DNA甲基化实验操作原理及方法-Hxg
甲基化检测原理及步骤 DNA实验技术方法汇总
DNA亚硫酸氢盐修饰和纯化操作步骤修饰设计：使用CpGenome TM kit使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤如下。中等温度碱性pH下使DNA变性成为单链形式暴露出碱基。试剂一，一种包含亚硫酸氢根的钠盐，可使未甲基化的胞嘧啶磺化和水解脱氨，产生一种尿嘧啶磺酸盐中间产物。然后DNA在另一种盐﹙试剂二﹚存在的条件下与一种微粒载体﹙试剂三﹚结合，并通过重复离心和在70%的乙醇中重悬浮脱盐。向尿嘧啶的转化是通过在90%的乙醇中反复碱性脱磺酸基作用和脱盐完成的。DNA最终在TE缓冲液中通过加热从载体上洗脱下来。
第一步：试剂准备
（1）3 M NaOH原料（用前现配）
把1g干NaOH片剂溶解在8.3mL水中。使用此类腐蚀性碱，注意小心谨慎和实验操作。
（2）20 mM NaOH/90% EtOH（用前现配）
配制1mL该溶液需：900μl 100%的乙醇，93.4μl水，6.6μl 3M的氢氧化钠。
（3）溶解试剂Ⅰ（用前现配）
打开前将试剂瓶加温至室温。对每份待修饰的样本，称取0.227g DNA修饰试剂Ⅰ加入0.571mL水中。充分涡旋振荡混合。使用该试剂时要小心谨慎，因为它对呼吸系统和皮肤有刺激性。用大约20μl 3M NaOH调整pH至5.0，用pH试纸检测pH值。试剂Ⅰ避光保存以免分解。为了最佳效果，试剂应在配置后立即使用。
（4）溶解试剂Ⅱ
打开前将试剂瓶加温至室温。将1μl β-巯基乙醇加入20mL去离子水中。每份待修饰的DNA样本需将750μl该溶液加入到1.35g DNA修饰Ⅱ。充分混合确保完全溶解。过量的试剂可用箔纸包裹的容器、2℃-8℃、避光保存长达6周。
甲基化测序原理
甲基化测序原理
甲基化测序是一种用于研究DNA甲基化状态的技术，它能够帮助我们了解基
因组中甲基化的分布情况，从而深入理解基因表达调控、疾病发生机制等重要生物学问题。在甲基化测序中，我们通常会使用一些特定的方法和技术来分析DNA中
的甲基化信息，下面我们将对甲基化测序的原理进行详细介绍。
首先，我们需要了解DNA甲基化是什么。DNA甲基化是指DNA分子中的甲
基基团（-CH3）与DNA碱基结合的化学修饰过程，主要发生在胞嘧啶（C）碱基上。这种化学修饰可以影响基因的表达和功能，对细胞的生长、分化和发育起着重要作用。因此，研究DNA甲基化对于理解生物学过程和疾病机制至关重要。
甲基化测序的原理主要包括以下几个步骤，DNA提取、甲基化处理、测序和
数据分析。首先，我们需要从待测样本中提取DNA，并对DNA进行甲基化处理，将未甲基化的胞嘧啶与甲基化的胞嘧啶区分开来。接下来，我们将进行测序，通过高通量测序技术获取DNA序列信息。最后，我们需要对测序数据进行分析，识别
出甲基化位点的信息。
在甲基化测序中，常用的技术包括甲基化特异性PCR、甲基化敏感限制酶切和甲基化敏感测序。甲基化特异性PCR是一种通过特定引物扩增甲基化和非甲基化DNA片段的方法，可以用于检测DNA甲基化的状态。甲基化敏感限制酶切是利用甲基化状态对限制酶的敏感性不同来区分甲基化和非甲基化DNA片段的方法。而
甲基化敏感测序则是利用高通量测序技术对甲基化DNA进行测序，从而获得甲基
化位点的信息。
甲基化测序的原理虽然看似简单，但在实际操作中需要高度的技术和方法的支持。同时，对于测序数据的分析也需要专业的知识和工具。通过甲基化测序，我们可以全面了解基因组中的甲基化信息，从而深入研究基因表达调控、疾病发生机制等重要生物学问题，为生命科学研究提供重要的数据支持。
DNA甲基化
重亚硫酸盐处理程序
一细胞处理
1 用PBS或者M2培养液将细胞洗干净，移入PCR管中，尽量少的带培养液（低于2ul），（此处可-20度保存），加入1.5ul LPK，离心。37度30-60分钟。（此处可-20度保存）。
2 加3ul RNase free水，计量总体积（约6ul），加入3M的NaOH（6ul样—0.66ul NaOH），搅动混匀使其终浓度为0.3M，总体积不超过10ul，37度Incubator孵育15min。，
