芹菜衔接蛋白基因AgMu2的克隆与表达分析

园艺学报2014，41（7）：1369–1378 http: // www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@ 芹菜衔接蛋白基因AgMu2的克隆与表达分析

王广龙，王枫，徐志胜，蒋倩，谭国飞，熊爱生*

（南京农业大学园艺学院，作物遗传与种质创新国家重点实验室，农业部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点

实验室，南京210095）

摘要：为研究芹菜（A pium graveolens）衔接蛋白（Adaptor protein）复合体AP-2中的μ2亚基的功能，以‘六合黄心芹’和‘美国西芹’为试验材料，采用RT-PCR方法获得AgMu2基因。序列分析表明：

AP-2复合体AgMu2基因全长1 317个核苷酸，编码438个氨基酸。推测其蛋白质分子量为49.30 kD，pI

为9.28。进化分析表明，来自‘美国西芹’的AgMu2亚基在植物间进化具有高度保守性，与葡萄Mu2

进化关系最为接近。空间结构分析表明，从芹菜中分离的AgMu2亚基由5个螺旋和26个延伸主链构成，

两个平行的β延伸主链构成的平面区域可能含有识别YXXΦ结构的位点。实时定量荧光PCR显示，芹菜

中AgMu2基因主要在叶中表达，具有明显的组织特异性，同时该基因可响应低温、高温、干旱和盐胁迫

等多种逆境信号，2个品种间该基因响应的时间和强度也具有显著的差异，显示了该基因功能的多样性。

关键词：芹菜；AP-2复合体；AgMu2基因；克隆；实时定量PCR；基因表达

中图分类号：S 636.3 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）07-1369-10

Cloning and Expression Profile Analysis of the AgMu2Gene of Adaptor Complex from Celery

WANG Guang-long，WANG Feng，XU Zhi-sheng，JIANG Qian，TAN Guo-fei，and XIONG Ai-sheng* （S tate Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement，M inistry of Agriculture Key Laboratory of Biology and Germplasm Enhancement of Horticultural Crops in East China，C ollege of Horticulture，N anjing Agricultural University，N anjing 210095，C hina）

Abstract：To investigate the functions of the μ2 subunit of adaptor protein complex from celery

（A pium graveolens），the gene AgMu2，encoding the μ subunit from AP-2 complex，was isolated from two celery cultivars‘Liuhe Huangxinqin’and‘Meiguo Xiqin’by RT-PCR method. Sequence analysis indicated that the length of AgMu2 gene was 1 317 bp，which encoded 438 amino acids. It is predicted that the molecular mass of its protein was 49.30 kD，and pI was 9.28. Amino acid sequence comparison showed that the A gMu2 from‘Meiguo Xiqin’existed high evolutionary conservation among different species，and

its evolutionary relationship was close to grape（Vitis vinifera）. Analysis on three-dimension structure implied that the subunit was composed with 5 helixes and 26 extended strands. The tyrosine based signal YXXΦ binded to a site on the surface of two parallel β-sheet strands. Quantitative real-time PCR analysis demonstrated that the AgMu2 g ene was tissue-specific and mainly expressed in leaf. Besides，this gene

收稿日期：2014–03–12；修回日期：2014–05–08

基金项目：国家自然科学基金项目（31272175）；教育部新世纪优秀人才支持计划项目（NCET-11-0670）；江苏省杰出青年基金项目（BK20130027）；江苏高校优势学科建设项目（2011PAPD）；江苏省双创计划项目（2011JSSC）

* 通信作者Author for correspondence（E-mail：Xiongaisheng@）

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may be involved into response to low temperature，high temperature，drought，salt stress and a variety of other adverse signals. Significant differences also existed in response time and intensity between the two cultivars，revealing the multiple functions of the subunit gene in celery.

