聚丙烯酰胺凝胶电泳精品PPT课件
合集下载
聚丙烯酰胺凝胶电泳ppt课件
精选ppt
18
5 .电泳
将电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接，接 通冷却水，打开电泳仪开关，开始时电流为10 mA，待 样品进入分离胶后，将电流调至20-30 mA，当溴酚蓝 染料距硅胶框1 cm时，停止电泳，关闭电源及冷却水。
6 .染色与脱色
电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅胶框，用不锈钢 药铲或镊子撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加 样标记，在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为 前沿标记。加入染色液染色1-2 h，再用脱色液脱色， 直至蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。
表3.4 分子量范围与凝胶浓度的关系
分子量范围
适用的凝胶浓度/(%)
蛋白质
104 1-4×104 1-5×104-1×105 1×105 5×105
104 104–105 105-2×106
核酸(RNA)
20-30 15-20 10-15 5-10 2-5
15–20 5-10 2-2.6
精选ppt
5
当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移 率超过蛋白质；
（c)电位梯度的不连续性：
(2)分子筛效应
(3)电荷效应
精选ppt
10
图4 电泳过程示意图
A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子 B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的
区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。
电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称
PAGE)。
精选ppt
3
聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：
(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；
(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不 溶；
实验十六、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白质分析中的常用技术。在PAGE中加入SDS可使蛋白质变性，其迁移率主要取决于蛋白质分子大小。实验涉及多种试剂制备，包括丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体溶液、分离胶和浓缩胶缓冲液等。操作步骤包括分离胶的制备，需选择适当浓度的凝胶，混合液灌入电泳槽后聚合。浓缩胶制备需灌胶并插入样品梳。样品处理包括样品缓冲液混合、加热变性。电泳时采用稳流方式，电流和时间设定特定值。电泳结束后，凝胶进行染色与脱色，以显现蛋白质条带。
《SDSPAGE电泳》课件
它利用了SDS（十二烷基硫酸钠）和聚丙烯酰胺凝胶的特性，将蛋白质按照大小进 行分离。
SDS-PAGE电泳常用于蛋白质的纯度检测、分子量测定以及蛋白质的分离和纯化。
SDS-PAGE电泳的原理
01
SDS-PAGE电泳基于电荷和分子量的差异，将蛋白质分离成不 同的条带。
02
在电场的作用下，SDS会包裹在蛋白质分子周围，使其带负电
VS
定量方法
可以采用标准品法、光密度扫描等方法进 行定量分析，以获得更准确的定量结果。
04
SDS-PAGE电泳的优化与注意 事项
优化实验条件
确定最佳的分离胶浓度
根据蛋白质的分子量范围选择合适的 分离胶浓度，以确保蛋白质的分辨率 和分离效果。
选择合适的浓缩胶浓度
浓缩胶的作用是使样品在进入分离胶 之前压缩成一道狭窄的带，选择合适 的浓度可以避免样品扩散。
分离效果
分离效果是指电泳后各蛋白质条带的分布情况，应尽量减少拖尾、模糊或重叠现象。
பைடு நூலகம்
蛋白分子量测定
标准蛋白对照
使用已知分子量的标准蛋白作为对照 ，通过比较标准蛋白与未知蛋白条带 的迁移率，计算出未知蛋白的分子量 。
精度要求
分子量测定结果应精确到小数点后一 位，并尽量减小误差。
定量分析
染色密度
通过比较各蛋白条带的染色密度，可以 大致了解各蛋白在样品中的相对含量。
荷，消除不同蛋白质分子间的电荷差异。
聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，通过分子筛效应，使蛋白质按
03
照大小进行分离。
