酶工程(1)

第一章 酶工程基础1、酶工程就是将酶、细胞或细胞器等置于特定的生物反应装置中，利用酶所具有的生物催化功能，借助工程手段将相应的原料转化成有用物质并应用于社会生活的一门科学技术。

2、影响酶催化作用的因素：底物浓度、产物浓度、酶浓度、温度、pH 、激活剂浓度、抑制剂浓度等。

3、酶的比活力：它是指在特定条件下，单位质量蛋白质或RNA 所拥有的酶活力单位数： 酶的比活力=酶活力（单位）/mg （蛋白质或RNA ）酶的比活力是酶纯度的一个指标。

4、酶的转换数和催化周期：转换数（K cat ）又称分子活性，或摩尔催化活性。

表示在单位时间内，酶分子中每个活性中心或每个分子酶所能转化的底物分子数，单位为min-，是酶催化效率的一个指标。

转换数的倒数称为酶的催化周期。

催化周期是指酶进行一次催化所需的时间。

5、酶活力测定中应注意的问题：（1）测定的酶反应速率必须是初速度，只有初速度才与底物浓度成正比。

初速度的确定一般是指：底物消耗量在5%以内，或产物形成量占总产量的15%以下时的速度。

（2）底物浓度、辅因子的浓度必须远远大于酶浓度（即过饱和）；反应必须在酶的最适条件（如最适温度、pH 和离子强度等）下进行；测酶活所用试剂中不应含有酶的激活剂、抑制剂，同时底物不能裂解。

6、米氏方程：酶反应动力学方程。

V=][][S Km S Vm第二章 酶的发酵工程1、乳糖操纵子学说（1）基本概念：操纵子是基因表达的协调单位，是由调节基因、启动子、操纵基因和结构基因组成的一个完整的基因表达单位，其功能是转录mRNA 。

结构基因是编码酶蛋白氨基酸序列的，通过转录和翻译表达产生酶蛋白。

调节基因是通过产生调节蛋白对整个转录过程起着调控作用。

启动子是RNA 聚合酶识别、结合并起始mRNA 转录的一段DNA 碱基序列。

操纵基因是位于启动子和结构基因之间的碱基序列，能与阻遏蛋白（一种调节蛋白）相结合，如操纵基因上结合有阻遏蛋白，转录就受阻，如操纵基因上没有结合阻遏蛋白，转录便顺利进行。

诱导物是诱导酶起始合成的物质（通常是酶的底物）。

辅阻遏物能引起阻遏蛋白的构象变化从而有利于其与操纵基因结合，由阻遏酶产生的物质。

（2）乳糖操纵子的诱导机制：乳糖操纵子的结构：大肠杆菌的乳糖操纵子含lacZ 、lacY 和lacA 三个结构基因，分别编码β-半乳糖苷酶、透过酶、乙酰基转移酶，此外还有操纵基因O 、启动子P 及调节基因I 。

阻遏蛋白的负性调节：在没有乳糖存在时，乳糖操纵子处于阻遏状态。

此时，I 基因产生的乳糖阻遏蛋白与操纵基因结合，由于空间排挤作用，RNA聚合酶就无法结合到P序列的RNA聚合酶结合位点，故阻断转录启动。

阻遏蛋白的阻遏作用并非绝对，偶有阻遏蛋白与操纵基因解散。

因此，每个细胞中可能会有微量β-半乳糖苷酶、透过酶、和乙酰基转移酶生成。

在有乳糖存在时，乳糖操纵子即可被诱导。

但真正的诱导剂并非乳糖本身。

乳糖经过透过酶转运进入细胞，再经原先存在于细胞中的微量β-半乳糖苷酶催化，转变为别乳糖。

后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构型变化，导致阻遏蛋白与操纵基因解离，RNA聚合酶就可以结合到P序列的RNA聚合酶结合位点上，启动转录，使β-半乳糖苷酶浓度增加约1000倍。

