微囊藻胞内毒素的提取方法
微囊藻毒素LR、RR的提取和纯化
: 而 一取 。 ， 上清液。 残渣中加人6 m 6 %甲醇溶 0 L0
液， 放置磁力搅拌器上搅拌6 而n ， 0 超声振荡 2 而n 后 0
离 心巧 m 取上清液， n i 步骤重复两次后合并 上清液，
同时弃去残渣。粗提液调节 pH 值净化后经砂芯漏斗 过滤 ， 4 ℃条件下真空旋转燕发 ， 在0 去除溶液中的甲 醇， 将提取 液通过0 .4 卿 滤膜得粗提液。 5
摘要:以天然水华蓝藻为原料， 建立了以甲醉溶液提取和固和萃取为主要步骤的微囊藻毒素分离纯化方法。比较 不同极性提取剂对微囊藻毒素的提取效果， 结果表明:印% 甲醇有较高的提取效率， 同时优化了提取方法。并通过 调节溶液pH 值至藻胆蛋白等电点的方法除去共提取的大量藻胆蛋白， 取得了 很好的净化效果， 为微囊藻毒索的分 离和纯化研究提供了基础。 关键词:微囊藻毒素;提取;纯化;固相萃取 中图分类号:x 7 .5 l 1 文献标识码:A 文章编号:1以 1 16( 2州7 】 一 9 一 吃一 】 0 的1 以 5 近年来， 由水体富营养化导致的蓝藻水华 污染 已 引起全球关注。蓝 藻水华污染所带来的主要危害是有 毒蓝藻向水体中释放多种不同类型的微囊藻毒素( 加-
管阵列检测器;检测波长:238 n 。 m
的。 然而， 是较长时 取， 若 间提 必须维持 较低的温度， 但也有 人 发现采 醇溶液提取微囊藻毒素时， ℃和4 ℃ 用甲 0 2 0 没有 什么明显不同 。考虑到操作方便， 本实验均 在室
1， 4 M C 的纯 化 S
1
1 .1
实验
仪器
wa e。川 朋 一 9 型高效液相色谱仪 一 t 1 c。 2 5 6 配有
Wa e招一 t 2996 型 DA 二 极管 阵列检 测器， rO 1 p 岌 sm朋1
水中微囊藻毒素去除方法的研究
水中微囊藻毒素去除方法的研究
研究背景：
微囊藻毒素是污染水环境的主要原因。
它们会引发许多毒理作用，可能通过不同的生物和非生物过程对网络生态系统有害。
为了减轻微囊藻毒素对人体和环境的潜在毒性危害，十分必要的是开发有效的水处理技术来降低水体中的微囊藻毒素浓度，实现安全饮用水和水质保护。
研究内容：
本研究将集中研究微囊藻毒素去除方法，E-NTU法作为我们探讨的重点。
本研究将探讨微囊藻毒素去除效率及其影响因素，例如水温，加药量，pH值，来水流量和沉积时间等，以及膜过滤和活性炭及其他技术对微囊藻毒素去除效果的比较研究。
本研究还将针对微囊藻毒素去除时的工艺经济性进行评估。
研究进程：
本研究将以实验室和室内水处理系统为主要研究载体，主要研究步骤如下：
（1）详细研究微囊藻毒素的分类，观察其出现在水中的状况及其分布特征。
（2）测定不同pH值下微囊藻毒素的去除效果（汞板培养及凝集剂），并深入研究去除机理。
（3）应用E-NTU法进行微囊藻毒素去除实验，探讨水温、加药量、pH值、来水流量和沉积时间等条件下的E-NTU法微囊藻毒素去除效率及其影响因素的影响规律。
（4）研究膜过滤、活性炭和其他技术的去除效果，并探讨去除效果的机理，对比不同技术在同等条件下对微囊藻毒素去除效率的区别。
（5）本研究将建立模型，测算技术在各个参数下的经济性分析，以评估微囊藻毒素去除技术在实际应用中的技术经济性。
微囊藻毒素的分离、纯化和制备
江 苏 环 境 科 技
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Ｖｏ ．０ Ｎｏ５ １２ ．
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０ 引 言
了一 定探 讨 与 优 化 ， 取 得较 好 效 果 ， 并 同时 可分 离 、
