单细胞凝胶电泳检测DNA损伤的最新研究进展

核农学报2011，

25（6）：1230 1234Journal of Nuclear Agricultural Sciences

收稿日期：2011-02-17接受日期：2011-

04-14基金项目：国家自然科学基金（31071297）

作者简介：张春红（1986-），女，研究生，研究方向为生物化学、分子生物学与遗传学。Tel ：0571-********；E-mail ：zhangch@cjlu．edu．cn 通讯作者：林欣大（1975-），男，博士后，副教授，研究方向为遗传学、生物化学与分子生物学。Tel ：0571-

86835703；E-mail ：linxinda@cjlu．edu．cn 文章编号：1000-

8551（2011）06-1230-05单细胞凝胶电泳检测DNA 损伤的最新研究进展

张春红

林欣大

（中国计量学院生命科学学院/浙江省生物计量与检验检疫重点实验室，浙江杭州

310018）

摘

要：DNA 损伤检测能够检测农药、

辐射等引起的DNA 损伤。随着近年来DNA 损伤检测需求的迅速增加，发展快速、高通量、直观的DNA 损伤检测技术，对农业研究、环境科学、毒理学和生物学研究都有重要意义。单细胞凝胶电泳是一种能够直观、准确的反映DNA 损伤的检测方法，为了提高该方法的检测效率和准确性，研究者不断对其进行改进。近年来，随着新材料及新技术的应用，检测的通量和准确性得到了显著提高。本文结合最近报道的微室阵列法在单细胞凝胶电泳中的应用，对常规和最新的单细胞凝胶电泳的特点加以归纳综合，并讨论了其发展前景。

关键词：DNA 损伤；单细胞凝胶电泳；微室阵列

THE LATEST PROGRESS IN SINGLE CELL GEL ELECTROPHORESIS

（SCGE ）BASED ON DNA DAMAGE DETECTION

ZHANG Chun-hong LIN Xin-da

（College of Life Sciences ，Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biometrology and Inspection ＆Quarantine ，

China Jiliang University ，Hangzhou ，Zhejiang

310018）

Abstract ：DNA damage detection can detect DNA damage caused by the pesticide and irradiation．With the increasing demands of DNA damage detection ，the development of a rapid ，high throughput and straight forward DNA damage detecting technique has critical biological significance for Single Cell Gel Electrophoresis （SCGE ）is a straight and accurate way to detect the DNA damage．In recent years ，the throughput and accuracy of the detection SCGE method have been improved significantly by applying new materials and new technologies．This paper reviewed the most recently reported SCGE based DNA damage detection technique-microwell array method and conventional SCGE method ，and the prospect were also discussed．

Key words ：DNA damage ；single cell gel electrophoresis ；microwell array

活性氧自由基在生物体内可以造成DNA 损伤，癌症等疾病以及机体衰老等过程都与其密切相关。在癌症病人中，DNA 遗传信息的稳定性受到不同程度的破坏［1］

；在衰老过程中，DNA 也存在不同形式和不同程度的损伤，且这种损伤更会随着年龄的增加而逐渐积

累

［2］

。本课题组的单细胞凝胶电泳（SCGE ）试验结果

表明，在模式生物果蝇的衰老过程中，DNA 损伤也会逐渐增加（未发表资料）。

研究显示，在人们普遍使用的农药中，有71%会造成DNA 损伤，食用农药残留的农产品，或在环境中接触到这些农药，

会影响人类身体健康，并会通过遗传作用影响后代，导致癌症及遗传性疾病的发生

［3，7］

，如

范可尼贫血（fanconi anemia ）、毛细血管扩张性共济失调（ataxia telangiectasia ）和唐氏综合征（down syndrome ）［8 14］等疾病均涉及DNA 损伤及基因组的稳定性破坏；工业生产中重金属和多种有机化合物等有

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6期单细胞凝胶电泳检测DNA损伤的最新研究进展

毒物质的大量排放与积累，也会直接或间接损伤生物体的DNA［12，13］（未发表资料）；大气中的紫外辐射，也均可能导致基因组DNA损伤。通过DNA损伤检测，提早发现并快速检测到与DNA损伤相关的癌症及遗传性疾病，通过对环境标志物的DNA损伤检测也可以及时发现农药等有毒有害物质的污染情况，有利于及时采取措施对其进行控制和治理。由此可见，对DNA 损伤进行检测的意义重大。