CAP的正性调节：分解代谢物基因激活蛋白CAP是同二聚体，在其分子内有DNA结合区及cAMP结合位点。

当细胞内缺乏葡萄糖及cAMP浓度较高时，cAMP与CAP结合，cAMP-CAP复合物浓度提高，cAMP-CAP复合物结合在乳糖操纵子启动子P序列的CAP-cAMP结合位点，提高了RNA聚合酶的结合能力，使RNA转录活性提高50倍；当葡萄糖存在时，cAMP浓度降低，cAMP-CAP复合物浓度降低，结果启动子P序列的CAP-cAMP结合位点没有足够的CAP-cAMP复合物结合，RNA聚合酶也就无法结合到其在启动子P的相应位点上，转录无法进行。

2、色氨酸操纵子学说（1）色氨酸操纵子的调节作用：大肠杆菌的色氨酸操纵子也是由调节基因、启动子、操纵基因和结构基因4部分组成的。

启动子位于色氨酸操纵子的前端；结构基因上有5个基因，分别编码‘分支酸→邻氨基苯甲酸→磷酸核糖邻氨基苯甲酸→羧苯氨基脱氧核糖磷酸→吲哚甘油磷酸→色氨酸’途径中的5种酶。

其调节基因（trp R）远离操纵基因，编码一种称为阻遏蛋白原的调节蛋白。

当培养基中有足够的色氨酸时，该操纵子自动关闭；缺乏色氨酸时，该操纵子被打开。

色氨酸在这里不是起诱导作用而是阻遏作用，因而被称作辅阻遏物，意指能帮助阻遏蛋白发生作用。

色氨酸在色氨酸操纵子中的作用机制恰和乳糖在乳糖操纵子中的作用机制相反。

在没有末端产物色氨酸的情况下，阻遏蛋白原处于无活性状态，因此，操纵基因的‘开关’是打开的，这时结构基因的转录和翻译可正常进行，参与色氨酸合成的酶大量合成；反之，当有色氨酸存在时，阻遏蛋白原可与辅阻遏物---色氨酸结合成一个有活性的完全阻遏蛋白，它与操纵基因相结合，使转录的‘开关’关闭，从而无法进行结构基因的转录和翻译。

（2）衰减子的调节作用：衰减子是位于启动子与结构基因之间的基因调节序列，它利用原核生物转录与翻译相偶联的特性，依赖自身巧妙的特征序列和相应的mRNA二级结构，精细调节结构基因的转录。

衰减子位于第一个结构基因与启动子P的序列之间。

在结构基因trpE上游mRNA的前导序列中有一个编码14个氨基酸残基的开放阅读框，在该开放阅读框的上游是核糖体结合位点（SD）序列，开放阅读框的下游是一个典型的终止子结构，由28个碱基组成。

前导序列、终止子以及相关的间隔序列共同构成衰减子。

前导序列转录出的前导mRNA含有4个区，当细胞内的色氨酸浓度较高时，核糖体很快通过1区，并封闭2区，3区和4区的碱基配对产生茎环结构，终止RNA聚合酶的继续转录；当细胞中的色氨酸的浓度低于某一临界值时，核糖体通过1区速度慢，导致2区和3区的碱基配对产生茎环结构，4区失去配对伙伴而保持单链状态，2区和3区形成的茎环结构是个弱终止子，RNA聚合酶可以越过弱终止子而继续转录。

3、协同诱导：诱导物同时或几乎同时诱导几种酶的合成称为协同诱导。

4、顺序诱导：是先后诱导合成分解底物的酶和分解其后各中间代谢产物的酶。

5、终产物阻遏：这种由于终产物的过量积累而导致的生物合成途径中酶合成的阻遏称为终产物阻遏。

6、葡萄糖效应：由于葡萄糖常对分解利用其他底物的有关酶的合成有阻遏作用，所以分解代谢产物阻遏又称葡萄糖效应。

7、基因扩增：是通过增加基因拷贝数而调节基因表达的一种方式，为特定蛋白质编码的基因拷贝数选择性地增加，而其他基因并未按比例增加的过程。

8、增强子：是一种能够提高转录效率的顺势调控原件。

9、诱导酶有哪些：α-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、植酸酶、葡萄糖异构酶、β-半乳糖苷酶等。

