荧光定量PCR实验数据分析

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荧光定量pcr结果分析

如果有标准曲线,按照标准曲线计算。

一般都就是相对量。

则用deltaｄｅlｔａCT方法来计算。

举例如下:ﻫ对照组基因A得CT值为２０, 内参(比如βactiｎ)CT值15。

实验组基因A CＴ值１８,内参CＴ值１4。

ﻫ首先算加样量:ｄｅlｔa ＣT＝15-14=1。

２得1次方就是２、也就就是说实验组得加样量就是对照组得2倍、ﻫ基因A: ｄeｌｔａＣT＝2０—1８=2。

2得2次方就是４、也就就是说基因A得量在实验组就是对照组得4倍。

但就是由于加样量就是2倍,所以４处以2＝2,最后得相对量就是2倍、
ﻫ几点注意:ﻫ１。

必须确定扩增得特异性
２、只有相同目标得CT值才能相减(扩增效率有可能不同)
3。

2得某次方只就是理论值,实际扩增效率低于２、ﻫ4。

最好不用Syber Green
由Cｔ值用2＾—△△Ｃｔ法计算计算表达量差异得原理,可以瞧下面得图片:
ﻫ
ﻫ附件得Exｃel文件就是计算用得,感兴趣也可以瞧瞧由Ct值就是如何一步一步算出2^-△△Ct 得。

荧光定量PCR实验数据分析

荧光定量PCR实验数据分析荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction）是一种基于PCR技术的实验方法，用于定量检测特定DNA序列的丰度。

