生物工程药物

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现代生物技术包括：
基因工程、细胞工程、酶工程、微生物发酵工程、生物电 子工程、生物反应器、灭菌技术及新兴的蛋白质工程等，其 中，基因工程是现代生物工程的核心
人类60％以上的生物技术成果集中应用于医药工业，用以 开发特色新药或对传统医药进行改良，由此引起了医药工业 的重大变革，生物技术制药得以迅速发展 生物工程药物主要包括三大类：基因工程药物、生物疫苗 和生物诊断试剂。其在诊断、预防、控制乃至消灭传染病， 保护人类健康延长寿命中发挥着越来越重要的作用。
老张的儿子觉得老张精神不大好，赶紧带他去医院做全面检查，基 因检测结果发现，老张的肝细胞也发生了癌变，立刻住院治疗。
治疗的效果相当好，没过多久就可以出院了。 医生说，还好发现得及时，要不然也很麻烦。 这时传来了老友去世的消息，老张不禁慨叹人生事变化无常，令人 唏嘘。
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DNA取样
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恶性肿瘤和病毒性疾病
长生药业
双鹭药业
沈阳三生
山东金泰
北京四环
九发股份
IL-4
上海华新
复星实业
天目药业
东阿阿胶
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基因工程药物
特性 功能
CSF
是一种糖蛋白，G-CSF, M-CSF, GM-CSF 刺激造血细胞增殖、免疫细胞成熟
适应症
贫血、白血病、粒细胞缺乏、血小板减少
Amgon
九发股份
杭州九源
双鹭药业 厦门特宝 长春金赛 华药金坦 海南华康
细胞处于最适摄取和容忍外来DNA的生理状态
二、转化及转染、转导作用 转化作用
把带有目的基因的重组质粒DNA引入受体细胞的过程 称为转化
转染作用
重组噬菌体或病毒DNA直接引入受体细胞的过程
转导作用 病毒、噬菌体介导（有蛋白质外壳包装）
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(五)重组体的筛选和鉴定 1.直接选择法
抗药性标志选择 标志补救 表达产物与营养缺陷互补 α —互补蓝白斑筛选 分子杂交 探针 原位杂交 Southern印迹法 限制性酶切图谱/PCR
转基因技术是指把从动物、植物或微生物中分 离到的目的基因，通过各种方法转入生物体内，如 动物、植物等。被转入的基因通过目前还不明了的 机理整合到被转入生物体的染色体中并能稳定地遗 传给下一代。这种被转入的基因即称为转基因。而 获得外来基因的生物体就被称为转基因生物体，如 转基因植物、转基因动物等。
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基因工程药物无性繁殖系的组建
化学合成法 构建基因文库法 √
目的基因的制取 √ √
酶促合成法
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目的基因的制取
限 制 酶
构建基因（染色体）文库
目标基因
限 制 酶
染 色 体
重组 基因
质粒载体
宿主菌
1 plasmid 1 cell
重组质粒 转入宿主
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目的基因的制取
构建cDNA文库（反转录法或酶促合成法） 步骤 真核细胞总RNA的分离 mRNA的分离纯化 在逆转录酶和Oligo dT存在下 合成cDNA第一链 酶促合成cDNA第二链 连接酶切位点并酶切 重组到酶切后的质粒载体 转化宿主菌，得到cDNA文库
山东齐鲁
深圳新鹏 北海方舟 上海三维 顺德南方 里亚哈尔
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基因工程药物
特性 功能
是一种非糖基化蛋白
TNF
直接杀死肿瘤细胞，调节免疫
适应症
肿瘤、癌症
复星实业
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基因工程药物
特性 功能 适应症
是一种丝氨酸蛋白酶 激活纤溶酶，溶血栓 心肌梗塞等血栓类疾病
tPA
九发股份 湖北科亮
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基因工程药物
特性 功能
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生物工程药物特点
•高风险。 •高收益。生物工程药物的利润回报率很高。一种新生物药 品一般上市后2-3年即可收回所有投资，尤其是拥有新产品、 专利产品的企业，一旦开发成功便会形成技术垄断优势， 利润回报能高达10倍以上。
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二 、 基 因 工 程 药 物 及 其 产 品
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基因工程技术
从生物细胞中获得目的基因，并将此目 的基因插入载体，拼接后（重组）转入新的 宿主细胞，构建成工程菌、细胞及转基因动 物，实现遗传物质的重新组合，并使目的基 因在工程菌、细胞及转基因动物内进行复制 和表达的技术。
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生物工程药物特点