SDS-PAGE电泳的应用
蛋白质纯度检测
通过SDS-PAGE电泳，可以观察到清晰的蛋白条带， 判断蛋白质是否纯净。
蛋白质分子量测定
SDS-PAGE电泳常用于蛋白质的纯度检测、分子量测定以及蛋白质的分离和纯化。
SDS-PAGE电泳的原理
01
SDS-PAGE电泳基于电荷和分子量的差异，将蛋白质分离成不 同的条带。
02
在电场的作用下，SDS会包裹在蛋白质分子周围，使其带负电
VS
定量方法
可以采用标准品法、光密度扫描等方法进 行定量分析，以获得更准确的定量结果。
04
SDS-PAGE电泳的优化与注意 事项
优化实验条件
确定最佳的分离胶浓度
根据蛋白质的分子量范围选择合适的 分离胶浓度，以确保蛋白质的分辨率 和分离效果。
选择合适的浓缩胶浓度
浓缩胶的作用是使样品在进入分离胶 之前压缩成一道狭窄的带，选择合适 的浓度可以避免样品扩散。
分离效果
分离效果是指电泳后各蛋白质条带的分布情况，应尽量减少拖尾、模糊或重叠现象。
பைடு நூலகம்
蛋白分子量测定
标准蛋白对照
使用已知分子量的标准蛋白作为对照 ，通过比较标准蛋白与未知蛋白条带 的迁移率，计算出未知蛋白的分子量 。
精度要求
分子量测定结果应精确到小数点后一 位，并尽量减小误差。
定量分析
染色密度
通过比较各蛋白条带的染色密度，可以 大致了解各蛋白在样品中的相对含量。
荷，消除不同蛋白质分子间的电荷差异。
聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，通过分子筛效应，使蛋白质按
03
照大小进行分离。
SDS-PAGE电泳的应用
蛋白质纯度检测
通过SDS-PAGE电泳，可以观察到清晰的蛋白条带， 判断蛋白质是否纯净。
蛋白质分子量测定
SDS-PAGE-聚丙烯酰胺凝胶电泳详解ppt课件
精选2021版课件
2
SDS的作用
破坏蛋白质分子之间以及其他物质分 子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变 原有的构象，保证蛋白质分子与SDS充分结 合而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。
精选2021版课件
3
二、SDS-PAGE的基本原理
（一）蛋白质分子的解聚 样品介质和聚丙烯酰胺中加入离子
去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的 电泳迁移率主要取决于亚基分子量的 大小，而电荷因素可以被忽略。
连续电泳 不连续电泳
（3）根据电泳的形式
圆盘电泳 垂直电泳
平板电泳 水平电泳
精选2021版课件
27
精选2021版课件
28
精选2021版课件
29
精选2021版课件
30
2、操作 （1） 制备分离胶 （2） 制备积层胶(堆积胶）
精选2021版课件
31
精选2021版课件
32
精选2021版课件
33
下的反应： 蛋白质本身的电荷被屏蔽 氢键断裂 疏水相互作用被取消 多肽被去折叠(二级结构破坏),并形成椭球形
精选2021版课件
44
①还原SDS处理 当加入还原试剂DTT或β-二巯基乙醇后，
蛋白质被完全去折叠，只根据分子量分离。
精选2021版课件
45
②带有烷基化作用的还原SDS处理 烷基化作用可以很好地并经久牢固地保护
（3）长轴的长度则与亚基分子量的大 小成正比。
精选2021版课件
9
胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁 移率不再受蛋白质原有电荷的影响，
而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即 蛋白质或亚基分子量的大小。
当蛋白质的分子量在15KD— 200KD之间时，电泳迁移率与分子量 的对数呈线性关系
聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE
过氧化物酶染色原理
过氧化物酶能催化过氧化氢把联苯胺氧化 为蓝色或棕色产物
电泳装置
本实验采用不连续系统凝胶电泳，
整个电泳系统包括DYY型常压电泳
仪、夹心式垂直板电泳槽。
试剂
（1）1.5％琼脂 （3）分离胶缓冲液，pH8.9 (pH8.9 Tris-HCl缓冲液) （5）浓缩胶缓冲液，pH6.7 (pH6.7 Tris-HCl缓冲液) （2）核黄素溶液 （4）电极缓冲液，pH8.3 (pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液) （6）40％蔗糖溶液
实验4、聚丙烯酰胺凝胶电泳 分析过氧化物酶同工酶
同工酶
• 电泳 是指带电粒子在电场中向与其自
身带相反电荷的电极移动的现象。
带负电粒子
正极
带正电粒子
负极
影响电泳速度的外界因素
1.电场强度
电场强度也称电位梯度，是指单位长度 （每一厘米）支持物体上的电位降 一般，电场强度越高，带电颗粒移动速 度越快。 过高、过低均不宜 当需要增大电场强度以缩短电泳时间时， 需附有冷却装置