3 2%的低熔点琼脂糖（用三蒸水提前配好），使用时在PCR仪上75度融化，在每个样中加入15ul后搅拌混匀，放回PCR仪，待12个样加完后依次全部吸出（约21ul）迅速放入加好mineral oil的2ml EP管中（mineral oil至少提前2 h 在4度预冷，或者至少在-20度预冷半小时），（加入琼脂糖后总体积最好不超过20ul），在移入EP管时不要产生气泡，然后将混合物在4度放置1-1.5 h（至少15min）。
二盐处理
将50度水浴锅打开，锡箔纸和冰备好。
1称取3.8g 亚硫酸氢钠sodium bisulfite（sigma）+4ml三蒸水（5M），称取0.11g 对苯二酚hydroquinonel 溶于1ml水中，然后后者混于前者，混匀，加入3M NaOH 1-1.2ml（经验值），将pH值调到5.0，然后50度水浴10min。（此剂量够12个左右的管子，每个管子2个珠子）
2 将珠子转移至一个新的2mlEP管，每管装2个珠子，加入500ul配好的亚硫酸盐溶液，然后加入100ul mineral oil（盖住液面即可，防盐挥发），用锡纸包好，冰浴15-30min。
DNA甲基化检测实验指导
DNA甲基化检测
甲基化是蛋白质和核酸的一种重要的修饰，调节基因的表达和关闭，在细胞正常发育、基因表达模式以及基因组稳定性中起着至关重要的作用，与癌症、衰老、老年痴呆等许多疾病密切相关，是表观遗传学的重要研究内容之一。
目前甲基化特异性PCR ,Methylmion Specific PCR，简称MSP，及其改进方法是检测基因甲基化的经典方法．原理是首先用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶都被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不变。然后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行PCR扩增，通过检测，确定与引物互补的DNA序列的甲基化状态。MSP法灵敏度较高，应用范围广。
实验前准备
在实验开始前，先准备好本次实验所需的各种试剂，如：3mmol NaOH，DNA 纯化试剂盒，以及PCR检测用到的试剂盒等。
所涉及的仪器和耗材有赛默飞公司提供的单道移液器、QSP盒装吸头、Nun 冰盒，Thermo Scientific全波长扫描式多功能读数仪，还有常规的离心机、水浴锅等。
本实验的操作流程为：引物设计，重亚硫酸盐修饰后进行DNA纯化，通过浓度检测方进行甲基化特异性PCR检测。
首先进行引物设计
甲基化常发生在启动子区，以DAPK1基因甲基化引物设计为例来。
首先要找到DAPK1的启动子区，登陆Map Viewer，搜索DAPK1。点击gene,filter，找到对应的基因，获得更多的信息。点击Map Viewer，可见DAPK1在9号染色体的具体位置。第一个外显子位于90140 kb处，估计启动子就在其上游2000kb内。显示为Genbank格式，点击display，获得序列。
DNA甲基化研究方法
DNA甲基化研究方法
DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰形式，常见于生物体细胞中。它在维持基因转录调控、胚胎发育、细胞分化以及肿瘤形成等过程中起着关键的作用。因此，研究DNA甲基化的方法对于深入理解生物学和疾病发生机制具有重要的意义。在接下来的1200字内，我将为您介绍几种常用的研究DNA甲基化的方法。
1.甲基化特异性限制酶消化（MSRE）：该方法利用能够识别并切割甲基化CpG岛的特异性限制酶来分析DNA甲基化水平。首先，将DNA进行酶切，然后通过聚合酶链反应（PCR）扩增消化后的DNA片段。最后，利用各种技术如限制性片段长度多态性（RFLP）分析、单体型检测或测序等方式来检测PCR产物是否被酶切。甲基化的区域将在PCR产物中产生一个酶切位点的改变，从而可以推断原始DNA的甲基化状态。
2.甲基化特异性PCR（MSP）：MSP是一种常用的研究甲基化的方法，它结合了甲基化特异性限制酶消化和PCR扩增的优点。首先，在甲基化和非甲基化的DNA样品中进行DNA甲基转化反应，将所有未甲基化的胞嘧啶转化为脱氧尿嘧啶。接下来，使用特异性引物来扩增甲基化和非甲基化的DNA。扩增产物可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法来检测甲基化状态。