荧光定量PCR是一种非常重要的分子生物学技术，在基因表达分析、疾病诊断等领域得到广泛应用。

在进行荧光定量PCR实验后，需要对实验数据进行分析，以获取样品中目标DNA序列的丰度信息。

本文将介绍荧光定量PCR实验数据分析的基本步骤和常见方法。

首先，荧光定量PCR数据的分析通常包括以下几个步骤：1.荧光PCR数据的获取：荧光定量PCR实验过程中，荧光信号会被记录下来。

对于每个样品，会获得一条荧光曲线，曲线上的荧光信号强度与PCR循环次数（Ct值）有关。

2. 荧光曲线的阈值设置：荧光曲线上的信号强度在实验的早期循环中较低，随着PCR循环的进行逐渐增加，直至达到一个稳定的平台。

阈值（threshold）是在这个平台上设置的一个信号强度的固定值，用于确定Ct值。

常用的阈值设置方法包括固定阈值法和导数阈值法。

3.Ct值的计算：Ct值是荧光定量PCR实验中的一个重要指标，表示荧光信号达到阈值的循环次数。

在荧光曲线上，Ct值可以通过与阈值的交点来确定。

Ct值越小，表示目标DNA序列的丰度越高。

4.样品之间的Ct值比较：荧光定量PCR实验中，通常需要同时检测一些内部参考基因（如GAPDH）作为对照，以便进行样品之间的Ct值比较。

内部参考基因应在不同样品中表达稳定，其Ct值应接近。

通过对目标基因的Ct值与内部参考基因的Ct值进行比较，可以计算出样品中目标DNA序列的相对丰度。

5.目标DNA序列的绝对丰度计算：通过构建标准曲线，可以将目标DNA序列的相对丰度转化为绝对丰度。

标准曲线是通过在实验中使用一系列已知浓度的目标DNA序列标准品进行绘制的。

通过测量标准品的Ct值并绘制荧光信号与目标DNA序列浓度的关系曲线，可以通过比较样品的Ct值与标准曲线来计算目标DNA序列的绝对丰度。

荧光定量PCR技术原理与结果分析

荧光定量PCR技术原理与结果分析一、荧光定量PCR技术原理1.基本原理荧光定量PCR技术基于传统的PCR技术，其中关键的步骤是DNA的扩增。

PCR过程中，DNA模板会通过聚合酶链式反应在多个循环中进行指数级扩增。

在扩增过程中，每一个循环都包括三个主要步骤：变性，引物结合和扩增。

2.荧光标记3.荧光信号检测与分析在PCR反应的扩增过程中，荧光强度会随着PCR产物的扩增而增加。

荧光信号的强度与扩增目标DNA的数量成正比。

因此，通过测量PCR反应中发出的荧光信号的强度，可以确定目标DNA的起始数量。

二、荧光定量PCR技术结果分析1.标准曲线2.反应效率反应效率是PCR扩增的关键因素之一、反应效率是通过标准曲线的斜率来表示的，斜率越接近1，表示反应效率越高。

较低的PCR反应效率可能是由于试剂的浓度不足、PCR条件不合适或者目标DNA的起始浓度低。

3.CT值CT值是PCR反应过程中，荧光信号由背景噪声中分离出来的阈值周期数。

在荧光定量PCR实验中，CT值用于计算目标DNA的起始浓度。

CT值越小，表示目标DNA的起始数量越多。

4.荧光指数荧光指数是指测量PCR反应中特定周期（一般为指定阈值之后的周期）的荧光信号的增加量。

荧光指数也可以用来评估PCR的效果和目标DNA的起始数量。

荧光指数越高，表示目标DNA的起始数量越多。

5.目标基因的相对表达量总结起来就是，荧光定量PCR技术通过引入荧光标记的引物和探针，在PCR反应中实时监测荧光信号的强度变化来定量分析目标DNA的起始数量。

通过制备标准曲线、测量CT值和荧光指数，可以对PCR反应的效果和目标DNA的表达量进行定量分析。

此外，荧光定量PCR还可以用于研究目标基因的相对表达量。

荧光定量PCR数据分析

利用实时定量PCR和2－△△CT法分析基因相对表达量METHODS 25, 402–408 (2001)Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitati ve PCR and the 2－△△CT MethodKenneth J. Livak* and Thomas D. Schmittgen¶,1*Applied Biosystems, Foster City, California 94404; and ¶ Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy,Washington State University, Pullman, Washington 99164-6534摘要：现在最常用的两种分析实时定量PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。

绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。

2－△△CT方法是实时定量P CR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法，即相对定量的一种简便方法。

本文介绍了该方法的推导，假设及其应用。

另外，在本文中我们还介绍了两种2－△△CT衍生方法的推导和应用，它们在实时定量 PCR 数据分析中可能会被用到。

关键词：反转录PCR 定量PCR 相对定量实时PCR Taqman反转录 PCR （RT-PCR ）是基因表达定量非常有用的一种方法（1 - 3 ）。

实时PCR 技术和RT-PCR 的结合产生了反转录定量 PCR 技术（4 ,5 ）。

实时定量PCR 的数据分析方法有两种：绝对定量和相对定量。

绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数；相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。

实时荧光定量PCR的数据分析方法

实时荧光定量PCR的数据分析方法
作者：易健明，屈武斌，张成岗， YI Jian-Ming， QU Wu-Bin， ZHANG Cheng-Gang
作者单位：易健明,张成岗,YI Jian-Ming,ZHANG Cheng-Gang(军事医学科学院放射与辐射医学研究所,蛋白质组学国家重点实验室,全军军事认知与心理卫生研究中心,北京100850;安徽医科大学研究生院,安徽合肥230032)
，屈武斌,QU Wu-Bin(军事医学科学院放射与辐射医学研究所,蛋白质组学国家重点实验室,全军军事认知
与心理卫生研究中心,北京100850)
刊名：
生物技术通讯
英文刊名：Letters in Biotechnology
年，卷(期)：2015,26(1)
引用本文格式：易健明.屈武斌.张成岗.YI Jian-Ming.QU Wu-Bin.ZHANG Cheng-Gang实时荧光定量PCR的数据分析方法[期刊论文]-生物技术通讯 2015(1)。

