毕赤酵母基因工程菌发酵植酸酶的条件优化研究

毕赤酵母基因工程菌发酵植酸酶的条件优化研究

刘林刘明河

（临沂师范学院生命科学学院，山东临沂276005）

［摘要］Pichiapastoris能使外源真核基因正确翻译和翻译后加工，并能对许多蛋白质产物进行分泌，使产物易于提纯，是一种极具潜力的酵母表达系统。以毕赤酵母基因工程菌为实验菌种，探索其在不同条件下的产植酸酶情况，优化发酵条件，找出高密度生长及高效产酶的最佳条件，从而降低生产成本。

［关键词］Pichiapastoris；酵母表达系统；植酸酶；发酵条件

植酸酶能将植酸降解成肌醇或磷酸肌醇和磷酸，是一种优良的食品和饲料添加剂，可消除单胃动物因不能分解植酸而引起的抗营养作用，提高机体对蛋白质及多种微量元素的利用率，具有良好的饲喂效果，同时，降低了磷对环境的污染。植酸酶真正具有开发价值的仅限于微生物经发酵生产植酸酶。国外对植酸酶的研究已有30多年的历史，但由于天然来源的植酸酶或者提取困难，或者分泌量太低，或者成本太高，难以满足生产的需要，由此构建基因工程菌，获得能高效表达植酸酶的菌株，成为解决这一问题的途径。

巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种极具潜力的酵母表达系统，它能使外源真核基因正确翻译和翻译后加工，并能对许多蛋白质产物进行分泌，使产物易于提纯；同时，自20世纪70年代起建立的以巴斯德毕赤酵母作为单细胞蛋白生产菌的高密度发酵方法已经成熟，以毕赤酵母基因工程菌为实验菌种，探索其在不同条件下的产酶情况，就能找出高密度生长及高效产酶的最佳条件，从而降低生产成本。

1酵母细胞培养时C源的选择

由于一些重组蛋白对细胞有毒害作用，通常在大容量、高密度的酵母培养过程中，需要在细胞扩增阶段用极高密度的抑制物来阻遏其他表达系统，诱导前又需将之去除。而对于P.pastoris在生物量扩增阶段，只需少量的抑制物（通常为甘油），既可以满足细胞生长，又能有效地抑制外源基因的表达；在表达阶段，让细胞耗尽剩余的甘油，再加入甲醇诱导产酶。下面就加入甘油和甲醇的浓度对菌体生长、产酶的影响进行分析。

1.1不同甘油浓度对生长的影响（图1）

在36hr之内，2.5%和4%甘油浓度下菌体的生长曲线是相似的。36hr之后，含4%甘油的菌体OD值却超过了含2.5%甘油的OD值，但两者差别并不大，说明在该条件下仍然存在限制菌体生长的其他因素妨碍其浓度提高。分析结果可知，细胞到达表达阶段时，含4%甘油的培养基中残存的甘油很多，而甘油的存在限制了外源蛋白的表达，对菌体产酶产生了一定的影响

。

图１甘油浓度对生长的影响

1.2不同甘油浓度下甲醇的浓度对于产酶的影响（图2、3）

由图2可知，在0.8%较低甘油浓度下，0.15%浓度的甲醇对于产酶较为有利，酶活可达到700U／mI。而相比之下，0.05％、0.3%浓度的甲醇下酶活较低。由图3可知，在3%较高甘油浓度下，46、82hr 时酶活到达高峰期，其他时间酶活较低。而且，在较高浓度的甲醇（0.3%）下，酶活比0.05%、0.15%浓度的甲醇要高。同时对比图2和3可知，产酶在0.8%较低甘油浓度下要高于3%较高浓度

。

图２０．８％甘油下甲醇对产酶的影响图３３％甘油下甲醇对产酶的影响

2氮源对菌体生长及产酶的影响

添加氮源的目的是为了凋节碳氮比，满足菌株的快速生长及产酶的需要。本实验是在4%的甘油浓度下。加入不同的氮源，使含氮量为0.2%，同时做一个空白对照。培养60hr，测OD值；72hr测酶活，结果见表1

：

由表1可知，玉米浆OD值最高，表明菌体长得最好；而对于产酶，以（NH）2SO4的酶活最高。因此视为该试验发酵最有利的氮源。

3pH对菌体产酶的影响

在发酵过程中，定时检测发酵液的pH值，发现随着发酵时间的延长．pH逐渐下降。当菌体基本上将1%甘油耗尽时，添加不同量的甲醇，并调节不同的初始pH值，其对酶活的影响结果见图4、5。由图4、5可知，添加0.05％和0.3%，的甲醇，初始pH为3的发酵液产酶均高于初始pH为5.5的发酵液。由此可见，pH为3时对发酵液产酶较为有利