近 年来 ．由水 体 富 营养化 导致 的蓝 藻 水华 污 染 已引起 全球 关注 蓝 藻水 华污 染所 带来 的主要 危 害 是 由毒 蓝藻 向水体 中释放 多种 不 同类 型 的微囊 藻 毒 素 （ ｃｏｙｔ ． ｓ … ， 中微囊 藻毒 素 ＭＣ Ｌ 和 Ｍｉ ｃ ｓ ｓＭＣ １ 其 ｒ ｉ —Ｒ ＭＣ Ｒ — Ｒ是我 国富 营养 化 水 体 中最 主要 的 ２种 藻 毒 素 ＭＣ 是一 种公 认 的肝毒 素 和促癌 剂 ． ｓ 长期 饮用 含 有 ＭＣ ｓ的水 会 对人 的肝脏 造 成损 伤 ． 极端 情况 下 会危 及 到人 的生命 ｆ ３ 】 随着 水 华 污染 问 题 的深 入 研 究 ． ｓ在 环境 中 ＭＣ 的分 布 、 移 、 累和 归 宿 等环 境 行 为 ， 迁 积 以及 在环 境 污染 治理 方 面受到 环保 工作 者 的特别 关 注 到 目前 为 止 。 ＭＣ 对 ｓ的分 布 、 结构 鉴 定 、 量 检测 、 性 评 含 毒 价 、以及 毒性 机理 等方 面 已做 了大量 工作 ．但 ＭＣ ｓ 纯 品 的 缺少 成 为 困扰 研 究 人 员 对 ＭＣ 进 行 深 入 研 ｓ 究 的瓶颈 问题 之一 ． 因此迫 切需 要研 究 一种 有效 提 取、 纯化 、 制备 ＭＣ 的方 法 实 验利 用原 料 丰富 的天 ｓ 然水 华新 鲜 藻浆 为原 料 ． ＭＣ 对 ｓ的提取 和 净 化进 行
海洋产藻微囊藻毒素的分离与纯化及其毒理学研究
海洋产藻微囊藻毒素的分离与纯化及其毒理学研究随着全球气候变化和人类活动的影响，海洋环境中微囊藻毒素的含量不断升高，引起了广泛关注。
微囊藻毒素是一种由微囊藻生产的神经毒素，可以对水生生物、家畜和人类造成严重危害。
因此，对海洋产藻微囊藻毒素的研究和控制已成为一项重要的环境保护工作。
一、海洋产藻微囊藻毒素的分离与纯化微囊藻毒素的分离与纯化是毒理学研究的重要环节。
目前，常用的微囊藻毒素分离和纯化方法包括柱层析、浓缩、高效液相色谱等。
不同的方法适用于不同的微囊藻毒素种类和含量。
柱层析是一种常用的分离方法，可根据某些特定的化学性质对微囊藻毒素进行分离。
例如，正相柱层析适用于小分子微囊藻毒素的分离，而反相柱层析适用于大分子微囊藻毒素的分离。
浓缩法是将微囊藻毒素浓缩到高浓度，然后通过高效液相色谱或其他方法进行分离和纯化。
高效液相色谱是一种高效、准确的分离方法，常用于对微囊藻毒素进行分离和纯化。
二、微囊藻毒素的毒理学研究微囊藻毒素的毒理学研究主要包括毒性和对生物学影响两个方面。
毒性研究是评估微囊藻毒素对生物体健康的影响。
微囊藻毒素可通过三种途径进入生物体内：口服、皮肤接触和呼吸道吸入。
口服是重要的途径，因为水生生物和家畜通常通过口服摄入微囊藻毒素。
微囊藻毒素的毒性主要表现在神经系统、消化系统和免疫系统方面。
长期暴露于微囊藻毒素环境中的人类和动物容易患上心血管疾病、中毒、癌症等疾病。
对生物学影响的研究主要研究微囊藻毒素对人类、水生生物和家畜等的影响。
微囊藻毒素对水生生物和家畜的影响主要表现在消化系统、生殖系统和免疫系统方面。
例如，微囊藻毒素可导致水生生物的阳病毒、GPA、贝类毒素等问题。
而对于人类的影响，则主要表现在神经系统、肝脏和肠胃方面。
三、微囊藻毒素污染的控制为了保障人类和动物的健康，需要采取措施控制海洋产藻微囊藻毒素的污染。
目前，主要控制措施包括早期发现和预警、水质治理、养殖管理以及饮用水和食品的安全控制等。
微囊藻毒素样品采集与前处理技术
微囊藻毒素样品采集与前处理技术因为微囊藻毒素在环境介质中的含量极低，挺直测定微囊藻毒素敏捷度往往不够，需要在仪器分析前对样品举行前处理。
前处理技术挺直影响分析结果。
前处理技术主要包括萃取技术和净化分别技术。
萃取过程的目的是从大量的样品基体中提取分析物，并转移至合适的溶剂中，同时对分析物举行富集净化。
前处理过程的挑选和萃取效率与样品类型有较大的关系。
一、水样采集与前处理技术 GB/T 20466-2006规定了含水样的采集办法。