2．缓冲液的pH值和离子强度
pH 值距离其等电点愈远，其所带 净电荷量就越大，电泳的速度也 就越大
缓冲液通常要保持一定的离子强 度，一般所用离子强度为 0.020.2之间。
3.电渗现象
液体在电场中对于一个固体支 持物的相对移动，称为电渗现 象。
电渗方向影响泳动速率
4、温度的影响
温度每升高 1 ℃，迁移率约增加 2.4%。为降低热效应对电泳的影 响，可控制电压或电流，或在电 泳系统中安装冷却散热装置。
pH8.9
(a)
１、电荷效应：各种蛋白质按其所带电 荷的种类及数量，在电场向一定电极， 以一定速度泳动。
§4.3聚丙烯酰胺凝胶电泳
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以具有分离复 杂体系的功能是因为其设计上具有如下特点： 一、电泳系统多种不连续性 (1)凝胶浓度的不连续：凝胶在一个体系中被制成 不同浓度的浓缩胶和分离胶，导致凝胶孔径不同。 浓缩胶浓度低，属于大孔胶，电泳中蛋白质颗粒 泳动遇到的阻力小，移动速度快。浓缩胶只起浓 缩作用，无分子筛作用；分离胶浓度高，属于小 孔胶，蛋白质进入分离胶后遇到的阻力增大，移 动速度减慢，具有了分子筛效应。
§4. 3 聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为 支持介质用于生物大分子分析的常用电泳技术之一， 适用于低分子质量蛋白质、小于1kb DNA片段及 DNA序列分析等。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯 酰胺（CH2=CHCONH2 Acrylamide,Acr）和交联剂 N, N′-亚甲双丙烯酰胺〔CH2(NHCOHC=CH2)2 N,N′-methylenebisacryl -amide，Bis〕聚合而成。
分离DNA分子范围/bp 凝胶浓度T% C=3.3% 双链 1000～ 2000 80～500 单链 凝胶浓度T% C=3.3% 分离DNA分子范围 /bp 双链
3.5
750～2000
12.0
40～200
5.0
200～1000
15.0
25～150
8.0
64～400
50～400
20.0
6～100
②能把分子筛作用和电荷效应结合在同一方法中， 达到更高的灵敏度：10-9 ～10-12 mol L-1。③由于 聚丙烯酰胺凝胶是由－C－C－键结合的酰胺多聚 物，侧链只有不活泼的酰胺基－CO－NH2，没有 带电的其它离子基团，化学惰性好，电泳时不会 产生“电渗”。
实验7 聚丙烯酰胺凝胶电泳
实验7 聚丙烯酰胺凝胶电泳实验7 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理一聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE），由称盘状电泳。
这种电泳是在区带电泳的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性），使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带（厚度为10-2cm），然后再进行电泳分离。
圆盘电泳名称来源即由于此法的原理是依靠基质的不连续性（discontinuity），凑巧在垂直柱形凝胶上分散出的区带也很象圆盘状（discoid shape），取“不连续性”和“圆盘状”的英文字头“disc”。
因此英文名称为“disc electrophoresis”，中文直译为盘状电泳。
仪器装置：如图A所示，上下两个槽为圆形或方形，其中注入缓冲液（图中曲线表示缓冲液面）。
上下槽的缓冲液分别有正负电极通入。
下槽外壳在必要时可通入冷水促使降温，水流方向用箭头表示。
上槽底部有许多小孔，可插入装有聚丙烯酰胺的玻璃管。
图A在圆盘电泳过程中有三种物理效应：①样品的浓缩效应，②凝胶的分子筛效应，③一般电泳分离的电荷效应。
由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。
下面就圆盘电泳过程中的三种物理效应的原理加以说明：1. 样品的浓缩效应：由于电泳基质的4个不连续性，使样品在电泳开始时，得以浓缩，然后再被分离。
（1）凝胶层的不连续性：浓缩胶：为大孔凝胶，有防止对流的作用。
分离胶：为小孔凝胶，也有防止对流的作用。
样品在其中进行电泳和分子筛分离。
蛋白质在大孔凝胶中受到的阻力小，移动速度快。
进入小孔凝胶时遇到的阻力大，速度就减慢了。
由于凝胶的不连续性，在大孔胶与小孔胶的界面处就会使样品浓缩，区带变窄。
（2）缓冲离子成分的不连续性。
(3)电位梯度的不连续性。
(4)pH的不连续性：在浓缩胶和分离胶之间有pH的不连续性，浓缩胶应有的pH应为8.3，分离胶应有的pH为8.9。
聚丙烯酰胺凝胶电泳(共42张PPT)全
10% SDS