• 高技术。这主要表现在其高知识层次的人才和高新的技术 手段。生物制药是一种知识密集、技术含量高、多学科高 度综合互相渗透的新兴产业。 • 高投入。国外研究开发一个新的生物工程药物平均费用在 1-3亿美元左右，并随新药开发难度的增加而增加（有的还 高达6亿美元）。一些大型生物制药公司的研究开发费用占 销售额的比率超过了40％。 • 长周期。新药开发平均10-12年。
34 成都地奥
基因工程药物
特性 功能
是一种非糖基化多肽激素 刺激身体生长
hGH
Genentech
枯草芽孢杆菌
适应症
侏儒症
Cellteck
哺乳动物细胞
Novo Nordisk
Bio Technology
Serono
长春高新
金塞药业
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基因工程药物
特性 功能
是一种蛋白质
IFN
北京三元
天津立达
广谱的抗病毒活性、抗细胞分裂和调节免疫
DNA重组技术
分子克隆技术
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基因工程药物的生产
1. 细菌表达系统 2. 酵母表达系统 3. 昆虫表达系统 4. 哺乳细胞表达系统 5. 乳腺生物反应器 6. 转基因鸡 7. 植物生物反应器
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重组DNA技术
载体DNA +dGTP 3′ PolyG 目的基因
3′
3′
+dCTP 3′ PolyC
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质粒可以大量制备
情景二
你有一个美丽善良的妻子。
你还有一个高薪而稳定的好工作，事业蒸蒸日上，生活幸福美满。
就缺一个孩子，等了好多年，妻子终于怀上了小宝宝，你好开心。 在一次产前检查中，医生却告诉你最好不要生下这个小孩。
因为基因检测的结果发现小宝宝基因有缺陷。
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情景三
年纪大了，老张觉得身体不如以前了。 昨天听到了一个消息，几十年的老友得了肝癌，因为发现得太迟， 已经到了晚期，最多还能活三个月。
适应症
恶性肿瘤、病毒性疾病
Schering-Plaugh
Biogen 深圳科兴
丽珠生物
天奥制药
Serono
哈药集团
长生药业
三生药业
复星实业
海王生物 里亚哈尔
安科 华新
三生药业 新大洲药业
36 上海、长春生物制品研究所
基因工程药物
特性 功能
是一类糖蛋白，共10多种 免疫活化、抗肿瘤、诱导发热
IL
适应症
是一种HBV抗原蛋白 刺激机体产生HBV抗体
重组乙肝疫苗
适应症
预防乙肝
华北制药 长春生物 天坛生物 深圳康泰 Merck Amgen
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基因工程药物
其它
心钠素
SOD
抗血友病因子 凝血因子
表皮生长因子 链激酶
基因工程抗体
其余基因工程疫苗
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生物诊断试剂
DNA诊断 基因诊断
基因诊断—用分子生物学的技术对引起疾病 的原因--遗传基因,致病微生物和寄生虫,以 及某些恶性肿瘤在基因水平上进行病原学和 细胞遗传基因的检测和分析.
基因工程制药中常用的载体
质粒
存在于微生物细胞内染色体外的小型闭合环状双链DNA分子 理想制粒载体特性 有复制子 选择标记 强启动子 尽可能小 多克隆酶切位点
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抗药性质粒可在细菌间传递
抗药基因
质粒
mRNA
抗药性菌株
质粒可进出宿主细胞
抗药酶 水解抗生素
抗药性新菌株
非抗药性菌株
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转基因技术的概念
DNA/RNA产前诊断、携带者测试、症候前 诊断、遗传病易感性等
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情景一
你去应征一份高薪的好工作，且在面试的过程，你表现得很好。 过几天，你去理发，理发师用力梳理你的头发。当你走出理发店后， 有一个人进来，给这位理发师一些钞票，然后用一个袋子装入你掉在 地上的头发。 再过几天，你接到通知，不被录用。 因为在你的头发细胞中侦测出有基因上的缺陷。
基因工程制药中常用的载体 分子载体
种 类 用 途
作为外源基因的运载体，在细胞内可进行自我复 制的DNA分子，又称为无性繁殖载体。
克隆载体
表达载体
质粒
λ噬菌体
粘粒
M13噬菌体
动植物病毒
特点：带表达构件—转录和翻译 所需的DNA序列 含启动子—核糖体结合位点—克 隆位点—转录终止信号 – 启动子：trp-lac(tac)启动子、 λ 噬菌体PL启动子、T7噬菌体 启动子 – 核糖体结合位点(ribosomebinding site,RBS)：起始密 码子(ATG)和SD序列 – 转录终止序列 26
第十四章 生物工程药物：
现状与未来
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一、 前 言
在现代生物学发展伊始，就曾有科学家预言， 21世纪将是生物技术主宰的世纪。然而，相当多的 人们并没有意识到这句话的含义。直到 1997 年 3 月， 一个名叫“多利”的小羊诞生被新闻媒介公布后， 人们才第一次严肃地关注起当今生物技术来，谈论 着生物技术能给人类带来些什么……