10、产酶菌种的要求：（1）酶的产量高。

（2）容易培养和管理，产酶细胞容易生长繁殖，适应性较强，便于管理。

（3）菌株遗传性要稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体，保证生产的稳定性。

（4）菌株能利用廉价原料，发酵周期短，生产成本低。

（5）发酵产物利于酶产品的分离纯化，最好是分泌型的胞外酶。

（6）菌株安全可靠，不是病原菌，不产毒素及其他有害物质，不影响生产人员的身体健康。

（7）基因工程菌株必须符合安全性要求。

11、菌种退化现象：随着菌种保藏时间的延长或菌种多次转接传代，菌种本身所具有的优良性状可能得到延续，也可能发生变异。

变异有正突变和负突变两种，其中负突变即菌株生产性状的劣化或有些遗传标记的丢失称为菌种的退化。

12、培养基成分对产酶的影响有：碳源、氮源、无机盐类、生长因子、产酶促进剂。

13、临界氧浓度：各种微生物对发酵液中溶解氧浓度有一个不影响其正常代谢的最低要求，这一浓度叫做“临界氧浓度”。

14、提高溶解氧浓度的方法：（1）提高氧分压。

（2）增加通气量。

（3）延长气液接触时间、增加气液接触面积。

（4）改变培养液的性质。

15、由于培养基中有蛋白类表面活性剂的存在，在通气条件下，会形成泡沫。

16、酶生物合成的模式：（1）同步合成型：酶的生物合成与细胞的生长同步。

当细胞进入对数生长期，酶大量产生；细胞生长进入稳定器后，酶的生物合成随着停止。

例子：黑曲霉产原果胶酶。

（2）延续合成型：酶的合成伴随着细胞的生长而开始，但在细胞生长进入稳定期后，酶还可以延续合成较长一段时间。

例子：某嗜盐菌株产多氯联苯降解酶。

（3）中期合成型：酶的合成在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞进入稳定期后，酶的合成也随之停止。

例子：枯草芽孢杆菌合成碱性磷酸酶。

（4）滞后合成型：只有当细胞生长进入稳定期以后，酶才开始合成并大量积累。

例子：宇佐美曲酶产生酸性蛋白酶。

17、同步合成型的酶的产酶动力学方程为：dt dE =α·μ·X 18、滞后合成型的酶的产酶动力学方程为：dt dE =β·X第三章 酶的分离工程1、凝聚：指在稀溶液中加入电解质，（即凝聚剂，一般是含多价离子的电解质），使非目标产物凝聚成较大的粒子或胶团。

2、絮凝：指在某些高分子絮凝剂（通常是含有极性官能团的聚合物）的桥联作用下，将胶体粒子联结成网状，形成10mm 大小絮凝团的过程。

3、细胞破碎：（1）机械破碎法：捣碎法、研磨法和匀浆法。

（2）物理破碎法：温度差法、压差法和超声波法。

（3）化学破碎法：常用的法学试剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂，曲拉通、吐温等表面活性剂。

（4）酶促破碎法：常用的外加酶有溶菌酶、果胶酶、纤维素酶等。

4、相似相溶原则：即极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。

5、一般来说，评价一种分离纯化方法优劣的指标主要有3个：总活力的回收率、比活力提高的倍数和重现性。

6、离心机的种类：按照速度可分为低速离心（8000r/min 以内）、高速离心（1-2.5×104r/min ）、超速离心（2.5-12×104r/min ）。

7、盐析：向酶蛋白溶液中加入中性盐，当盐浓度达到一定界限时，酶蛋白的溶解度会随着盐浓度的继续升高而下降并析出沉淀，这种现象成为盐析。

8、选择性变性有三种方式：热变性、pH 变性和有机溶剂变性。

比如提取胰蛋白酶时，可用2.5%三氯乙酸处理，使杂蛋白变性沉淀。

9、萃取：萃取分离式一种利用样品中各组分在两相中溶解度或分配比的不同来达到分离和纯化目的的技术。

分为：液液萃取、液固萃取、液气萃取和超临界流体萃取等。

液液萃取包括：有机溶剂萃取、双水相萃取、反胶束萃取、预分散萃取等10、凝胶层析：又称凝胶过滤层析、凝胶渗透层析、分子筛层析、分子排阻层析等。

它以多孔凝胶为固定相，含有样品的流动相在流经其中时，各组分因相对分子质量和形状的不同而受到不同程度的滞留，从而先后被洗脱出来得到分离。