3.甲基化特异性PCR串联扩增（MSP-COOM）：MSP-COOM是一种修饰的MSP方法，它可以同时分析多个CpG位点的甲基化状态。在该方法中，将样本DNA修饰成两种不同的状态（一种代表甲基化，一种代表非甲基化），然后再进行PCR反应。扩增产物可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法来检测多个甲基化位点的状态。
dna甲基化的过程和机制
dna甲基化的过程和机制
DNA甲基化的过程和机制如下：
DNA甲基化是指在DNA分子的特定位置上添加甲基基团，甲基化后的DNA序列可能发生某些改变，比如可以调节基因的表达等。甲基化的机制主要涉及到DNA甲基转移酶（DNMT）的作用。DNMTs是一类能够将甲基基团从S-腺苷甲硫氨酸（SAM）转移到DNA分子上的酶，是DNA甲基化过程的主要参与者。在DNA甲基化过程中，DNMT首先将SAM转化为活性中间体，然后将活性中间体的甲基基团转移到DNA分子上。
DNA甲基化的过程可以分为以下几个步骤：
识别和结合：DNMT首先识别DNA分子上的特定序列，通常是富含胞嘧啶的区域。识别后，DNMT结合到DNA分子上，形成一个复合体。
甲基化反应：在复合体中，SAM的甲基基团被转移到DNA分子上，通常是胞嘧啶残基的5位碳原子上。这个过程涉及到化学键的转移，需要消耗能量。
释放和去甲基化：完成甲基化反应后，DNMT从DNA分子上释放下来，留下甲基化的DNA序列。在某些情况下，甲基化的DNA序列可以被去甲基化，即甲基基团被去除，恢复到未甲基化的状态。去甲基化的过程通常涉及到特定的去甲基化酶的作用。
总之，DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰方式，可以影响基因的表达和功能。了解DNA甲基化的过程和机制有助于深入理解生物
学和医学中的许多问题，包括发育、疾病和治疗方法等。
DNA甲基化检测方法
DNA甲基化检测方法
DNA甲基化是一种常见的表观遗传修饰方式，通过甲基化在DNA分子
上的加合，可以调节基因表达和遗传信息传递。因此，DNA甲基化检测在
遗传学研究、疾病诊断和治疗中具有重要意义。本文将介绍几种常用的DNA甲基化检测方法，并对其原理、优缺点进行详细讨论。
1.甲基化特异性PCR法（MSP）
甲基化特异性PCR法是一种利用特异性甲基化酶、限制性内切酶或碱
性处理剂以及增强法进行检测的方法。该方法的原理是通过甲基化特异性
的酶对DNA进行酶切，使得未甲基化的DNA片段与经PCR增强的片段长度
不同，从而通过凝胶电泳进行检测和分析。优点是简单、快速且成本低廉，但缺点是需要设计和合成特异性甲基化酶。
2.基于测序的甲基化特异性分析
基于测序的甲基化特异性分析方法主要有甲基化抑制PCR法（MIP）
和甲基化敏感限制性内切酶测序法（MSRE-Seq）等。甲基化抑制PCR法是
通过特殊的多聚合酶在特定温度下对未甲基化的DNA完成增长，而甲基化DNA则无法进行扩增，从而区分甲基化和未甲基化的位点。甲基化敏感限
制性内切酶测序法则是首先使用甲基敏感限制性内切酶对DNA进行切割，
然后进行测序分析。这两种方法具有较高的精确性和灵敏性，但测序成本
较高。
3. 甲基化特异性酶切测序法（MRE-Seq）
甲基化特异性酶切测序法是一种通过甲基化特异性酶切和测序进行检
测的方法。该方法首先使用甲基敏感限制性内切酶将DNA切割成小片段，
并在切割位点的两端加入特异性的测序引物，然后进行PCR增强和高通量
测序。通过测序得到的序列和甲基化位点的分布情况可以对DNA甲基化进行精确的定量和定位分析。甲基化特异性酶切测序法具有高通量、高灵敏度和高分辨率等优点，但仍存在PCR偏差等问题。
甲基化检测原理及步骤