cDNA合成 5′磷酸化、探针标记 3′末端多聚尾 切除末端磷酸基
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基 因 工 程 药 物 无 性 繁 殖 系 的 组 建
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概念及构建过程
无性繁殖 即克隆，指制备一个亲本而来的彼此相 同的子代（无性繁殖系）的操作技术
构建过程
基因工程目的基因的制取
目的基因与分子载体的体外重组
重组载体引入宿主细胞的转化和转导 含目的基因重组子的筛选、鉴定和分析 目的基因在宿主细胞中的高效表达
转基因动物的制作方法
1. 原核期胚胎的显微注射 2. 逆转录病毒载体感染
3. 精子载体法
4. 胚胎干细胞技术
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转基因动物研究的应用
1. 基因功能与调控的研究 2. 建立人类疾病的动物模型 3. 生产药用蛋白 4. 提高畜产品产量、改善产品品质 5. 动物抗病育种 6. 异种组织和器官移植
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重组人类药用蛋白在动物乳腺中的表达
基因治疗 gene therapy 基因治疗—就是向有功能缺陷的细胞补充相 应功能基因，以纠正或补偿其基因缺陷， 从而达到治疗的目的。
毫克/升 1.0 克/升 4.0 克/升 0.7 克/升 0.45
绵羊
山羊
猪
牛
0.025 微克/升 0.3 克/升 5.0 克/升 35.0 克/升 6.0 克/升 14 克/升 20 克/升 10 克/升 1 克/升 0.75 克/升 3 克/升 2.4 克/升
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基因工程药物
特性 功能
是一种多肽激素
从文库中筛选目的基因
核酸杂交法 抗体检测法
cDNA克隆的同胞选择法
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(二)克隆载体的选择和构建 (三)外源基因与载体的连接（DNA连接酶） 连接方式 1. 粘性末端连接 连接效率高 相同酶切末端 配伍末端 2.平端连接 连接效率低 3.同聚物接尾法 4.人工接头法
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(四) 重组DNA导入受体菌 制备感受态细胞 冷的氯化钙处理
2.非直接选择法 免疫学方法
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克隆基因的表达 载体有转录、翻译的元件 密码子通用 1 、原核表达体系 原核表达载体的标准 • 合适的筛选标志 • 强启动子 • 翻译控制序列 • 多克隆位点
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在真核细胞中表达重组药物蛋白
病毒表达载体 真核表达载体
感染
转化
mRNA
AAAAA
CYTOPLASM
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DNA
CsCl ultracentrifugation
plasmid RNA
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基 因 具工 酶程 及制 分药 子中 载常 体用 的 工
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工具酶 酶类型
限制性核酸内切酶
DNA连接酶
作用
切割DNA
生成3′- 5′磷酸二酯键
DNA聚合酶
反转录酶 多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶
探针标记、补平3′末端
动物品种 兔 启动子 兔ß－酪蛋白 牛α S1 －酪蛋白 山羊ß－酪蛋白 绵羊ß－乳球蛋白 绵羊ß－乳球蛋白 绵羊ß－乳球蛋白 绵羊ß－乳球蛋白 绵羊ß－乳球蛋白 山羊ß－酪蛋白 山羊ß－酪蛋白 山羊ß－酪蛋白 山羊ß－酪蛋白 小鼠 WAP 绵羊ß－乳球蛋白 小鼠 WAP 人α －乳蛋白 蛋白质 hIL 2 hIGF-1 h α1AT hPC hfIX hPC hfribrinogen h α1AT htPA hATIII h α1AT Anti-cancer Mab hPC hPC hfVIII ha-lac 表达浓度
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两种基因文库： cDNA 基因库 vs 染色体基因库
表现中基因 全部基因 染色体 DNA Restriction digestion 基因片段
mRNA
Reverse transcription
cDNA
完整基因
使用质粒为载体
基 因 库 较 小
基 因 库 较 大
使用质粒或 19 噬菌体为载体
目的基因的制取
Insulin
维持血糖恒定，调控细胞内多种代谢途径
适应症
糖尿病
Eli Lilly
rA + rB 化学合成 Novo Nordisk rInsulin
胰岛素原
酶法
Insulin
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基因工程药物
特性 功能
是一种糖蛋白 刺激红细胞分化增殖
EPO
适应症
多种贫血
Amgon 瑞士罗氏 南京华欣 沈阳三生
Ortho 日本麒麟 华药金坦