第七章 工业微生物诱变育种

第七章 工业微生物诱变育种
工业微生物中过程的三个阶段： 基因型改变 筛选菌种 产量评估
基本步骤 原种（出发菌株）→纯化→斜面→同步培养→离 心洗涤→振荡打散→过滤→菌悬液→诱变处理→平板 分离→斜面（活菌计数）→（变异率）→（初筛） → 斜面→ 斜面→性能鉴定→（复筛）→（再复筛） →保藏及扩大试验
100株
第二轮：
诱变处理
100株
Hale Waihona Puke 初筛复筛4个出发菌株→→ 株
→→ 选出50株 → →选出3-5 100株 （每瓶一株） （每株4瓶） 100株
2. 简便筛选程序
三、分离与筛选的方法
突变类型：形态突变和生化突变
高产突变株频率低，实验误差又在所难免，因而筛 选工作常采用多级水平筛选，有利于获得优良菌株：
4、浓度梯度法
合成抗生素的水平与其耐自身产物能力相关。
5、应用复印技术快速筛选变株
产脂野生株、具有高脂含量的突变株。 方法：筛选培养基→ 复印→ 苏丹黑染色→洗去 多余染料→酒精脱色→干燥显色→选择深蓝色或紫
色的菌落。
6、琼脂块大通量筛选变株
适用对象：抗生素、酶类产物。
优点：效率提高15-20倍。
2、菌悬液制备方法
产孢子的菌类：放线菌，霉菌应处理孢子。放线 菌和霉菌的孢子要稍加萌发后使用。
细菌：生长指数期，最好在诱变处理前进行摇瓶 振荡预培养，尽可能获得同步培养物。 某些不产孢子的真菌：菌丝体，最好采用年幼的 菌丝体进行诱变处理。获得的方法：菌丝尖端法、 处理单菌落周围尖端菌丝法和混合处理法。
1、培养基的选择
2、培养基斜面制备技术 3、接种密度 4、培养温度 5、培养湿度
6、试剂和原材料质量
四、了解产物各组分与培养条件的关系
如刺孢小单孢菌产生的庆大霉素，其中的C1是有效 的，C2是无效的，培养基中加入适量的磷和蛋白胨及加 大通风都有利于C1的合成，反之，C2的比例就上升。
五、快速准确的检测方法
五、诱变剂的处理方式
1. 单因子处理
使筛选工作简单化，但突变率低，突变类型少。
2. 复合因子处理
能导致较大的突变，适合遗传性稳定的纯种及生活 能力强的菌株处理。
复合因子诱变的处理方式：
（1）两个以上因子同时处理；
（2）不同诱变剂交替处理；
（3）同一种诱变剂连续重复使用； （4）紫外线光复活交替处理。
诱变剂对产量性状的诱变作用趋势：
处理剂量大，杀菌率高，在单位存活细胞中负变菌 株多，正变菌株少。
经长期诱变的高产菌株，正突变率的高峰多出现 在低剂量区，负变率在高剂量时更高。 诱变史短的低产菌株，正变株的高峰比负变株高 得多，小剂量诱变处理时正突变株多。
诱变剂的剂量选择经验
经长期诱变的高产菌株：低剂量处理。
2、温度、pH、氧气等外界条件对诱变效应的影响
化学诱变因子: T↑，速度↑。
最适pH：避免诱变剂分解而失去诱变效应。 辐射因子、紫外线：氧气充足有利于突变发生。
3、平皿密度效应
密度要适中，不能过密。
第三节 突变株的分离与筛选
随机筛选：过去采用，是盲目的选择，效率低。 定向筛选：现在，筛选效率高。
3. 诱变处理的方式
（1）菌体直接处理：菌体有诱变剂接触后再进行平板分 离。 （2）平板处理：诱变剂加入到培养基中。 （3）摇瓶振荡培养处理：诱变剂加入到摇瓶培养基中。
六、影响突变率的因素
（一）菌种遗传特性不同
5-BU对静止或休眠细胞不起作用；紫外线、电离 辐射、烷化基、亚硝酸等对分裂细胞和静止孢子都有 效。
（二）细胞壁结构
丝状菌孢子壁较厚，表面蜡质也会阻碍诱变剂渗入。 或需用洗衣粉、脂肪酶、表面活性剂等处理去除蜡质。
（三）环境条件的影响
1、诱变前预培养和诱变后培养
预培养：培养基中加入咖啡因、蛋白胨、酵母膏、
吖啶黄、b－重氮尿嘧啶、嘌呤等物质能提高突变率。
后培养：诱变后的菌悬液不直接分离于平板，而是
立即转移到营养丰富的培养基中培养数代。作用是 让突变体重新调节代谢平衡，避免突变体表型延迟 现象。
少数存活
少数突变
多数负变
多数幅度小
少数正变 少数幅度大 少数适宜投产 多数不宜投产
计算
存活率
突变率
正变率
高产率
投产率
二、筛选的程序
常规法：摇瓶 简便法：琼脂块法＋摇瓶
1. 常规筛选程序
第一轮：
诱变处理 初筛 （每瓶一株）
一个出发菌株→→→选出200个菌株→→→选出50株
复筛 （每株4瓶）
→→→选出3-5株
缺点：产物浓度高时易漏筛，培养条件与发酵条件 差距大。 方法：琼脂块扩散圈和溶剂抽提法。 准确性：较直接分离在平皿上判断活性法要准确。
四、摇瓶液体培养
优点：通气量足，溶氧好，培养条件接近于发酵罐。
缺点：工作量大，效率低，
方法：初筛：一个菌株接种一个摇瓶；复筛：一个菌株接 种3-5摇瓶。