实时荧光定量PCR检测的数据处理及结果报告

A
25
为什么要做定性测定？
用于未知患者的确认用于血液筛检突变检测
A
26
定量和定性测定的结果报告
定量测定测定的是量的“多”或“少”；定性测定则是测定某种物质的“有”或“无”，用于未知病人的确认诊断。
定量测定结果报告：根据所使用的测定方法的测定范围报告结果，如样本测定结果高出此范围，则可报告 >多少，也可对样本稀释后再检测；如低于此范围，则报告<多少，如<103拷贝数/ml，而不能报告为0拷贝数/ml或阴性。
1/log2=-3.32
如果扩增效率为0.5（100%），则斜率A =1/log1.5=-5.68
A
21
纵坐标为Ct值横坐标为起始拷贝数时的数学模型
此种计算模式下，斜率 A必≤-3.32。
截距B则为原始模板趋向于0亦阴性标本检测的 Ct 值，因此，一个实时荧光PCR，如果设定的扩增循环数为40，则其截距B即应≥40。
A
12
实时荧光PCR外标绝对定量的数学模型
在实时荧光PCR 中，每个模板的 Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多， Ct值越小。
A
13
实时荧光PCR外标绝对定量的数学模型
利用已知起始拷贝数的外部标准品可做出标准曲线，在现有实时荧光PCR 中，大部分以纵坐标为Ct值，横坐标为起始拷贝数，少部分以纵坐标为起始拷贝数，横坐标为Ct值。
A
5
基本概念
Ct值（threshold cycle）或CP值（crossing point） Ct或CP值指的是实时监测扩增过程的荧光信号达到指数扩增时的循环周期数。主要的计算方式是以扩增过程前3到15个循环的荧光值的10倍标准差为阈值，当荧光值超过阈值时的循环数则为阈值循环数（Ct）。有实验证明Ct值与样本中的原始拷贝数成正比关系。Ct 值是当前实时荧光PCR的主要定量参数。

实时荧光定量PCR数据分析及常见问题分析

每个步骤都应遵循严格的规范，避免交叉污染、样品混淆等误差，确保实验结果的准确性和可靠性。
使用高质量的试剂和仪器
高质量的试剂和仪器是实时荧光定量PCR实验的基础，包括高质量的DNA聚合酶、高灵敏度的荧光探针、可靠的定量 PCR仪等。
选择经过认证的试剂和仪器，并按照说明书正确使用和维护，可以确保实验结果的准确性和可靠性。
优化PCR反应条件
优化PCR反应条件可以显著提高实验的重复性和准确性，包括调整模板浓度、引物浓度、循环数等参数。
通过梯度PCR或条件优化实验，可以找到最佳的反应条件，使扩增曲线更符合标准曲线的要求。
严格控制实验操作规范
实验操作规范是保证实时荧光定量PCR数据质量的重要环节，包括实验前的准备、样本处理、加样、扩增和检测等步骤。
基线漂移
01
总结词
基线漂移是指PCR扩增曲线在起始阶段出现非特异性扩增，导致背景信
号过高。
02
详细描述
基线漂移可能是由于模板污染、酶活性降低或反应条件不适等原因引起
的。高背景信号会掩盖特异性扩增信号，导致检测结果不准确。
03
解决方案
在实验过程中，要严格控制操作环境，避免交叉污染。同时，要定期检
查酶活性，确保其处于最佳状态。此外，可以通过软件对扩增曲线进行
03 实时荧光定量PCR常见问题分析
扩增效率不一致
总结词
扩增效率不一致会导致数据无法准确反映样本中目标基因的表达水平。
详细描述
扩增效率不一致通常是由于反应条件、引物设计或试剂质量等问题导致的。这会导致不同样本间的相对表达量出现偏差，从而影响实验结果的准确性。
解决方案
在实验过程中，要确保反应条件的一致性，包括温度、时间、循环数等。同时，要选择质量可靠、设计合理的引物和试剂，并进行预实验以确定最佳的反应条件。

荧光定量PCR实验及数据分析

14
常用荧光定量标记方法
• 非特异性荧光标记 • SYBR Green I
• 特异性荧光标记 • TaqMan Probe

15
SYBR Green I 染料法－－原理
• SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。
SYBR Green I
12
荧光定量PCR原理－－荧光定量反应性的确认
• 线性关系、扩增效率确认
– 相关系数（R2）：大于0.98 – 标准曲线斜率：-3 － -3.5 – PCR扩增效率（E）：0.9-1.2
• 检测灵敏度确认
– 35Cycles内可得到好的定量结果 – 如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增