用采水器采集1500～2 000 ml水样（水样采集后，应在4h内完成以下前处理步骤）。
用500目的不锈钢筛过滤，除去水样中大部分浮游生物和悬浮物。
取过滤后的水样1200 ml于玻璃杯式滤器中，依次经GF/C玻璃纤维滤膜和0.45um乙酸纤维酯滤膜。
减压过滤。
精确量取1 000 ml滤液置于棕色试剂瓶中。
水中微囊藻毒素的提取主要以固相萃取为主，通常用法C18填料的反相柱。
萃取过程：将水样通过经过和水活化后的C18小柱，其中微囊藻毒素可保留在固定相中，用强极性溶剂水和低浓度／水溶液（体积比普通低于20%）依次洗涤，去除一些水溶性较强的干扰物，然后用强溶剂100％酸化甲醇［普通添加0.1％或0.05%～0.1％（体积分数）］洗脱和收集微囊藻毒素。
除了C18柱外，还有用法HLB柱、XAD-2树脂、免疫亲和色谱柱等均取得良好的纯化富集效果。
C18固相萃取的参考条件如下：上样前依次用10 ml和水活化C18固相萃取小柱，流量为5 ml/min。
取水样IL，加入10 ml混匀，5 ml/min流量上样。
10m15％的水溶液淋洗小柱，流量为5 ml/min。
20 min吹干固相小柱，然后5 ml含0.1％甲酸的甲醇洗脱两次，流量1 ml/min。
合并洗脱液，氮吹浓缩至0.2 ml 以下，50％／水定容至1 ml。
过针式滤膜，待分析。
有报道讨论了末端封尾（end-capping）和未封尾的C18小柱对5种微囊藻毒素（RR,YR, LR, LW和LF）固萃回收率的影响。
微囊藻毒素几种处理方法
微囊藻毒素几种处理方法点击次数：145 发布时间：2010-3-24 10:34:331物理方法1.1絮凝—沉淀法混凝沉淀对去除溶解性藻毒素作用较小，但改进后的絮凝—沉淀法是一种比较有效的去除水体中藻毒素的方法。
戎文磊等人的研究表明，经生物砂滤和加氯氧化后能有效降解水中溶解性藻毒素含量，去除率平均达63％左右[4]。
Grutzmacher[5] 等人的研究也说明慢滤技术也能有效去除饮用水中细胞内毒素。
同样，肖兴富等用加压气浮技术向水体中释放多功能微气泡, 将水体中的藻类进行了直接回收试验, 也取得了很好的效果。
[6]1.2吸附法活性炭吸附是目前研究最多的一种物理去除微囊藻毒素的方法，常用的活性炭滤料为：粉末活性炭（PAC）和颗粒活性炭（GAC）。
多数研究表明，PAC和GAC均可有效且快速（接触时间30 min）地去除水中的藻毒素。
贾瑞宝等的研究表明，当活性炭投量增加至40 mg•L-1时，水样中已检测不到微囊藻毒素了[7]。
朱光灿和吕锡武等[8]采用生物活性炭深度处理工艺去除饮用水中微囊藻毒素的研究显示，当HRT为1.5h时，CODMn和UV254的去除率分别为55.3％和35.1％，MC-RR、MC-YR和MC-LR的去除率分别为60.57％、63.30％、68.79％。
尽管活性炭可有效去除微囊藻毒素,但水中存在的其它有机污染物也会被吸附到活性炭表面,降低了活性炭的使用寿命。
频繁的更换和再生使得活性炭吸附法运行费用昂贵。
除了活性炭外，粘土矿物和碳纳米管对微囊藻毒素也有一定的吸附作用。
闫海等研究了不同粘土矿物和碳纳米管（CNTs）吸附去除水体中微囊藻毒素的作用. 结果表明CNTs的吸附效率与外径有关，外径2~10nm的CNTs对MCS 的吸附能力较强，在MC-RR和MC-LR 的初始浓度分别为21.5 和9.6 mg·L-1时,尽管高岭土和海泡石等粘土矿物对MCs 有一定的吸附能力,但吸附量分别低于4.0 和2.0mg·g-1 . 与测试的不同粘土矿物相比, CNTs吸附MC-RR 和LR 量分别达到了14.8和5.9mg·g-1 ,是其它粘土矿物吸附量的5倍左右[9]。
高压液相色谱法测定水中微囊藻毒素
高压液相色谱法测定水中微囊藻毒素摘要：本方法用于测定生活饮用水及水源水中的微囊藻毒素。