配制20ml不同浓度分离胶 所需各种试剂用量/ml
5% 7.5% 10% 15%
配制10ml浓缩 胶 所需试剂用量
3%
3.33 5.00 6.66 10.00
-
2.50 2.50 2.50 2.50
-
-
-
-
-
3.0
-
-
-
-
1.25
0.20 0.20 0.20 0.20
0.10
1%TEMED 重蒸馏水
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
概述
❖1967年由Shapiro建立。
❖1969年由Weber和Osborn进一步完善。
他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入 离子去污剂（SDS）以后,蛋白质亚基的电泳迁移 率主要取决于亚基分子量的大小,电荷因素可以忽 视。
基本原理
1.蛋白质分子的解聚
(1)SDS
（十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfate, SDS)
阴离子去污剂 变性剂
助溶性试剂
断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠
破坏蛋白质分子的二级和三级结构
❖ (2)强还原剂 巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）
使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，这样分离出的 谱带即为蛋白质亚基。
实验原理
浓缩效应：不连续性所致 制胶缓冲液：Tris-HCl （根据亚基分子量分离蛋白质） (3)二硫键是否完全被还原 与蛋白质的结合量：大多数1. (2)样品缓冲液的离子强度 混匀后，置真空干燥器中，抽气10min 圆盘电泳 不连续SDS-PAGE 1967年由Shapiro建立。 注入电极缓冲液 用 (3)二硫键是否完全被还原 选择适当的凝胶浓度。 （根据亚基分子量分离蛋白质） ＞100 糊状不成形，易破碎。
配制20ml不同浓度分离胶 所需各种试剂用量/ml
5% 7.5% 10% 15%
配制10ml浓缩 胶 所需试剂用量
3%
3.33 5.00 6.66 10.00
-
2.50 2.50 2.50 2.50
-
-
-
-
-
3.0
-
-
-
-
1.25
0.20 0.20 0.20 0.20
0.10
1%TEMED 重蒸馏水
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
概述
❖1967年由Shapiro建立。
❖1969年由Weber和Osborn进一步完善。
他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入 离子去污剂（SDS）以后,蛋白质亚基的电泳迁移 率主要取决于亚基分子量的大小,电荷因素可以忽 视。
基本原理
1.蛋白质分子的解聚
(1)SDS
（十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfate, SDS)
阴离子去污剂 变性剂
助溶性试剂
断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠
破坏蛋白质分子的二级和三级结构
❖ (2)强还原剂 巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）
使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，这样分离出的 谱带即为蛋白质亚基。
实验原理
浓缩效应：不连续性所致 制胶缓冲液：Tris-HCl （根据亚基分子量分离蛋白质） (3)二硫键是否完全被还原 与蛋白质的结合量：大多数1. (2)样品缓冲液的离子强度 混匀后，置真空干燥器中，抽气10min 圆盘电泳 不连续SDS-PAGE 1967年由Shapiro建立。 注入电极缓冲液 用 (3)二硫键是否完全被还原 选择适当的凝胶浓度。 （根据亚基分子量分离蛋白质） ＞100 糊状不成形，易破碎。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
（二）光聚合：核黄素-TEMED系统
核黄素（riboflavin）在光照下（可见光或 紫外光）分解，其黄素部分被还原成无色型， 但在有氧条件下无色型又被氧化成带有游离 基的黄素，其也能使Acr和Bis聚合形成凝胶。
注意：
分离胶的合成一般采用化学聚合。因为若用 光聚合，凝胶的孔径受光照强度与时间的影 响，导致孔径大小不同，从而影响蛋白质的 分离。
Acr + Bis----- 多孔三维网状结构
（1）丙烯酰胺结构式
（2）亚甲双丙烯酰胺
二、PAG 的 聚 合
需要催化剂——氧化还原系统作用，使 Acr单体带有游离基，从而与Bis进行聚合。