34
绝对定量质粒标准品的制备
目的基因
基因组DNA PCR
目的基因
目的基因克隆
目的基因目的基因
质粒
质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用
35
质粒标准品稀释方法与拷贝数计算
• 倍比梯度稀释方法：
– 1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii – 1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii – 1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv – 1v标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v
22
Taqman 探针法－－工作机理
探针
热变性
引物
报告基团
R
淬灭基团
引物和探针与模板退火
DNA聚合酶
R
探针
延伸反应
R
R

23
Taqman 探针法－－PCR体系的建立

实时荧光定量PCR检测的数据处理及结果报告

基本计算公式的推导

如果扩增效率为100%，亦即E=1，扩增反应管中原始拷贝数为10，扩增产物达到 1 1000分子拷贝，则预计的Ct = log（Log 2 1 1000 -Log 10）= log 2 ×2 = 6.64。因此，如果已知原始模板拷贝数为1，扩增产物达 1000分子拷贝时，其Ct <6.64较多，则说明扩增效threshold cycle）或CP值（crossing point） Ct或CP值指的是实时监测扩增过程的荧光信号达到指数扩增时的循环周期数。主要的计算方式是以扩增过程前3到15个循环的荧光值的10倍标准差为阈值，当荧光值超过阈值时的循环数则为阈值循环数（Ct）。有实验证明Ct值与样本中的原始拷贝数成正比关系。Ct 值是当前实时荧光PCR的主要定量参数。
纵坐标为起始拷贝数对数值横坐标为Ct值时的数学模型

重新重理（4）式 Log YCt = LogX +Ct×Log ( 1+E ) 可得： LogX = -Ct×Log ( 1+E ) + Log YCt (5)
纵坐标为起始拷贝数对数值横坐标为Ct值时的数学模型

根据Y= AX+B，（5）式中的Y = LogX，X = Ct，A = -Log ( 1+E )，B = Log YCt 从A = -Log ( 1+E )中，可计算PCR反应的扩增效率E = 10-A-1 （6）如果 A = -0.301，代入（6）式可得：E = 1，即扩增效率为100%。如果 A = -0.201，代入（6）式可得：E = 0.589，即扩增效率为58.9%。这样可以判断是否需要优化反应条件。此时，斜率A 必≥-0.301。截距B = Log YCt ，其与阈值线的选定直接相关，应为Ct值趋向于0时的原始模板拷贝数的对数值。

荧光定量PCR实验报告

荧光定量PCR实验报告一、实验目的1、掌握荧光定量PCR技术2、学习如何制备PCR反应体系3、了解实时荧光PCR数据分析4、检测DNA含量二、实验原理荧光定量PCR技术是一种基于PCR扩增原理的DNA分析方法，可定量检测DNA的含量，广泛应用于生物学、医学等领域。

该技术主要依靠荧光标记物，结合荧光信号强度进行定量分析。

PCR反应过程中，引物与模板DNA结合后在酶的催化下形成新的DNA链，每个PCR循环会翻倍模板量。

PCR扩增的温度曲线显示，PCR反应初期呈指数上升阶段，后期呈平台期，最后呈线性上升期。

荧光定量PCR技术基于PCR反应的初期、指数上升阶段的振幅与CT值（Crossing Threshold，荧光信号的阈值值点）之间的关系，对样品中靶序列的含量进行定量分析。

三、实验步骤以10μL体积计算，将荧光定量PCR反应体系制备如下表：试剂名称一次浓度最终浓度10μL体积SYBR Green 1x 1x 1μLdNTPs 10mM 0.2mM 0.2μLMgCl2 25mM 3mM 0.3μLTaq DNA Polymerase 5u/μL 0.04u/μL 0.04μLForward Primer - 0.2μM 0.2μLReverse Primer - 0.2μM 0.2μLTemplate DNA - 1ng-100ng 1μLddH2O - - 7.24μL2、装载PCR板将PCR反应体系均匀装到PCR板中，按照如下步骤进行：① 每组实验会使用96孔PCR板；② 取出PCR板后，先用蒸馏水清洗；③ 按照实验设计，合理地将合适的试剂组合均匀装出到每个孔中；④ 采用专用移液器，能够准确的移液。