方法中水样过滤后，滤液（水样）经反相硅胶柱富集萃取浓缩，藻细胞（膜样）经冻融萃取，反相硅胶柱富集萃取浓缩后，分别用高压液相色谱分析。
关键词：固相萃取液相色谱微囊藻毒素1、引言随着社会工业化进程的加快，人类在工农业生产及日常生活中，向水体排放大量含氮、磷的污染物，加速了湖泊的富营养化，藻类由此获取丰富的营养而大量繁殖。
致使水质日趋恶化，水体中的藻类能释放出生物毒素——藻毒素，藻毒素LR是目前已知的毒性最强的，危害最大的一种淡水蓝藻毒素。
本方法能有效的检测出水源水及饮用水中的微囊藻毒素LR的含量。
2、实验部分2.1 仪器(1)液相色谱仪：Waters e2695，配二极管阵列检测器和3D工作站。
(2)检测器：2998型PDA检测器。
(3)色谱柱：Sunfire C18 150mm×4.6mm。
(4)采样瓶：2.5升棕色磨口玻璃瓶。
(5)5mL容积的尖底浓缩瓶。
(6)固相萃取仪：DIONEX Auto Trace 280。
(7)氮吹浓缩仪：Turbo Vap LV。
(8)富集柱：Oasis HLB 3cc/60mg。
2.2 试剂(1)甲醇：色谱纯；(2)乙腈：色谱纯；(3)三氟乙酸；(4)高纯氮；(5)纯水；(6)标准溶液：Enzo Microcystin-LR 500ug。
2.3 水样前处理操作程序2.3.1 水样的采集与保存用 2.5升棕色磨口玻璃瓶采集样品，在采样前要把采样瓶用待采水样荡洗2～3次。
采样时不得留有顶上空间和气泡。
水样采集后应尽快分析，若不能及时分析，应在4℃冰箱中贮存，尽快分析。
2.3.2 SPE样品预处理(1)活化：分别用3ml甲醇活化固相萃取小柱,再用6ml纯水洗去活化溶剂。
(2)水样富集：样品量1L，水样流速为5ml/min，水样装载结束后，用10ml 纯水淋洗小柱,以去除水溶性干扰物质。
微囊藻毒素-LR的分离纯化
随着水体环境污染的加剧 ， 水 中有害蓝藻水华 层析 法 等 从铜 绿 微囊 藻 中分离 纯 化 ＭＣ － Ｌ Ｒ， 为 事件频 繁发 生 ， 已成 为 国 内外普 遍关 注 的环 境 问 ＭＣ — Ｌ Ｒ的上述相关研究提供纯品。 题 。微囊藻毒素为有害蓝藻释放的一类具有强烈促
癌作 用的肝毒素ｎ ］ 。微囊 藻毒素一 Ｌ Ｒ （ ＭＣ — Ｌ Ｒ ） 是
Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ：Ｍｉ ｃ ｒ ｏ ｃ ｙ ｓ ｔ ｉ ｎ － Ｌ Ｒ
（ ＭＣ－ Ｌ Ｒ） ｉ ｓ ａ ｈ ｉ ｇ ｈ ｌ ｙ ｔ ｏ ｘ ｉ ｃ ｓ ｕ ｂ ｓ ｔ ｎｃ ａ ｅ ｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｅ ｄ ｂ ｙ ｆ ｒ ｅ ｓ ｈ ｗａ ｔ ｅ ｒ ｃ ｙ ｎｏ ａ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ａ ．Ｔｈ ｅ ｒ ｅ ｉ ｓ ａ
第３ ６ 卷第 ５ 期
２ ０ １ ３ 年１ ０ 月
长春理 工大 学学报 （ 自然科学版 ）
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｃｈ ｎｇ ｅ ｃ ｈ ｕ ｎ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｅ ｎ ｄ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ（ Ｎａ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ Ｅ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ）