DNA亚硫酸氢盐修饰和纯化操作步骤修饰设计：使用CpGenome TM kit使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤如下。中等温度碱性pH下使DNA变性成为单链形式暴露出碱基。试剂一，一种包含亚硫酸氢根的钠盐，可使未甲基化的胞嘧啶磺化和水解脱氨，产生一种尿嘧啶磺酸盐中间产物。然后DNA在另一种盐﹙试剂二﹚存在的条件下与一种微粒载体﹙试剂三﹚结合，并通过重复离心和在70%的乙醇中重悬浮脱盐。向尿嘧啶的转化是通过在90%的乙醇中反复碱性脱磺酸基作用和脱盐完成的。DNA最终在TE缓冲液中通过加热从载体上洗脱下来。
第一步：试剂准备
（1）3 M NaOH原料（用前现配）
把1g干NaOH片剂溶解在8.3mL水中。使用此类腐蚀性碱，注意小心谨慎和实验操作。
（2）20 mM NaOH/90% EtOH（用前现配）
配制1mL该溶液需：900μl 100%的乙醇，93.4μl水，6.6μl 3M的氢氧化钠。
（3）溶解试剂Ⅰ（用前现配）
打开前将试剂瓶加温至室温。对每份待修饰的样本，称取0.227g DNA修饰试剂Ⅰ加入0.571mL水中。充分涡旋振荡混合。使用该试剂时要小心谨慎，因为它对呼吸系统和皮肤有刺激性。用大约20μl 3M NaOH调整pH至5.0，用pH试纸检测pH值。试剂Ⅰ避光保存以免分解。为了最佳效果，试剂应在配置后立即使用。
（4）溶解试剂Ⅱ
打开前将试剂瓶加温至室温。将1μl β-巯基乙醇加入20mL去离子水中。每份待修饰的DNA样本需将750μl该溶液加入到1.35g DNA修饰Ⅱ。充分混合确保完全溶解。过量的试剂可用箔纸包裹的容器、2℃-8℃、避光保存长达6周。
DNA甲基化与表观遗传调控的分子机制
DNA甲基化与表观遗传调控的分子机制
DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰方式，具有广泛的功能和影响。通过对DNA分子上的甲基化修饰，细胞可以稳定地调节基因表达，从而在个体发育和生命过程中起到重要的作用。本文将探讨DNA 甲基化与表观遗传调控的分子机制，并介绍其在生物学研究和医学领域的应用。
一、DNA甲基化的原理和机制
DNA甲基化是指DNA分子上的碱基（通常为胞嘧啶）上发生甲基基团的添加。这一修饰过程由甲基转移酶（DNA甲基转移酶）催化完成，其中最常见的是DNA甲基转移酶1（DNMT1）、DNA甲基转移酶3A（DNMT3A）和DNA甲基转移酶3B（DNMT3B）。这些酶能够将甲基基团从甲基供体S-腺苷甲硫氨酸（SAM）转移到DNA分子上的胞嘧啶碱基。DNA甲基化主要发生在CpG二核苷酸位点，也可以在非CpG位点发生，尽管非CpG甲基化的频率较低。
DNA甲基化是一个动态平衡的过程。细胞中同样存在DNA甲基化的去甲基化修饰过程，由去甲基化酶（TET酶）负责。TET酶可以将甲基化的胞嘧啶转化为羟甲基化和甲酰化胞嘧啶，为DNA修饰的逆过程提供了催化活性。通过DNA甲基化和去甲基化的动态平衡，细胞可以在基因表达上实现动态调控。
二、DNA甲基化对基因表达的调控
DNA甲基化在基因表达调控中起到重要的作用。一般情况下，
DNA甲基化的发生会导致基因的沉默和抑制。这是因为DNA甲基化
可以阻止转录因子与DNA结合，进而影响基因的启动子活性和转录的
进行。此外，DNA甲基化还可以通过招募甲基化结合蛋白（MBD蛋白）和组蛋白去乙酰化酶等介导染色质结构的改变，从而影响基因的表达
甲基化原理及步骤
二、DNA亚硫酸氢盐修饰和纯化操作步骤
修饰设计：使用CpGenome TM kit使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤如下。中等温度碱性pH下使DNA变性成为单链形式暴露出碱基。试剂一，一种包含亚硫酸氢根的钠盐，可使未甲基化的胞嘧啶磺化和水解脱氨，产生一种尿嘧啶磺酸盐中间产物。然后DNA在另一种盐﹙试剂二﹚存在的条件下与一种微粒载体﹙试剂三﹚结合，并通过重复离心和在70%的乙醇中重悬浮脱盐。向尿嘧啶的转化是通过在90%的乙醇中反复碱性脱磺酸基作用和脱盐完成的。DNA最终在TE缓冲液中通过加热从载体上洗脱下来。
第一步：试剂准备
（1）3 M NaOH原料（用前现配）
把1g干NaOH片剂溶解在8.3mL水中。使用此类腐蚀性碱，注意小心谨慎和实验操作。
（2）20 mM NaOH/90% EtOH（用前现配）
配制1mL该溶液需：900μl 100%的乙醇，93.4μl水，6.6μl 3M的氢氧化钠。