3、进行PCR扩增反应在PCR扩增反应期间，我们将执行以下操作：② 进行荧光定量PCR反应；③ 在PCR反应过程中，分别记录下样品的CT值和所测基因的拷贝数；4、数据分析① 利用荧光定量PCR仪进行CT值分析，记录下每个样品的CT值；② 利用以下公式，将CT值成功转化成所测基因的拷贝数：DNA含量（ng）=拷贝数 X DNA分子量/ 6.02 X 10^23;③ 分别计算出每个样品的DNA含量；④ 利用所得数据，绘制出荧光定量PCR的结果图，并进行结果的解释。

荧光定量pcr实验原理及数据分析

阈值设定
确定荧光信号与背景噪声的界限，用于计算Ct值。
标准化处理
消除实验间的差异，使数据具有可比性。
荧光定量PCR数据质量控制
01Biblioteka 0203重复性检验
检查同一样本不同孔之间的Ct值差异，确保实验可重复性。
扩增效率评估
通过标准曲线计算扩增效率，确保实验的准确性。
熔解曲线分析
检查产物的特异性，避免非特异性扩增对结果的影响。
荧光定量PCR技术特点
高灵敏度、高特异性、宽线性范围、可重复性好等。
荧光定量PCR技术分类
根据荧光标记物的不同，可分为探针法和染料法两大类。探针法包括TaqMan探针法、分子信标法等；染料法包括 SYBR Green I染料法等。
02
荧光定量PCR实验原理
PCR技术基本原理
DNA聚合酶作用
PCR技术利用DNA聚合酶的酶促反应，以单链DNA为模板，合成与之互补的双链DNA。
多重荧光定量PCR技术的完善与应用
未来将继续优化多重荧光定量PCR技术，提高检测的准确性和通量，并拓展其在临床诊断和个性化医疗等领域的应用。
与其他技术的融合与创新
荧光定量PCR技术可以与其他技术如质谱技术、蛋白质组学技术等相结合，实现多组学数据的整合分析，为生物医学研究提供更全面的信息。
THANKS
酶浓度
酶的浓度直接影响扩增效率，需根据实验需求进行优化。
dNTP浓度
dNTP浓度过高会导致非特异性扩增，过低则会影响扩增效率，需进行优化。
反应体积
反应体积的大小会影响扩增效率和荧光信号的检测，需根据实验需求进行调整。
05
荧光定量PCR技术在生物医学研究中的应用

荧光定量PCR实验及数据分析

荧光定量PCR实验及数据分析一、概述荧光定量PCR（Quantitative Realtime PCR，简称qPCR）是一种结合了PCR技术的高灵敏度和荧光探针技术的实时定量特性的分子生物学分析方法。

该方法通过实时监测PCR反应过程中荧光信号的变化，对模板DNA或RNA的初始浓度进行定量分析。

荧光定量PCR技术在基因表达研究、病原体检测、基因突变分析以及药物疗效评估等领域具有广泛的应用价值。

在荧光定量PCR实验中，通常使用特异性引物和荧光探针来识别并扩增目标序列。

荧光探针的设计是关键步骤之一，它必须能够与目标序列特异性结合并在PCR过程中产生可检测的荧光信号。

实验过程中还需严格控制反应条件，包括温度、时间、引物和探针的浓度等，以确保实验的准确性和可重复性。

数据分析是荧光定量PCR实验不可或缺的一部分。

通过对实验数据的收集、整理和分析，可以获取目标序列的初始浓度信息，进而对实验结果进行解读和评估。

数据分析方法包括相对定量和绝对定量两种，前者通过比较不同样本间目标序列的相对表达量来评估差异，后者则通过标准曲线法或质粒拷贝数法等方法来确定目标序列的绝对浓度。

荧光定量PCR技术是一种高效、灵敏且特异的分子生物学分析方法，对于研究基因表达、病原体检测等领域具有重要意义。

通过不断优化实验操作和数据分析方法，可以进一步提高荧光定量PCR实验的准确性和可靠性，为科学研究和临床实践提供有力支持。

1. 荧光定量PCR技术的概述荧光定量PCR技术，是一种基于DNA聚合酶链式反应的分子生物学技术，它通过引入荧光标记，实时监测PCR过程中目标DNA片段的扩增情况，从而实现对特定基因拷贝数的精确量化。