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微囊藻胞内毒素的提取方法
９５ 自中国科 学 院水 生生 物研究 所淡水 藻种 库， 外水 ０来 野
第 ３ 卷 第４ ５ 期
２ １年 ７ 月 ０１
水 生 生 物 学 报
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提取 溶剂体 系 的选 择 和提取技 术 的选 择和 比较上 。 已报道 溶剂 体 系包括超 纯水 、５ ％乙酸 、５ ％一 １０ ０ ０ ％甲醇 、正丁
醇 、三 氟乙酸 （ Ｆ 等 ：提 取方 法包 括反 复冻融 提取 、超 Ｔ Ａ）
全 。微 囊 藻（ ｃｏ ｙ ｔ ） 常见 的水 华蓝 藻种 类，其所 产 Ｍｉ ｃ ｓｉ 为 ｒ ｓ 生 的微 囊藻 毒素（ ｃｏｙ ｔ ｓ ＭＣ ） Ｍｉ ｃ ｓｉ ， ｓ不仅会 严重 危害水 生 ｒ ｎ
微囊藻毒素的提取和提纯研究
微囊藻毒素的提取和提纯研究闫海;潘纲;张明明;陈海柳;邹华【期刊名称】《环境科学学报》【年(卷),期】2004(24)2【摘要】对采自云南滇池水华蓝藻细胞中的微囊藻毒素 (Microcystins,MCs)的提取与提纯方法进行了研究 .结果表明 ,在藻细胞干重浓度为2 0g·L-1下 ,与不同甲醇浓度提取液相比 ,4 0 %甲醇溶液可以最有效地从藻细胞中提取出MC RR和MC LR .将MCs提取液过Waters固相萃取小柱后 ,用 70 %甲醇溶液洗脱吸附于柱上的MCs ,可以分别获得 7 3%和 3 5 %纯度的MC RR和MC LR .通过观察洗脱液的颜色变化 ,收集蓝绿色和橘黄色后面流出的基本无色的洗脱液 ,可以获得纯度为 2 8 6 %和12 9%的MC RR和MC LR .【总页数】5页(P355-359)【关键词】微囊藻毒素;蓝藻;提纯方法;浓度;提取液;洗脱液;湖泊;藻类水华污染【作者】闫海;潘纲;张明明;陈海柳;邹华【作者单位】中国科学院生态环境研究中心【正文语种】中文【中图分类】X524;X173【相关文献】1.水体中溶解性微囊藻毒素与藻类细胞内微囊藻毒素的关系研究 [J], 蔡金傍;李文奇;逄勇;杨旭光2.铜绿微囊藻细胞培养与藻毒素LR提取的研究 [J], 郝赤;Wilk,RM3.微囊藻毒素缓解过氧化氢胁迫下铜绿微囊藻损伤的初步研究 [J], 丁奕;甘南琴;郑凌凌;宋立荣4.铜绿微囊藻藻毒素提取液对小鼠淋巴细胞DNA损伤的研究 [J], 隋丽丽;梁文艳;陈莉;阮铃铃;许佳;梁志霞5.官厅水库水体中微囊藻毒素及其与微囊藻细胞密度相关性研究 [J], 张娟;梁前进;周云龙;包智泓;李启军因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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ａ１．【ｌ ７】在提取ＰＣＣ ７８２０时发现０．１％ＴＦＡ溶于８０％甲醇 溶液提取效率最高：闫海等【ｌ ８】用不同比例提取滇池晒干
藻粉时发现，４０％甲醇效率最高，而本研究发现溶剂Ａ提 取效率最低，溶剂Ｂ略好，溶剂Ｃ提取回收率最高。
Ｆａｓｔｎｅｒ，ｅｔ ａ１．［１６】同时发现５％乙酸对于亲水性的ＭＣ．ＲＲ 有着更高的提取效率，甚至接近纯甲醇提取效率的２倍，
实验组Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ 实验组Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ 实验组Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ 实验组Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ 实验组Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ 实验组Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