（3）溶解试剂Ⅰ（用前现配）
打开前将试剂瓶加温至室温。对每份待修饰的样本，称取0.227g DNA修饰试剂Ⅰ加入0.571mL水中。充分涡旋振荡混合。使用该试剂时要小心谨慎，因为它对呼吸系统和皮肤有刺激性。用大约20μl 3M NaOH调整pH至5.0，用pH试纸检测pH值。试剂Ⅰ避光保存以免分解。为了最佳效果，试剂应在配置后立即使用。
（4）溶解试剂Ⅱ
打开前将试剂瓶加温至室温。将1μl β-巯基乙醇加入20mL去离子水中。每份待修饰的DNA样本需将750μl该溶液加入到1.35g DNA修饰Ⅱ。充分混合确保完全溶解。过量的试剂可用箔纸包裹的容器、2℃-8℃、避光保存长达6周。
甲基化建库原理和流程
甲基化建库原理和流程
甲基化建库是一种DNA甲基化分析的方法，它可以揭示DNA甲基化在基因组水平上的分布和差异。甲基化建库的原理是利用化学方法将甲基化的DNA序列与未甲基化的DNA序列进行区别，然后通过高通量测序技术对这些DNA序列进行分析。
甲基化建库的流程可以分为以下步骤：
1. DNA提取：从样品中提取DNA
2. DNA酶切：将DNA酶切成一定大小的片段
3. 甲基化特异性酶切：通过加入甲基化特异性酶对DNA进行酶切，只切割未甲基化的DNA，而不切割甲基化的DNA。
4. DNA片段修复：对DNA片段进行修复，以便于添加Illumina 测序接头
5. 连接Illumina测序接头：将Illumina测序接头连接到DNA 片段的末端
6. PCR扩增：对连接了Illumina测序接头的DNA片段进行PCR 扩增，以便于测序
7. 高通量测序：对PCR扩增产物进行高通量测序，得到甲基化建库的序列数据
8. 数据分析：对测序数据进行质控、比对和甲基化位点的鉴定和注释。
通过甲基化建库可以获得基因组范围内的甲基化信息，对于探究生物学中的某些现象和疾病的发生机制有着重要的意义。
DNA甲基化原理
DNA甲基化
甲基化检测服务-亚硫酸氢钠处理后测序法(bisulfite genomic sequencing PCR, BSP)是利用未甲基化的胞嘧啶可以被亚硫酸氢钠发生脱氨基变为尿嘧啶的原理，用两一特异性引物扩增后测序。测序法克服了只能针对单个位点检测，并且这些位点必须是限制性内切酶识别位点的缺点，可以对任何基因序列的甲基化状态进行检测。
甲基特异性的PCR扩增（MS-PCR）示意图
DNA甲基化（英语：DNA methylation）
DNA甲基化是一种表观遗传修饰，它是由DNA甲基转移酶（DNA methyl-transferase, DNMT）催化S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶（mC）的一种反应，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基。CG二核苷酸是最主要的甲基化位点，它在基因组中呈不均匀分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的区域，在哺乳动物中mC约占C总量的2－7％。DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方式，能在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。为外遗传编码（epigenetic code）的一部分，是一种外遗传机制。DNA甲基化过程会使甲基添加到DNA分子上，例如在胞嘧啶环的5'碳上：这种5'方向的DNA甲基化方式可见於所有脊椎动物。在人类细胞内，大约有1%的DNA碱基受到了甲基化。在成熟体细胞组织中，DNA甲基化一般发生於CpG双核苷酸（CpG dinucleotide）部位；而非CpG甲基化则於胚胎干细胞中较为常见。植物体内胞嘧啶的甲基化则可分为对称的CpG（或CpNpG），或是不对称的CpNpNp形式（C与G是碱基；p是磷酸根；N指的是任意的核苷酸）。特定胞嘧碇受甲基化的情形，可利用亚硫酸盐定序（bisulfite sequencing）方式测定。DNA甲基化可能使基因沉默化，进而使其失去功能。此外，也有一些生物体内不存在DNA甲基化作用。