该技术结合了PCR的高效扩增能力与荧光信号的灵敏检测，使得微量DNA分子的检测成为可能，并在遗传学、分子生物学、医学诊断等领域中发挥着重要作用。

荧光定量PCR技术主要依赖于特异性引物和探针的设计，使得PCR扩增过程具有高度的特异性。

Real-time PCR数据分析

由于Real-time qPCR 的众多优点，现在已是生命科学领域的一项常规技术。

越来越多的研究文章中涉及RT-PCR 的实验，也基本上被real-time qPCR 所代替。

由于real-time aPCR 输出的数据不同于常规的PCR 电泳检测，不少没有做过real-time qPCR 的研究者往往感到高深莫测，不知从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。

本文就从real-time qPCR 的发展史说起，包括real-time qPCR 的原理，实验设计，实际操作，数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解real-time qPCR，彻底的从菜鸟到高手！一、Real-time qPCR 发展史Real-time qPCR 就是在PCR 扩增过程中，通过荧光信号，对PCR 进程进行实时检测。

由于在PCR 扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。

由于常规的PCR 的缺点，real-time qPCR 由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。

现在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP 检测，等位基因的检测，药物开辟，临床诊断，转基因研究等。

在Real-time qPCR 技术的发展过程中，定量PCR 仪的发展起了至关重要的作用。

1995 年，美国PE 公司(已经并入Invitrogen 公司)成功研制了Taqman 技术，1996 年推出了首台荧光定量PCR 检测系统，通过检测每一个循环的荧光强度，通过Ct 值进行数据分析。

从而荧光定量PCR 获得广泛应用。

现在的定量PCR 仪有ABI7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、PRISM@StepOneTM 系列；BIO-RAD 的CFX96、iCycler iQ5@、MyiQ@、MJ Research Chromo4TM Opticon 系列；Stratagene MxTM 系列；Roche LightCycler@ 系列；Eppendorf Masercycler@；Corbett Rotor-GeneTM；Cepheid SmartCycler@和BIOER 的LineGene 系列。

实时荧光定量PCR试验结果分析

实时荧光定量 PCR实验结果
分析
邓椋爻技术支持广州市昊洋贸易有限公司
? 定量分析 ?绝对定量 ?相对定量
定量PCR 应用
? 定性分析 ?SNP分析，基因扫描 ?阴阳性判定 ?熔解曲线分析
绝对定量与相对定量
绝对定量：How Many –优点：给出目标基因初始模板的绝对数量，数据容易处理 –缺点：必须有标准品，做标准曲线
? 选用GAPDH作为内标基因－FAM标记的ERBB2探针－VIC标记的GAPDH探针
? 标准品（质粒）构造标准曲线 ? 多重PCR反应 ? 阴性对照
－无RNA对照（空白）－无逆转录酶对照（监控基因组污染）
RNA 定性及定量分析
正常乳腺组织 RNA
Intact
5 hr. at 90°C
乳癌组织 RNA
△ C（t）GOI- △ C（t）ref= △C（t） △ C（t）sample- △ C（t）calibrator = △ △C（t）
?好处：不做标准曲线
?应用范围：扩增效率较高，目标基因和内标基因扩增效率一
致并且相互独立扩增；不做标准曲线，高通量检测（芯片评估）；不要求很高的精度
应用实例-基因表达分析
结果分析-扩增曲线
PMT1-FAM detection- ERBB2
104 102
绝对定量
108 106
104 102
T
绝对定量
绝对定量
108 106
104 102
T
绝对定量
105 copies/well
相对定量
1/3 1/3 1/3 1/3
Blank
10.0 ng/2ul
1.11 ng/2ul
0.12 ng/2ul