墅！婴！墅！业；臣！业ｊ罂！业！墅！坚！墅！竖！
溶剂Ａ
溶剂Ｂ
溶剂Ｃ
溶剂Ａ＋超声波破碎 溶剂Ｂ＋超卢波破碎 溶剂ｃ＋超声波破碎
提取溶剂体系的选择和提取技术的选择和比较上。已报道 溶剂体系包括超纯水、５％乙酸、５０％一１００％甲醇、正丁 醇、三氟乙酸（ＴＦＡ）等：提取方法包括反复冻融提取、超 声波破碎提取、搅拌提取【１２－１５］等。但现有研究忽略了不 同样品类型的差异，如室内培养物和野外水华样品之间 的差异。一般来说，室内纯培养物以单细胞为主，易于 ＭＣｓ的提取，而野外水华样品大多为大群体，含有胶被， 完全提取比较困难。为提高ＭＣｓ监测结果可靠性和不同 实验室数据的可比性，针对不同类型的藻样，建立统一、 高效的提取方法至关重要。本研究旨在探讨针对不同类型 微囊藻样品细胞胞内的最优提取方法。
水搅拌提取，３０ｍｉｎ也可达到最优提取效率（图１、２）。 Ｍｅｒｉｌｕｏｔｏ，ｅｔ ａ１．【１４】发现用水和水．甲醇－正丁醇（７５：２０：５，
ｖ／ｖ）分别提取冻干蓝藻中的ＭＣｓ的效率差异不大，因此， 他们认为提取ＭＣｓ不需要有机溶剂。而Ｌａｗｔｏｎ，ｅｔ ａ１．［１５１
研究发现用甲醇提取冻融过的蓝藻，对极性较强的ＭＣｓ
甲醇；Ｄ．０．１％三氟乙酸溶于８０％甲酵＋超声波破碎：Ｅ，５％乙酸接
着８０％甲醇：Ｆ．５％乙酸接着８０％甲醇＋超声波破碎 Ａ．ｐｕｒｅ ｗａｔｅｒ；Ｂ．ｐｕｒｅ ｗａｔｅｒ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ；Ｃ．０．１％ ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ８０％ｍｅｔｈａｎｏｌ；Ｄ．０．１％ｔｒｉｎｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ８０％ｍｅｔｈａｎｏｌ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ；Ｅ．５％ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ８０％ｍｅｔｈａｎｏｌ；Ｆ．５％ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ８０％ｍｅｔｈａｎｏｌ ａｎｄ ｕｌｔｒｏｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ
取３次（实验组１）、溶剂Ｂ提取３次（实验组２）、溶剂Ｃ
提取３次（实验组３）、溶剂Ａ十超声波破碎（６００ ｗ，５ｍｉｎ）提 取３次（实验组４）、溶剂Ｂ＋超声波破碎提取３次（实验组
５）、溶剂ｃ＋超声波破碎提取３次（实验组６）。结果表明，对
于两株室内单细胞纯培养物，经反复冻融３次后，超声波
破碎提取和３种溶剂对ＭＣｓ提取无显著差异，即使超纯
２结果与讨论
２．１不同提取溶剂和超声波破碎对ＭＣｓ提取效率的影响
室内纯培养物ＦＡＣＨＢ ９０５和ＰＣＣ ７８０６
两株藻
经扩大培养离心收集后，经反复冻融３次，冷冻干燥，然
后提取ＭＣｓ。该实验分成６组进行（其中实验组ｌ一３分 别为溶剂Ａ、Ｂ、Ｃ比较；实验组４—６分别为溶剂Ａ、Ｂ、
Ｃ辅以超声波破碎提取比较），具体如下（表１）：溶剂Ａ提
ＳＴＵＤＹ ｏＮ ＥＸＴＲＡＣＴｌｏＮ ＭＥＴＨｏＤＳ ｏＦ ＩＮＴＲＡＣＥＬＬＵＬＡＲ ＭＩＣＲｏＣＹＳＴＩＮＳ
ＰＥＮＧ Ｌｉａｎ９１一．ＣＨＥＮ Ｗｅｉｌ ａｎｄ ＳＯＮＧ Ｌｉ．Ｒｏｎ９１