。

图４０．０５％甲醇下ｐＨ

对产酶的影响

图５０．３％甲醇下ｐＨ对产酶的影响

4发酵工艺的优化

为了最大程度地提高菌体浓度值及酶活，需要筛选到合适的培养基，因此设计了正交实验。确定甘油、（NH）2SO4、接种量、磷含量四个因素，并以各因素的不同添加量作三个水平，结（下转第233页）

229

TECHNOLOGY TREND

TECHNOLOGY TREND

（上接第229页）果见各表2、3、4

：

由上结果分析可知：B 是最主要因素，最适水平为B2；D 其次。最适为D3；A 再次，最适为A3；C 影响最小，最适为C1。从而最优的工艺条件是：B2D3A3C1．即硫酸铵是1.0%，KH 2PO 4含量是0.8%，甘油是4%，接种量是1.0%，这个分析结果与目测结果第8号处理是一致的。

加装发射机高压电源通断设备

陆培山

金日

（延边广播电影电视局中波台，吉林延边

133000）

［摘要］美国进口的DX200中波发射机没有配备主电源的通断设备，如果不安装的话，发射机就无法安全和稳定的运行。我们在DX200

中波发射机的主变压器前加装了真空开关及控制真空开关通和断的控制电路，为我们的工作带来了极大的方便。［关键词］DX200中波发射机；高压电源通断设备；控制电路美国哈里斯公司生产的DX200中波发射机电源系统分为高压10000伏和低压380伏。高压10000伏电源经过主变压器变压为205伏后送入发射机。但是我们使用的这台DX200中波发射机没有配备高压10000伏电源通断设备。如果不安装高压10000伏电源通断设备的话，发射机的主变压器就始终处于高压带电状态，为发射机的安全优质广播和设备的检修维护造成了很大的安全隐患。于是，我们在DX200中波发射机的主变压器前加装了3台真空开关做为高压10000伏电源通断设备。三相电，每相各安装一个。如果我们使用美国进口的高压10000伏电源通断设备的话，需要花费几万元甚至十几万元的资金，现在用3台真空开关代替，仅用了几千元资金。

真空开关担负着10000伏主电源的通和断工作。10000伏电经过真空开关后到达DX200中波发射机的主变压器，由主变压器变为三相205伏电再送到发射机。

10000

伏主电源的接线框图如下：

由于DX200中波发射机没有真空开关部分的控制电路，我们在安装3台真空开关的基础上，加上了控制真空开关通和断的控制电路，线

路图如下：

其中，J1、J2、J3分别是3个真空开关的线包，线包电压为220V 。Q1为线包电压220V 的电源控制和保护开关，平时处于接通状态。K1是常开按钮开关，K2是常闭按钮开关；L1、L2、L3为3个指示灯；KJ1、KJ2、KJ3、KJ4、KJ5、KJ6分别是真空开关上的副接点。当Q1处于接通状态，说明该控制电路已经接通了220V 电源，按下K1常开按钮开关，真空开关的线包就接通了220V 电源电压并使真空开关吸合，10000V 高压电源就可以通过真空开关主触点送到DX200中波发射机的主变压器，再由主变压器变为三相205伏电送到发射机。同时，真空开关的副接点KJ1、KJ2、KJ3闭合，形成闭锁回路，短接常开按钮开关K1，使3个真空开关的线包始终接通220V 电源，真空开关始终处于吸合状态。而且，真空开关其他的副接点KJ4、KJ5、KJ6也同时吸合，3个指示灯L1、L2、L3点亮，表示3个真空开关运行正常。当发射机需要关断高压10000V 电源时，可以按下常闭按钮开关K2，断掉真空开关的线包电压，真空开关主触点断开，高压10000V 电源也就无法送到发射机了。在此控制电路中，同时用3个真空开关的副接点KJ1、KJ2、KJ3形成闭锁回路，短接常开按钮开关K1，是因为当任意一个真空开关发生故障而无法正常吸合时，可以瞬间断掉3个真空开关的线包电压，起到保护作用。

此控制电路的特点是线路简单、操作方便、经济实惠，如果三个真空开关中的一个出现故障的话，10000伏电源就无法通过每一个真

空开关。而且在DX200发射机关机后，我们可以通过此电路关闭10000伏主电源，这样就有效地保障了发射机维修人员的安全。经过实践，该控制电路工作正常、有效，为我们的工作带来了极大的方便，节约了不少时间。

233