荧光定量PCR实验及数据分析

荧光定量PCR实验及数据分析荧光定量PCR（Fluorescence Quantitative PCR，qPCR）是一种常用于检测和定量分析DNA或RNA浓度的技术。

该技术利用荧光探针与靶分子结合产生荧光信号，通过荧光信号的强度可以确定靶分子的数量。

本文将介绍荧光定量PCR实验及数据分析过程。

实验步骤：1.样品制备：根据研究需要选择DNA或RNA样品，提取并纯化目标DNA或RNA，并将其浓度测定。

2.酶切反应：如果需要对目标DNA或RNA进行酶切，可在此步骤中将其酶切为较小的片段。

3.扩增反应体系的准备：根据实验设计和厂家提供的建议，配置扩增反应所需的试剂。

4.PCR扩增：将目标DNA或RNA与引物和荧光探针一起添加到PCR反应管中，并进行PCR扩增。

根据实验设计，设置反应的温度梯度和时间。

5.实时荧光检测：在PCR扩增的过程中，使用实时PCR仪不断监测PCR反应管中的荧光信号，记录其强度变化。

6.构建标准曲线：选取一系列已知浓度的标准样品进行PCR扩增，并记录每个标准样品的荧光信号强度。

根据标准曲线绘制荧光信号强度和目标分子浓度的对应关系。

7.分析样品数据：将样品的荧光信号强度与标准曲线进行比较，可以计算样品中目标分子的浓度。

根据实验目的，可以对样品数据进行统计分析，如计算平均值、标准差等。

数据分析：1.标准曲线分析：使用标准曲线中的已知浓度和相应的荧光信号强度，通过拟合曲线或插值方法，可以计算出待测样品中目标分子的浓度。

2.相对定量分析：若需要比较不同样品之间目标分子的相对表达水平，可选取一个内参基因作为参照，通过计算目标分子基因和内参基因相对表达量的比值，进行比较分析。

3.统计分析：根据实验设计和样品数量，可以使用合适的统计方法对数据进行分析。

常见的统计方法包括t检验、方差分析等。

总结：荧光定量PCR技术在生物学研究中具有重要的应用价值，能够快速、准确地定量测定DNA或RNA的浓度。

在进行实验时，需要注意实验步骤的正确操作，并合理选择实验设计和数据分析方法，以确保结果的可靠性和准确性。

荧光定量PCR数据分析

由于系统误差的原因，不同的样品很难获得相同量的RNA，这时就有必要引入管家基因来对所有样品进行归一化处理(RNA量校正)，然后再对不同样品之间的目的基因表达量进行比较。
该技术适用于大多数基因表达研究，可分析对照 (正常) 样本和一个或多个实验样本中目的基因表达水平的上调或下调。
采用该技术无需精确测定拷贝数，而是关注与对照样本相比的倍数变化；
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标准品
目的：生成标准曲线，建立Ct值与浓度之间的线性关系要求：
浓度已知；5点以上；标准品与待测样品的PCR效率一致，且接近100% 仪器质量一致试剂质量一致：模板浓度、引物和探针的Tm值、酶活性、缓冲液成分；反应条件一致：循环参数相同、同一次实验；
不要求：标准品与目标基因使用相同的DNA；
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标准曲线生成
采用绝对标准曲线分析法，目的靶点的拷贝数必须已知。一般一条标准曲线取四到五个点，浓度范围要能覆盖样品的浓度区间，以保证定量的准确性。一般一个点重复三至五次，对于常期稳定使用的标准品可以适当减少重复的次数。生成的标准曲线与每个特定的Ct的拷贝数相关。然后通过与该标准曲线进行比较，推算出未知样本的拷贝数。定量的准确度与标准曲线的质量直接相关
目的基因、管家基因分别作标准曲线，然后从各自的标准曲线上求出初始模板量，经管家基因均一化处理后，求出目的基因的相对含量。
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双标准曲线法
运用RT-PCR数据分析软件
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软件介绍
主要特点：
简易的操作界面流程化的数据分析强大的数据质控检验很高的数据挖掘能力多样的数据分析结果
需要）。
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实时荧光定量PCR数据分析及常见问题分析

