10 m in。 1. 5%琼脂糖凝胶电 泳后 EB 染色 ,紫外检测仪下观察扩增结果 。所有 扩增阳性标本在预定处出现单一目的产物带 ,与预 期结果一致 。 1. 4 PCR扩增阳性标本测序
中国医科大学学报 J Chin M ed Univ 第 35卷 第 1期 2006年 2月
·17·
人巨细胞病毒 UL135基因在临床低传代分离株中的 多态性研究
孙峥嵘 ,阮强 ,何蓉 ,马艳萍 ,齐莹 ,吉耀华
(中国医科大学附属第二医院病毒研究室 ,辽宁 沈阳 110004)
[摘要 ] 目的 : 研究人巨细胞病毒 (HCMV ) UL135基因编码序列在临床低传代分离株中的多态性 ,探讨 HCMV 基因多态性与 其感染引起不同临床疾病之间的关系 。方法 : 对 29株经荧光定量 PCR方法检测 HCMV 2DNA 为阳性的临床低传代分离株的 细胞培养上清液进行 HCMV UL135全序列 PCR扩增 ,并对 PCR扩增阳性的 25例标本进行序列测定及分析 。结果 : 29株临床 低传代分离株有 25株 PCR扩增阳性 。25株分离株 UL135开放读码框架 (ORF)长度均与 Toledo株相同 ,其核苷酸的变异率 为 0. 1% ～2. 6%。与 Toledo株相比 ,部分分离株具有氨基酸翻译后修饰位点的新增或缺失 。25株临床分离株 UL135蛋白质 二级结构预测结果显示了第 28位 、313～317位 、161～163位 、171位氨基酸均有蛋白质结构二级的改变 。结论 : 25株 HCMV 临床低传代分离株 UL135基因及其编码产物的氨基酸序列比较保守 ,但仍存在一定程度的多态性 ,未发现 UL135基因的变化 与 HCMV先天感染导致的不同疾病存在着相关联系 。 [关键词 ] 巨细胞病毒 ; UL135基因 ;基因多态性 [中图分类号 ] R373 [文献标识码 ] A [文章编号 ] 0258 - 4646 (2006) 01 - 0017 - 03
[基金项目 ] 国家自然科学基金资助项目 (30170986) [作者简介 ] 孙峥嵘 ( 1970 - ) ,女 ,副研究员 ,博士. 研究方向 : 医学
分子病毒学. [通讯作者 ] 阮强 , E2mail: ruanq@ cmu2h. 1996年 , CHA 等几位学者 [ 2 ]又 证实低传代实验室株 Toledo株和临床分离株 UL / b′ 区域 有 19 个 ORFs ( UL133 ～ 151 ) 在 实 验 室 AD169株中不存在 。根据小鼠动物模型 , Toledo株 比实验室株 AD169 株复制水平至少高 3 倍 , 由此 推测可能是由于实验室株 AD169 株在反复传代过 程中出现了 UL / b′区遗传信息的丢失和重排 , 并导 致其毒力和致病性的明显减弱 , 因而这 19 个 ORF 很可能在 HCMV 感染的致病性方面起重要作用 。 我们应用 PCR 及 DNA 测序技术 , 研究 HCMV UL / b′区域的 UL 135 基因在临床患儿低传代分离株中 的多态性 。
全序列 PCR 扩增 ,结果 25株阳性 ,阳性率 86. 2% , 其中黄疸 15株 ,小头畸形 6株 ,先天性巨结肠 4株 。 25株阳性临床分离株全部完成了 HCMV UL135 基 因全序列测定 , 25 株 HCMV UL135 ORF 序列已被 GenBank收录 ,序列号为 : AY7145932AY714617