dna甲基化检测原理
dna甲基化检测原理
甲基化是一种调节基因活性的重要的生物学机制，甲基化检测就是检测基因是否被甲基化以及甲基化的水平。
甲基化检测的原理是先将DNA进行酶切，得到酶切片段后，用特定的酶把片段中的甲基化位点处的甲基基团去掉，然后用氧化剂还原剩余的甲基化位点，最后采用DNA高通量测序将甲基化的位点精确测定出来。
dna甲基化的方法 -回复
dna甲基化的方法-回复
DNA甲基化是生物学中一种常见的反应，是指DNA碱基上的甲基（-CH3）基团的添加。这个过程会在DNA分子的C5位上结合一个甲基，通常发生在胞嘧啶（C）的胞嘧啶环上。DNA甲基化可以影响基因的表达和细胞的功能。
DNA甲基化方法是研究DNA甲基化的过程和机制的基础。下面我将一步一步地介绍主要的DNA甲基化方法，并讨论其优缺点。
第一步：DNA提取
要进行DNA甲基化研究，首先需要从细胞或组织中提取DNA。DNA提取可以使用多种方法，如琼脂糖凝胶电泳法、酚氯仿法、商业提取试剂盒等。这些方法通常可从细胞或组织中快速纯化DNA，并保留其甲基化状态。
第二步：甲基化特异性酶切
为了研究DNA甲基化的位置和程度，可以使用甲基化特异性酶切方法。这些酶可以识别DNA上的甲基化位点并切割DNA链。常用的甲基化特异性酶切酶有MspI、HpaII、MspA等。在这一步中，我们将DNA样本分成两个部分：一个经过甲基化特异性酶切（切割甲基化位点），另一个不经切割（保留甲基化位点）。通过对这两个部分进行比较，我们可以了解DNA的甲基化状态。
第三步：甲基化特异性PCR
甲基化特异性PCR（MSP）是一种常用于DNA甲基化研究的方法。在这种PCR方法中，我们使用特异性引物来扩增DNA片段，这些片段含有甲基化位点。通过特定的PCR条件和引物设计，我们可以选择性地扩增甲基化或非甲基化DNA片段。通过分析PCR产物的大小和强度，我们可以确定DNA的甲基化状态。
第四步：甲基化测序
甲基化测序是一种准确测量DNA甲基化的方法。通过测序分析，我们可以获得DNA序列上每个碱基的甲基化状态。这一步需要使用高通量测序技术，如甲基化特异性测序（Methyl-Seq）或受约束的甲基化分离（CATCH-Seq）等。这些技术可以提供高分辨率的甲基化图谱，帮助我们了解甲基化在基因组中的分布和功能。
甲基化实验方法和步骤
实战经验：
甲基化检测方法总结——（亚硫酸氢盐修饰后测序法）
第一部分基因组DNA的提取
这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。DNA 比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。
此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。使用两者的细节：
1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；
2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。两者均于-20度保存。
验证提取DNA的纯度的方法有二：
1：紫外分光光度计计算OD比值；
2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。
我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA 的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。
第一天只需下午半天即可
下午3点开始，先配好试剂再开始做实验
需提前消毒的物品：1.5mlEP管一大盒，双蒸水200ml，15ml
离心管，开水浴锅，
第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA
如不特别指出，所用双蒸水均经高压蒸汽灭菌。
1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用双蒸水稀释至45ul【20ulDNA+25ul双蒸水】；2：加5ul新鲜配制的3M NaOH【0.12g定容到1ml，用1.5mlEP管配制】；