Key words：celery；AP-2 complex；AgMu2gene；clone；quantitative real-time PCR；gene expression

衔接蛋白（Adaptor protein，AP）是指在细胞信号传递过程中，在蛋白质间起连接作用的一类

蛋白质，其在网格蛋白介导的内吞（Endocytosis）过程中发挥重要作用（Boehm & Bonifacino，2001）。哺乳动物中有两类衔接蛋白，第一类是AP复合体，包括AP-1、AP-2、AP-3、AP-4和最近才发现

的AP-5（Hirst et al.，2011），第二类是结构相对简单的蛋白因子，如GGAs（Boman et al.，2000；Hirst et al.，2009），stonins（Maritzen et al.，2010）等，目前研究较多的是AP-2复合体。研究证实，

每个AP-2复合体均为由2个大亚基（α和β2，约100 kD），1个中亚基（μ2，约50 kD）和1个小

亚基（σ2，约20 kD）组成的异源四聚体（Motley et al.，2006）。AP-2存在于质膜上，在网格蛋白

介导的质膜内吞过程中起货物分拣的作用（Jackson et al.，2010）。复合体中的α和β2大亚基主要

负责在囊泡膜周围与网格蛋白和其他辅助蛋白建立联系，形成网格蛋白笼，σ2主要负责AP-2复合

体结构的稳定，而中亚基μ2主要负责识别受体的YXXΦ结构（Y为酪氨酸；X可为任意氨基酸；

Φ为疏水性氨基酸）（Robinson & Bonifacino，2001）。有研究表明μ2亚基所在的AP-2复合体参

与多种生物进程，包括细胞生长发育、细胞信号传导以及应对外界环境的刺激等过程（Flynn，2001；Lacruz et al.，2013）。

与动物和人体中衔接蛋白的研究相比，植物中关于衔接蛋白及其各亚基的报道较少。先前的研

究表明细胞膨压并没有阻止植物细胞内吞的发生（Gradmann & Robinson，1989），这表明植物中也

可能存在与动物中类似功能的衔接蛋白。最近的研究发现，拟南芥中纤维素合成酶的内吞过程有μ2

亚基的参与（Bashline et al.，2013）。Yamaoka等（2013）研究发现AP-2中的μ2亚基还可能参与

拟南芥花器官的发育等过程，Kim等（2013）也得到了类似的结论，并认为μ2亚基可能对拟南芥

雄性生殖器官发育有着重要的作用。目前，植物中对衔接蛋白功能研究主要局限在拟南芥中

（Bashline et al.，2013；Kansup et al.，2013；Kim et al.，2013；Yamaoka et al.，2013），在其他植

物中还鲜见关于衔接蛋白组成、结构及其各亚基功能的相关报道。

本试验中以芹菜（A pium graveolens）品种‘六合黄心芹’和‘美国西芹’为研究材料，克隆获

得芹菜衔接蛋白AP-2的μ2亚基基因AgMu2，并对该基因进行了较为详尽的序列分析，利用实时定

量PCR技术对其在不同组织和逆境条件下的表达进行了研究，以期为进一步深入研究、发掘和验证

芹菜及其他植物μ2亚基和衔接蛋白功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料、菌种与质粒

供试芹菜品种为‘六合黄心芹’和‘美国西芹’，种植于南京农业大学作物遗传与种质创新国

家重点实验室人工气候室。取3月龄的植株分别进行逆境处理（包括38 ℃高温、4 ℃低温、20% PEG

干旱和20% NaCl盐处理），每个处理6株，处理时间分别为1、2、4、8和24 h时，取植株顶部第

3 ~ 4片叶，以同时期未经任何逆境处理的植株作为对照，同时取对照植株中叶柄、根材料，用于

RNA的提取以及cDNA的合成。大肠杆菌菌株为本实验室保存；质粒载体pMD18-T、聚合酶E x Taq、DNA回收试剂盒、DL2000 marker、反转录试剂盒、荧光定量染料SYBR Premix Ex Taq kit购自大连TaKaRa公司，总RNA提取试剂盒购于天根生化科技有限公司（北京）。