（一）化学聚合：AP-TEMED系统
过硫酸胺[(NH4)2S2O8]（Ammonium persulfate，AP）作为催化剂，四甲基乙二 胺（TEMED）为加速剂。
五、PAGE 的 特 点
1.具有分子筛效应，分辨率高 2.样品不易扩散，用量少，灵敏度可达10-6g 3.化学性质稳定，分子结构中富含酰胺基具 有稳定的亲水基团 4.凝胶不带电荷，消除了电渗现象 5.机械强度好，有弹性，在一定浓度范围内 无色透明 6.网孔可调节
小结
1.掌握（不连续）PAGE的原理 2.掌握影响PAGE迁移率的因素 3.掌握PAGE的操作注意点、试剂作用 4.熟悉PAG的聚合
按凝胶系统的均匀性分 连续PAGE 不连续PAGE
Disc-PAGE
电极槽缓冲液通常为pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液
成分
作用
样 T=3% C=20%单体 有防对流作用 品 欲分离的样品溶液 胶 pH6.7 Tris-HCl缓冲液
混在一起，用光聚合方 法聚合而成的大孔凝胶
Disc-PAGE
成分
pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液
低电导区
样品
样品胶 浓缩胶
分离胶
甘氨酸 蛋白质 HCl
3）pH值的不连续性
为了控制慢离子的解离度，从而控制其 有效迁移率，必须使浓缩胶与分离胶之间pH 值有所区别。
3.分子筛效应与电荷效应
进入分离胶后，Gly-成为快离子
分离胶只有电荷效应和分子筛效应，根 据各蛋白质所带电荷不同、分子大小不同而 分离
聚丙烯酰胺凝胶电泳 Polyacrylamide Gel Electrophoresis ，PAGE
Li Li
一、PAG 的 组成
PAG是由丙烯酰胺（acrylamide，Acr） 单体和N，N’-亚甲双丙烯酰胺（N，N，N’， N’-methylene bixacrylamide，Bis）交联剂 通过自由基聚合而成的一种多孔三维网状结 构。
作用
浓缩 除不加样品外，其余组 样品在此胶 胶 成成分同样品胶相同 中被浓缩
Disc-PAGE
成分
作用
分
T=7%C=2.5% 单 体 溶 主要的电泳
离液
分离部分
胶ห้องสมุดไป่ตู้
pH8.9 Tris-HCl 缓
冲液
化学聚合法聚合成小
孔胶
分离原理
1. 浓缩效应 1）凝胶层的不连续性
两层凝胶T与C不同孔径不同 浓缩胶孔径大，分离胶孔径小，蛋白质在大 孔径浓缩胶中移动，受阻力小，移动速度快。
2）缓冲液离子成分的不连续性
甘氨酸（pI=6.0）在pH8.3带负电，朝正极移 动，进入浓缩胶（pH6.7），甘氨酸解离度 （）很小，有效迁移率（M ）很低，移 动速度较慢，称为慢离子。
HCl 是强电解质，=1，Cl-有效迁移率大， 移动速度快，称快离子。
蛋白质（pI＜6.0）带负电荷，有效迁移率介 于两者之间。
思考题
名词解释 1.凝胶总浓度 2.凝胶交联度 问答题 1.与CAME相比，PAGE有哪些特点。 2.试比较CAME与PAGE操作的区别。 3.简述不连续PAGE的原理。
写在最后
经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量 Study Constantly, And You Will Know Everything. The More
AP在水溶液中能产生游离基SO42-，使丙烯酰 胺单体的双键打开，活化形成自由基丙烯 酰胺，然后游离Acr和Bis作用就能聚合形 成凝胶。
TEMED的游离碱基能促进AP的形成SO42- 。 注意：
TEMED量多少都会影响催化作用，须在碱 性条件下聚合
分子氧存在，聚合不完全，须去除分子 氧，隔绝氧
升高温度能提高聚合，降低温度能延迟 聚合
You Know, The More Powerful You Will Be
结束语
感谢聆听
不足之处请大家批评指导
Please Criticize And Guide The Shortcomings
讲师：XXXXXX XX年XX月XX日
T=（a+b）/m×100% T越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量
较小的物质。 T越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量
较大的物质。
C——Bis占单体与交联剂总量的百分比。 C=b/（a+b）×100% 当T固定时，Bis浓度在5%时孔径最小。
四、不 连 续 PAGE
按具体操作分 垂直板形电泳 圆盘电泳
三、PAG的浓度与孔径的关系
PAG孔径的大小主要由Acr和Bis这两种单 体的浓度决定。可以根据要分离物质分子的 大小，选择合适的单体浓度。 Acr/Bis：20~40 完全透明且有弹性；
＜10 很脆，易碎，不透明； ＞100 糊状不成形，易破碎。
凝胶总浓度T——100ml凝胶溶液中含有Acr和 Bis的总克数。