1基于单细胞凝胶电泳的DNA损伤检测技术

DNA损伤包括单链损伤、双链损伤、链内交联、链间交联、碱基修饰、腺嘌呤丢失等。检测DNA损伤可根据DNA的基本成分进行，如32P-后标记-薄层层析法（32P-postlabeling-TLC assay）、免疫狭缝斑点分析法（ISB assay）、气相色谱-质谱-选择性离子测量分析方法（GC-MS-SIM）、高效液相色谱-毛细管气相色谱-质谱分析法（HPLC-GC-MS）、高效液相色谱-电化学测量法（HPLC-ECD）、免疫酶染色法等。然而，这些方法均有一定缺陷。如GC-MS法容易产生副产物，且数据重现性不好；HPLC-ECD法仅仅对电化学活性的产物有响应，易因DNA酶解不完全而产生误差；损伤检测也可通过DNA损伤所具有的基因特异性和序列特异性进行定位检测，如原位末端标记（TUNEL）、LM-PCR （ligation-mediated PCR）、RD-PCR（randomized terminal linker-dependent PCR）、RT-PCR（realtime PCR）等，或利用绿色荧光蛋白GFP进行示踪内源性活性检测、γH2AX识别抗体免疫荧光法、姐妹染色单体交换（SCE）法、程序外DNA合成试验（UDS）、末端转移酶介导的dUTP末端标记法以及电化学传感器法等方法进行DNA损伤检测，但这些方法往往都存在需要对样品进行预处理，耗时长、所需仪器相对较贵、操作繁琐、灵敏度与特异性较差、易产生交叉反应和环境污染、通量低而且检测对象单一等不足。

1.1常规单细胞凝胶电泳

单细胞凝胶电泳（single cell gel electrophoresis，SCGE）是一种广泛应用于检测单个细胞DNA损伤的方法，还能间接反映DNA损伤的修复情况［14］。因损伤的细胞电泳后形态颇似彗星，因此又称彗星电泳（comet assay）。单细胞凝胶电泳是由Ostling等人发明［15］，经Singh等进一步完善后逐步发展起来的［16 18］，适用于各种有核细胞DNA损伤的快速检测。据不完全统计，单细胞凝胶电泳法已被应用于检测200多个物种体外或体内DNA损伤。SCGE法能检测双链断裂、单链断裂、碱性不稳定位点、不完全切除修复、DNA-DNA互作、DNA-蛋白互作等多种形式的损伤，是一种无需放射性示踪、样品用量少、试验周期短、灵敏、快速高效的检测方法。

常规的SCGE主要由铺胶、裂解、解旋、电泳、中和、染色、结果分析几个步骤组成。首先将细胞悬液铺在已经预先铺了琼脂糖底胶的载玻片上，根据检测对象的不同选择适当的裂解方法，一般包括中性裂解（pH=8）及碱性裂解（pH＞13）［15］2种。中性裂解主要适用于单链断裂损伤，碱性裂解适用于单链和双链断裂损伤。在裂解过程中，细胞膜、核膜及其他生物膜遭到破坏，使细胞内的RNA、蛋白质及其他成分进入凝胶，继而扩散到裂解液中，但核DNA仍附着在剩余的核骨架上，留在原位（图1）。

通过解螺旋作用，受损的DNA双链解螺旋且碱变性为单链，缺口暴露出负电荷，在电场力的作用下，断裂的碎片离开核DNA向阳极迁移，小片段与大片段分子因泳动速度的不同形成拖尾。电泳结束后，用Tris 缓冲液中和，以去除碱和去污剂对染色的影响。染色后用荧光显微镜摄取图像，并用相关软件分析图像，一般通过采集尾长、尾重心、Olive尾矩、尾惯量、尾分布矩、尾长/头长比及尾DNA含量等数据对形状指标、距离指标、强度指标和矩类指标等进行分析［19］。

1.2Gelbond法

McNamee［20］等在常规SCGE的基础上进行改进，建立Gelbond法。该方法使用一种可黏附低熔点琼脂糖的Gelbond膜替代底胶，为低熔点胶提供了一个可黏附的表面，将混合细胞悬液的低熔点胶直接铺在Gelbond膜上，不仅避免了常规制胶容易脱胶的缺点，还能减少使用盖玻片时造成的样品损失。为了实现多个样品同时检测，还采用了可以在Gelbond膜上形成微室的Lab-TekII槽，根据样品需求制作1、2、4、8或16个微室。Lab-TekII槽包含一个底部可以黏附的带子，将它从玻璃片上移走时，槽可以重新黏附到Gelbond 膜上，且不会造成样品损失。当胶凝固后，移去Lab-TekII槽，Gelbond膜上就留下了相应的样品，再按照常规SCGE的步骤进行即可（图1）。

Gelbond法对制胶方法进行了改进，不容易脱胶，样品损失低，且可以多个样品同时进行，相对于常规SCGE来说是一大进步。

1.3微室阵列法

David等对SCGE作了进一步改进，在使用Gelbond膜的同时，将广泛应用于单细胞压力生物学、精子细胞培养、DNA合成、自粘功能抗体结合蛋白、等

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