3、核酸的提取及含量测定

RNP
DNP
溶解度大
溶解度小 （仅为水中1%）
溶解度小
溶解度大 (比在水中大2倍)
• 此外，两种核蛋白溶解度与pH值有关 RNP：pH2.0-2.5时最低 DNP：pH4.2时溶解度最低 故调节溶液pH也可促使两者分离，将 0.14mol/LNaCl的pH为4，使两者分开。
⒊ 去除蛋白质
用蛋白质变性剂或水解使RNA与蛋白质分离，故加 入蛋白质变性剂如氯仿、异戊醇、SDS、热酸等， 使蛋白质变性沉淀，从而核酸和蛋白质分离，经离 心后溶液分为三层：上中下分别是核酸溶液、变性 蛋白质凝胶和氯仿
鉴定或定量测定 沉淀(RNA),先用1mL0.1MNaOH溶解， 后用蒸馏水定容至15mL
二、RNA定量测定
RNA
水解பைடு நூலகம்
强酸
含氮碱基+戊糖+磷酸
测定三者中的任何一种成分即可计算核酸的含量， 有三种方法：测糖法、测磷法、紫外吸收法
㈠ 测糖法
核糖
浓HCl,FeCl3
△ 3H2O
糠醛+3,5-二羟甲苯→绿色化合物 （地依酚） 670nm比色
沉淀
上清液,倒入另一离心管,记录体积 加入等体积氯仿-异戊醇混 合液,剧烈震荡10min (用 吸管反复吹打至发白为 止),3500rpm,15min
上清液,倒入另一离心管中,记录体积
加2倍体积95%冰乙醇玻璃 棒搅拌，3500rpm15min 鉴定或定量测定 沉淀(RNA),先用1mL0.1MNaOH溶解， 后用蒸馏水定容至15mL
新鲜肝组织用冰生理盐水洗去表面的血液， 加0.14mol/LNaCl溶液制成20%匀浆
取匀浆4mL,3500rom离心15min,
沉淀
上清液 加入等体积氯仿-异戊醇混 合液,剧烈震荡10min (用 吸管反复吹打至发白为 止),3500rpm,15min
上清液 加2倍体积95%冰乙醇玻璃 棒搅拌，3500rpm15min
0
2.0
各管混匀，置沸水浴25min，冷却，670nm空白管调零，测各 管吸光度
⒉ 计算
标准曲线测得的 × 15/0.5×匀浆总体积/4 × 1/肝重(g) RNA的μ g数
= 1.0g肝组织中含RNA的μ g数
一、核酸提取
㈠ 原理 ⒈ 破碎细胞：
匀浆、超声震荡、酶解等，因动物组织含有核 酸酶，在一定温度下，该酶可被Ca2+,Mg2+等激活， 为避免核酸酶对核酸的水解，与核酸提取液中加入 适量螯合剂（如EDTA，柠檬酸等），除去这些离子， 整个过程在低温下进行。
⒉ 提取核糖核蛋白(RNP)
在生物体内核酸多以核蛋白的形式存在于组 织中，根据核糖核蛋白(RNP)和脱氧核糖核蛋白 (DNP)在不同浓度电解质溶液中溶解度明显差别进 行分离。故用0.14mol/LNaCl溶解提取核糖核蛋白。 核蛋白 0.14mol/LNaCl 1.0mol/LNaCl
㈡ 实验操作
⒈ 标准曲线的绘制及样品测定
标 1 RNA标准液 蒸馏水 0.4 1.6 2 0.8 1.2 准 3 1.2 0.8 管 4 1.6 0.4 5 2.0 0 0 2.0 0.5 1.5 空白管 测定管
地依酚试剂 2.0
RNA含量 40
2.0
80
2.0
120
2.0
160
2.0
200
2.0
核酸的提取及含量测定
• 核酸是具有重要生物化学功能的生物大分子， 根据其分子所含糖的种类不同，核酸分为两 大类，含核糖的称为核糖核酸(RNA)，含脱 氧核糖核酸的称为脱氧核糖核酸(DNA)，DNA 是遗传信息的携带者，与生物的生长、繁殖、 遗传和变异有密切关系，RNA参与蛋白质的 生物过程，由于核酸具有如此重要的生物学 功能，对核酸的结果与功能的研究已成为当 前生物科学的重要课题之一。
⒋ 纯化RNA
核酸不溶于乙醇等有机溶剂，加2倍体积95%冰乙 醇沉淀RNA，使其与其他杂质分开，再加 1mL0.10mol/LNaOH溶解RNA，得到纯化的RNA提取 液
㈡ 实验操作
新鲜肝组织用冰生理盐水洗去表面的血液， 加0.14mol/LNaCl溶液制成20%匀浆
取匀浆4mL,3500rom离心15min,