化学合成胸腺素α1反相色谱分离影响因素的研究

研究报告
化学合成胸腺素Ⅸ1反相色谱分离影响因素的研究
赵玉兰范业梅阎金川廖杰
(解放军总医院医学实验测试中心北京100853)
摘要胸腺素仅1(T o【1)是一种具有免疫活性的多肽，用固相多肽合成法合成T a l
及肽链长度不等的系列多肽。

优化这些多肽的反相分离方法，探讨流动相缓冲体系、
pH、梯度洗脱时间、以及柱温对分离的影响。

关键词胸腺素0【l(T0【1)反相色谱
胸腺素a l(T0【1)是G ol ds t ei n等最早从牛胸腺组织T F5中分离出来的一种多肽，含28个氨基酸，分子量3．108K D，等电点4．2。

在临床上主要用于病毒性疾病、免疫缺陷性疾病和肿瘤的治疗[1'21。

化学合成T0【l的分子结构与人体内源性T o【1完全一致，与生化提取T0【1相比，化学合成品产量高，便于进行严格的质量控制，高效低毒。

反相色谱是对合成T o【1有关物质检查和含量测定的主要分离手段，为探讨各种反相分离因素对T仅l质量控制的影响，我们根据T o【1的氨基酸序列，合成27、21、14，7肽等T o【l的系列多肽，对其反相色谱分离条件进行优化，研究各种因素对T0【1及其系列多肽反相分离的影响。

1实验部分
1．1仪器和样品
安捷伦1100系列高效液相色谱系统，Sym-phony12通道多肽合成仪(P r ot ei n T ec hnol ogi es公司)。

乙腈、三氟醋酸(TFA，M er k公司)，磷酸二氢钾、三乙胺为国产分析纯试剂，实验用水经M i l l Q纯水器净化。

T0【1及其系列多肽(见表1)。

表1T o【1及其系列多肽的结构
28肽Thr-T hr-Lys-A s p-Leu-L ys—G l u—L ys L ys G l u—V al V al--G l u G l u-A l a-G l u-A s p
Ser-A sp-A l a-A l a-V a l—A s p-T hr-S e r-Ser-G l u-I l e-27肽Thr-T hr-Lys-A s p-Leu-L ys-G l u-Lys-Lys—G l u—V al-V al．G l u—G l u．A l a．G l u
，1叶S e r-A sp-A l a-A l a-V a l—A sp T h r-Ser—S e r-G l u—l i e-‘1肌Thr-T hr-L ys．A s p．Leu．Lys．G l u．L ys．L ys．G l u
14肽
S。

卜A8p-A l a-A l a-V a l-A s p。

Thr-Scr-Ser-Gl u‘I l。

‘
Thr-Thr-Lys
7肽Ser-A sp A l a—A l a—V al-A sp-T hr
1．2色谱条件
色谱柱1：Z O R B A X E c l i ps e4．6×150m m，5岬l 色谱柱2：ZO R B A X SB4．6x150m m，5p m。

流动相l：A0．035m ol／L磷酸二氢钾，用磷酸或氢氧化钠调pH至5．7，B：乙腈，0～25％B20m i n，梯度洗脱l流动相2：A O．1％TFA(v／v)水；B：0．1％T FA 乙腈，0～30％B20m i n，梯度洗脱l流动相3：A 1％冰醋酸，用三乙胺调节pH至6．5，B：乙腈，0---30％B，梯度洗脱。

流速：l m L／m i n，测波长：214nm。

2结果和讨论
2．1不同缓冲体系对分离选择性的影响
分别用三氟醋酸、磷酸缓冲液和醋酸三乙胺三种流动相系统对T仅1系列多肽进行分离(见图1)。

结果表明，三种流动相系统都能对T o【1系列多肽进行有效的分离，但杂质的峰数和出峰顺序不同。

多肽混合物中含有多个天门冬氨酸和谷氨酸残基，这两种酸性氨基酸侧链在pH2左右的三氟醋酸流动相体系中完全游离，而在pH6．5的条件下则全部离子化，这种解离与非解离状态的变化将导致多肽与反相固定相间的相互作用不同，从而改变分离选择性，用不同pH磷酸缓冲液系统也验证这一结论。

选择三氟醋酸缓冲体系的目的是使样品呈游离状态，增加其在系统中的保留。

而磷酸缓冲液和
图1在不同流动相系统对Ta1系列多肽分离选择性的影响色谱柱：ZO R B A X Ecl i pse4．6×150m m．5p m
27
现代仪器(w w w．m oderni ns t rs．or g．cn)
醋酸三乙胺系统接近中性pH，通过改变分子的表面电荷改变分离的选择性。

三种流动相的分离结果表明，在T Q l质量控制中，可以通过改变流动相系统，达到改变分离选择性，将主成分与杂质完全分开的目的。

2．2梯度洗脱时间的影响
选择磷酸缓冲液(pH5．7)系统，确定最佳梯度范围(0-25％B)后，考察不同梯度洗脱时间对多肽混合物分离的影响(见图2)。

改变梯度洗脱时间可以通过增加或减少多肽分子在系统中的保留而改变分辨率，但对T Q1系列多肽的分离选择性没有影响。

2．3其它因素对分离的影响
还考察柱温、键合相类型等其它各因素对T o【1系列多肽分离的影响。

研究显示，提高柱温能够缩短样品的保留时间，对分离度没有明显影响，选择相同尺寸的C。

柱、C。

柱用三氟醋酸／乙腈流动相系统对样品进行分离，结果表明两种色谱柱对厂’—丁——丁。

一，r———i———■函一——=r’’，五。

’=图2梯度洗脱时间对T a1系列多肽分离的影响
T0【l系列多肽的分离没有明显的差别。

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