3： 42℃水浴30min；水浴完后把水浴锅调至50℃
DNA甲基化检测技术全攻略
DNA甲基化检测技术全攻略
DNA甲基化是指DNA分子中的碱基Cytosine（胞嘧啶）在其C5位点
上与甲基基团结合形成5-甲基胞嘧啶的化学反应。DNA甲基化是一种重要
的表观遗传修饰方式，被认为在基因组的稳定性和调控中起着关键的作用。DNA甲基化异常与多种疾病的发生和发展密切相关，包括癌症、心血管疾病、神经系统疾病等。因此，开发DNA甲基化检测技术，对于深入研究疾
病的发生机制、早期诊断、疾病分型和治疗方案的制定具有重要意义。
一、DNA甲基化检测方法
1.甲基特异性PCR(MSP)
甲基特异性PCR是一种将DNA甲基化水平转化为PCR信号的方法。该
方法针对DNA甲基化位点进行甲基化特异性的酶切反应，然后利用PCR扩
增技术对甲基化和非甲基化的DNA片段进行分离和测定。
2.甲基化特异性限制酶切(MSRE)
甲基化特异性限制酶切方法依赖于特定甲基化位点上的酶切敏感性。
该方法先通过限制酶切鉴定DNA甲基化位点的状态，然后通过聚合酶链反
应(PCR)或更高通量的测序技术进行测定。
3.甲基化特异性测序
甲基特异性测序技术是一种通过测序方法直接确定DNA甲基化位点的
状态。这种方法依赖于高通量测序技术，可以同时测定数百万个甲基化位点。
4.甲基化敏感扩增多态性(MS-AFLP)
甲基化敏感扩增多态性方法是一种将甲基化位点转化为特定扩增片段
的方法。该方法利用比较性PCR和限制酶切结合的方法，挑选与DNA甲基
化状态相关的扩增产物，从而实现对DNA甲基化状态的测定。
二、DNA甲基化检测技术的应用
1.疾病早期诊断
2.疾病分型
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DNA 甲基化重亚硫酸氢盐修饰法（DNA METHYLATION BISULFITE MODIFICATION）
实验操作原理及方法
一、实验目的：
通过本实验，可以检测特定DNA序列的甲基化状态。
二、实验原理：
DNA 甲基化是指由S-腺苷甲硫氨酸（SAM）提供甲基基团，在DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）的作用下，将CpG 二核苷酸的胞嘧啶（C）甲基化为5-甲基化胞嘧啶（5-m C）的一种化学反应。DNA 甲基化是调节基因转录表达的一种重要的表观遗传的修饰方式。
DNA 甲基化主要在转录水平抑制基因的表达。DNA 甲基化引起基因转录抑制的机制可能主要有以下3 种：（1）DNA甲基化直接干扰特异性转录因子与各基因启动子中识别位置的结合。（2）序列特异性的甲基化DNA 结合蛋白与启动子区甲基化CpG 岛结合，募集一些蛋白，形成转录抑制复合物，阻止转录因子与启动子区靶序列的结合，从而影响基因的转录。（3）DNA 甲基化通过改变染色质结构，抑制基因表达。
重亚硫酸氢盐修饰法检测DNA甲基化的基本原理是基于DNA变性后用重亚硫酸氢盐处理，可将未甲基化胞嘧啶修饰成尿嘧啶。此反应的步骤是：1、在C-6位点磺化胞嘧啶残基；2、在C-4处水解去氨基来产生尿嘧啶磺酸盐；3、在碱性条件下去硫酸化。在这个过程中，5-甲基胞嘧啶由于甲基化基团干扰了重亚硫酸氢盐进入到C-6位点而保持着未反应的状态。在重亚硫酸氢盐处理后，使用针对每个修饰后DNA链的引物进行PCR反应。在这个PCR产物中，每5-甲基胞嘧啶显示为胞嘧啶，而由未甲基化胞嘧啶转变成的尿嘧啶则在扩增过程中被胸腺嘧啶所取代。
BSP(bisulfate sequencing PCR) ：重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，进行PCR扩增。最后，对PCR产物进行测序，并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。
三、实验方法及步骤：
1、复苏并培养细胞，当细胞长至一定程度后，收细胞沉淀并提取其DNA。
2、使用EZ DNA METHYLATION-GOLD TM KIT 试剂盒，将DNA进行亚硫酸氢盐修饰，详见附录1。