（１．Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆＦｒｅｓｈｗａｔｅｒ Ｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆＨｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ， Ｗｕｈａｎ ４３００７２，Ｃｈｉｎａ；２．Ｇｒａｄｕａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆＣｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＢｅＵｉｎｇ １ ０００４９，Ｃｈｉｎａ）
异构体的效率要略微高于水．甲醇．正丁醇（７５：２０：５，ｖ／ｖ）， 但要显著高于５％的乙酸，所以，他们认为用甲醇作为提取 溶剂最为理想。而本研究认为对于经冻融过的室内纯培养
藻株，超纯水搅拌３０ｍｉｎ即可，这就可以节省有机溶剂，
同时避免有机溶剂对实验人员的身体损伤。
太湖水华蓝藻
太湖水华样品在保温冰箱中运输
碎、搅拌。结果表明，冷冻干燥和１０５＂１２烘干对藻细胞生
物量或细胞干重的准确计算无显著影响（图４）。对于无冷
冻干燥仪的实验室，１０５℃烘干恒重即可准确计算藻细胞
干重，对ＭＣｓ提取结果计算不会造成影响。反复冻融都
能显著提高三种样品ＭＣｓ的提取效率（Ｐ＜Ｏ．０５）（图５），
Ｌｅｈｍａｎ［２０】也曾发现，反复冻融能促进细胞壁的破裂，从
收稿日期：２０１０．０５．１７；修订日期：２０１０．１２．２８ 基金项目：９７３项目（编号：２００８ｃＢ４１８００６）资助
作者简介：彭亮（１９８０－－），男，湖南临湘人；博士研究生；主要研究方向为藻类毒理学。Ｅ．ｍａｉｌ：ｐｅｎｇｌｉａｎ９０９２０＠１６３．ｃｏｒｎ 通讯作者：宋立荣，Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｒｓｏｎｇ＠ｉｈｂ．ａｃ．ｃｎ
１材料与方法
１．１实验材料 ＭＣ．ＬＲ和ＭＣ—ＲＲ标准品购自Ｗａｋｏ公司（日本），铜
绿微囊藻（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＣＣ７８０６和ＦＡＣＨＢ ９０５来自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库，野外水 华样品以２５。浮游生物网于２００４年７月采自太湖梅梁湾。 １．２实验仪器
液相色谱仪ＬＣ．１０Ａ（日本岛津公司）、ｕＶ检测器、 Ｓｈｉｍ—ｐａｃｋ ＶＰ－ＯＤＳ色谱柱（１５０ ｎｌｌｎ×４．６ ｎｕｎ，５ ｐｍ）、冷
随着伞球淡水水体富营养化程度的不断加剧，蓝藻 水华及其毒素污染问题已经逐渐威胁到人类饮用水的安 全。微囊藻（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ）为常见的水华蓝藻种类，其所产 生的微囊藻毒素（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎｓ，ＭＣｓ）不仅会严重危害水生 态系统，并且可能会给人类健康带来威胁【１，２】。我国云南 滇池、江苏太湖和安徽巢湖等淡水湖？自均发生不同程度的 蓝藻水华。并检测到了高含量ＭＣｓ的存在【３，４１。微囊藻毒 素不仅能通过饮用水直接进入人体内，而且还可以在水 生动植物体内积累，并通过水生食物链传递进入人 体【５，６１。在水华和水柱中ＭＣｓ检测及其风险评价研究是深 入了解水华污染过程的基本手段和方法，近年来已经成 为该领域研究热点之一。而ＭＣｓ的提取和纯化技术是准 确测定的前提，也逐渐备受关注。
万方数据
７１０
水 生 生 物 学报
３５卷