多级水平筛选：
平板筛选（5％－10％，200株） 摇瓶初筛（25％－30％，50株） 摇瓶复筛（1％－5％，1－3株）
（一）随机筛选
随机挑选的平板菌落进行摇瓶 筛选。 优点：与大生产条件相近。 缺点：工作量大。
如果突变频率为1%，那么要初 筛挑选的菌落起码要200个。
（二）平板菌落预筛
大量菌落经过平板预筛，可保留5％－10％的初筛菌 株，再进行摇瓶发酵复筛，复证被筛菌株的重演性。
死亡 出发菌株 存活 正突变型 负突变型 稳定型
如何筛选？
抗性突变株和营养缺陷型突变株可用选择性培养基筛 选，但产量突变株在表现上难以区分。 原因：高产突变频率低，产量提高幅度不大，5%~ 15%，实验误差约有10%左右。 策略：初筛（多）和复筛（精）
一、诱变育种的基本环节
大多死亡 出发菌株 诱变 多数未变
工业微生物诱变育种的意义：
1、提高有效产物的产量；
2、改善菌种特性、提高产品质量；
3、简化工艺条件； 4、开发新品种。
第一节
诱变育种的试验设计和准备工作
诱变的结果是产生变异，负变机率高于正变。高 产突变型是多基因决定，需要多代诱发突变逐渐积累。 诱变育种工作包括：诱发突变、突变株的筛选和 高产突变株最佳环境条件的调整。 在诱变育种前，应该对大生产的设备和工艺具有 相当的知识和全面的了解。 诱变的工作量大，周期长,事先要做好充分的准备。
1、根据形态筛选突变株 菌落形态变化
红霉素产生菌诱变后的突变株若带色素则多为低产菌株； 产孢子菌株变异后不产孢子也应弃选。
较高产量的出发菌株诱变后，菌落形态变化剧烈的多是 负变株，高产突变株一般变化较小。
2、根据平板菌落生化反应筛选变株
通过琼脂平板上的透明圈、变色圈、抑菌圈生长 圈等生化反应筛选。
饱和现象：对诱变史很长的高产菌株来说，长期多
次用某一诱变因子会产生钝化反应。
常规做法：几种诱变剂，各取不同剂量做一系列诱
变实验，筛菌，测定生产能力。
（二）最适诱变剂量的选择
剂量：以诱变剂浓度和处理时间来表示。 合适剂量：应该使所希望得到的突变株在存活群体中 占有最大的比例。 最适剂量：能扩大变异幅度又能促使变异移向正向突 变范围的剂量。
4、菌株的稳定性
挑选合成能力强，遗传性状稳定的菌株。
5、连续诱变育种过程中出发菌株的选择
挑选每代诱变处理后具有一些表型改变的菌株。
6、选择出发菌株的其他因素
如孢子多、不产色素、生活能力强、生长速度快、糖氮利 用快、耐消泡、粘度小等性状的菌株。
7、采用多出发菌株
选择3-4株出发菌种同时诱变。
8、了解菌种代谢特点
考查生活史：如土霉素菌种原先要培养12d其实是 包含了三代的生活周期。各代高产性能不同。 研究菌种的某些生物学特性与产量合成的相关性： 顶头孢菌素C的产量，随着其产生菌顶头孢霉菌的节孢 子体积增大或数量增加而提高。 考察菌落大小和颜色，如灰黄霉素产生菌荨麻青霉 紫色素越深，灰黄霉素产率越低。
三、了解影响菌种生长发育的主要因素
3、采用冷敏感菌筛选抗生素变株
低温敏感菌变异株：冷敏菌在20℃不能生长，在 37℃最适，产抗生素放线菌可在20℃生长。 冷敏感菌和诱变菌孢子混合先20℃条件下培养，待 产抗生素的放线菌长出后，转移到37℃的条件下培养， 冷敏菌迅速生长，抗生素产生菌菌落周围因由抗生素而 不能生长，根据菌落直径与抑菌圈直径之比的有效值， 可以直接筛选出抗生素的高产突变株。
了解菌种的代谢特点有助于选择有效的出发菌株，如肌苷 酸产生菌。
二、出发菌株的纯化
菌种纯化的方法：
1. 划线分离法 2. 稀释分离法 3. 显微镜操纵器分离单孢子
三、单孢子或单细胞悬液的制备
制备菌悬液时要注意生理状态、均一性、细胞 浓度、菌悬液介质（生理盐水或缓冲液）
1、孢子或菌体要年轻、健壮
采用分散法制备，力求90％以上为单孢子。 菌悬液浓度用平板计数、血球计数器计数和光密 度法测定。菌悬液的浓度，要求霉菌孢子约为106个 /mL，放线菌的孢子浓度约为106-107个/mL ，细菌的 细胞浓度为107-108个/mL。
建立一个适应于大规模筛选的有效检测方法是减少 诱变选育工作量的关键。
分光光度法
化学滴定法 液相色谱法 薄层层析法 气相色谱法
六、最佳的菌种保藏方法
事先要建立一个最佳的培养基、培养条件和适 宜的保藏方法，否则将前功尽弃。
第二节 诱变育种的步骤与方法
诱变育种的优缺点
优点：方法简单、投资少、收获大；
缺点：缺乏定向性。
Lethal rate (%)
120 100 80 60 40 20 0 0 10 20 30 40 Time of radiation (s) 50 60
紫外线致死率曲线
急性效应：高剂量率照射，短时间内达到较大剂 量，效应迅速表现。