3、将上一步中已亚硫酸氢盐修饰的DNA模板进行PCR扩增，详见附录2（BSP）。
4、切胶回收。
5、TA-cloning和转化。
6、涂平板进行蓝白斑筛选。
7、当菌落长至一定程度后，挑选白色菌落进行菌落PCR（体系同BSP）。
8、挑选上一步中跑胶出现条带的白色菌落先将其加入约3ml的不含抗性的LB液体培养基中摇过夜，后取其1ml送去测序。其余的菌液取500ml加入500ml 50%的甘油冻入-80℃冰箱。
9、测序结果分析（详见附录3）。
四、试剂配制：
1、CT Conversion Reagent：（1）、将900 µl 水, 300 µl 的M-Dilution Buffer和50 µl M-Dissolving Buffer加入一管的CT Conversion Reagent。（2）、在室温下震荡或颠倒约10分钟将其混匀。
注意: CT Conversion Reagent中常有少量的不溶试剂，这很正常。每一管CT Conversion Reagent 可以处理10个不同的DNA样品。
保存: CT Conversion Reagent 对光敏感, 故要注意避光。为了得到最好的结果, CT Conversion Reagent最好现配现用。如果用不完, CT Conversion Reagent 溶液可以室温过夜、4°C保存一周或-20°C保存一个月。保存的CT Conversion Reagent溶液必须现将其热至37°C, 震荡后再使用。
2、M-Wash Buffer：将24 ml100% 的乙醇加入6 ml M-Wash Buffer 浓缩液中。
五、注意事项：
1、亚硫酸氢盐修饰的DNA样品的量要在500pg到2ug之间。
2、BSP很容易污染出现阴性条带，故此步骤要注意操作，避免污染。
3、Taq酶是热启动酶。
4、感受态细胞取出后要马上放在冰上解冻，并在刚解冻时马上使用其转化效率最高。感受态细胞要注意不要反复吹打。
5、步骤6中要使用KANA或Amp抗性的LB平板，在用菌液涂板前要先在每个平板上涂上500mM的IPTG约8ul和40mg/ml的x-gal约40ul，并在37℃预热。
附录1：
1、在PCR单管中加入130ul的CT Conversion Reagent和20ul的DNA样品（如样品少于20ul，用水补齐）。
2、PCR(98℃10min 64℃60min 64℃60min 64℃30min 4℃∞)。
3、将600ul的M-Binding Buffer加入Zymo-Spin™ IC Column中，并将其放入收集管中。
4、将步骤2中PCR后产物加入含有M-Binding Buffer的Zymo-Spin™ IC Column中，关上盖子并颠倒混匀。
5、离心（最高速）30s，弃收集管中的液体。
6、加入100ul的M-Wash Buffer，离心（最高速）30s。
7、加入200ul的M-Desulphonation Buffer，在室温下（20℃~30℃）静置15~20分钟，离心（最高速）30s。
8、加入200ul的M-Wash Buffer，离心（最高速）30s。重复一次。
9、将Zymo-Spin™ IC Column置入1.5 ml离心管中，加入10ul的M-Elution Buffer（尽量靠近柱子中心），离心（最高速）30s。产物放入-20℃保存。
附录2:
MSP-S体系：
DNA 4ul
10*PCR buffer 2.5ul
dNTPS 1.5ul
p16-s-f （primer，各为1ul
p16-s-r 10uM) 1ul
Taq 0.2ul
ddH2O 14.8ul
反应条件：
附录3：
举例：
上图中P16 exon1是完全未甲基化的对照序列，可见其所有未甲基化的C都转化为T。其下五个DNA序列为本次测序后回来的序列，它们分别是SCID22-3B-1-tumor细胞的加puer-tea 组、加5-aza-dc组和空白对照组。正常的SCID22-3B-1-tumor细胞其p16基因由于其启动子CpG岛甲基化是甲基化沉默的，而加puer-tea和5-aza-dc会去甲基化。由上图可见空白对照组中红色的C为仍然甲基化的C,这些红色的C就是p16基因CpG岛甲基化位点。而其同一列中黑色的T为去甲基化而转化为T 的C。