和ＰＣＣ ７８０６，两次提取即可达到完全提取效果，二者第 一次提取效率分别为９３．８％、９７．７％，第二次提取效率分 别为６．２％、２．３％，第三次提取二者均未检测到ＭＣｓ的存 在。而对于太湖水华样品，三次提取效率分别为８６．７％、 １２．４％、０．９‰说明无论是何种样品，三次提取即可达到 完全（图６）。Ｂａｒｃｏ，ｅｔａｌ．【Ｉ ７Ｊ发现，用酸化后的甲醇提取野 外水华样品中的ＭＣｓ，第三次提取效率仅为５％一９％，与 本研究结果类似。
培养物经８０００ ｒ／ｍｉｎ离心，等重分装，一部分一２０＂Ｃ 反复冻融３次，一部分１０５℃烘干，另一部分冷冻干燥， 称重后分别用以下溶剂提取：超纯水（溶剂Ａ）、０．１％ＴＦＡ一 ８０％甲醇溶液（溶剂Ｂ）、５％乙酸提取后用８０％甲醇提 取两次（溶剂ｃ），并辅以超声波破碎、搅拌等方法。离心 后合并上清液，用ＯＤＳ固相萃取柱纯化，后用９０％甲醇 溶液洗脱，洗脱液４０。Ｃ旋转浓缩至干，１ ｍＬ ２０％甲醇定 溶待测。
图１ 不同提取方法对铜绿微囊藻（Ｍｉｅｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ） ＦＡＣＨＢ ９０５（经ｉ次冻融）中微囊藻毒素提取效率的影响 Ｆｉｇ．１ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉ— ｃｒｏｃｙｓｔｉｎｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＦＡＣＨＢ ９０５（ｐｒｅ．ｔｒｅａｔｅｄ ｂｙ ｆｒｅｅｚｉｎｇ－ｔｈａｗｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｒｅｅ ｔｉｍｅｓ） Ａ．超纯水：Ｂ．超纯水＋超声波破碎：Ｃ．０．１％三氟乙酸溶于８０％
万方数据
４期
彭亮等：微囊藻胞内毒素的提取方法
７０９
冻干燥仪（Ｙａｍａｔｏ，日本）、ＯＤＳ固相萃取柱（Ｓｃｐ－ｐａｋ ＯＤＳ， Ｗａｔｅｒｓ公司）、旋转浓缩仪（Ｂｉｉｃｈｉ公司）、超声波破碎仪（宁 波新芝）、六联磁力搅拌仪（江苏金坛）。 １．３实验方法
铜绿微囊藻ＰＣＣ ７８０６和ＦＡＣＨＢ ９０５用ＢＧＩｌ置于 ｌＯ Ｌ玻璃瓶中光照通气培养，培养温度为２５＂Ｃ，光强为 ２０ ｐＥ／（ｍ２．ｓ），光暗周期为１２ｈ：１２ｈ。
至实验室。经反复冻融３次后冷冻干燥，然后提取ＭＣｓ。
按照上述方法设６个实验组（图３）。结果表明：３种溶剂对
ＭＣｓ的提取回收率存在显著性差异（Ｐ＜０．０５），实验组ｌ、 ３、５之间均存在显著性差异。Ｆａｓｔｎｅｒ，ｅｔ ａ１．Ｕ６】发现提取
野外冻干蓝藻时７５％的甲醇要好于１００％甲醇；Ｂａｒｃｏ，ｅｔ
关键词：微囊藻细胞；微囊藻毒素；提取方法；优化；定量分析
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ｃｅｌｌ；Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎｓ；Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ；Ｏｐｔｉｍｉｚｅ；Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ
中图分类号：Ｑ．３３
文献标识码：Ａ
文章编号：１０００－３２０７（２０１ １）０４－０７０８－０５
ＭＣｓ检测方法主要有：生物学方法，包括小白鼠毒 性实验、蛋白磷酸酶抑制检测法（ＰＰＩＡ）［７，ｓ】、酶联免疫吸 附ｉ式验（ＥＬＩＳＡ）ｔ９＇ｔｏ］；化学方法，包括毛细管电泳（ｃＥ）、薄 层层析（ＴＬＣ）、ＨＰＬＣ、ＨＰＬＣ．ＭＳｔｌｌ．１３）等。无论选择何种 检测方法，充分提取是准确测试的先决条件。现阶段国内 外已报道的提取方法较多，但不统一，这就给实验结果 的可靠性和可对比性带来诸多不确定因素。对于细胞结合 态ＭＣｓ提取方法比较研究，目前已有文献主要集中在对