是否可以调整引物和模板的比例？
• YES。 • 低引物浓度会导致高Ct值（灵敏度低）。 • 所以对于低浓度的样本，反应体系中引物的浓度却不能太
低。
二、常见问题分析
如何判断他们是否存在扩增？
• 首先看对数图谱，和同一反应中的其它曲线相比，这些曲线的形状不相同。
二、常见问题分析
如何判断他们是否存在扩增？
二、常见问题分析
3、重复性
1个样本4个复孔重复性好
二、常见问题分析
3、重复性
1个样本4个复孔重复性差
二、常见问题分析
造成重复性差的原因
• 基线、阈值的设置 • 加样误差（操作？移液器？） • 没有将试剂和样本充分混匀 • 低拷贝的样本→泊松分布 • 没有使用ROX校准（ABI7500）
二、常见问题分析
3）NaOH处理。
含干有扰铁DN，A合释成放。铁离子至PCR混合物，同上
与单链DNA相互作用
同上
与DNA、RNA结合，后续的提取过
程中不能被去除；
加BSA，结合亚铁血红素
抑制聚合酶活性。
二、常见问题分析
检查样本质量
• 用分光光度计测量样本260/280比值 • DNA纯度：OD260/OD280=1.8 • RNA纯度：OD260/OD280=2.0
比荧光，或者ROX添加浓度不适合，请将ROX校准关闭（None）。
二、常见问题分析
4、“可疑的” 扩增曲线（以ABI7500为例）
• 由于PCR扩增形成的真正的扩增曲线通常很容易确认。 • 有特征的形状：首先有背景信号（基线期），然后是三个
增长阶段（指数增长期、线性增长期线性图谱，可以看到曲线有一定的上升。
• 同时这些曲线没有明显的指数增长期。

荧光定量PCR实验原理及数据分析1

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绝对定量的定义
Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量
Sample
2 5

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绝对定量分析几要素
• • 一个目的基因 ——即需要确定其量值的核酸序列。一组标准样本 ——用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、 PCR产物、基因组DNA等。 • 重复反应孔 –——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性。 • • 标记方法的选择 ——SYBR Green I 法或Taqman 探针法均可。实验结果显示 ——扩增曲线；标准曲线；融解曲线(探针法不需要)。
荧光定量PCR实验原理及数据分析
Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Marketing Dep. 冯彩宁
内容概要

荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法荧光定量PCR解析方法荧光定量实验流程及注意事项生工荧光定量产品选择指南

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SYBR Green I 染料法－－优缺点优点
使用方便，不必设计复杂探针具有价格优势
缺点
无模板特异性对引物特异性要求较高不能进行多重定量灵敏度相对较低

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Taqman 探针法－－原理
• • • •
纵轴：荧光信号量横轴：PCR反映循环数
Ct值的特点： • 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； • Ct值极具重现性
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荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理
n
理想的PCR反应
n：扩增循环数

荧光定量pcr结果分析

如果有标准曲线，按照标准曲线计算。

一般都是相对量。

则用delta delta CT方法来计算。

举例如下：
对照组基因A的CT值为20，内参（比如βactin)CT值15。

实验组基因A CT值18，内参CT值14。

首先算加样量：delta CT=15-14=1。

2的1次方是2。

也就是说实验组的加样量是对照组的2倍。

基因A: delta CT=20-18=2。

2的2次方是4。

也就是说基因A的量在实验组是对照组的4倍。

但是由于加样量是2倍，所以4处以2=2，最后的相对量是2倍。

几点注意：
1。

必须确定扩增的特异性
2。

只有相同目标的CT值才能相减（扩增效率有可能不同）
3。

2的某次方只是理论值，实际扩增效率低于2。

4。

最好不用Syber Green
由Ct值用2^-△△Ct法计算计算表达量差异的原理，可以看下面的图片：
附件的Excel文件是计算用的，感兴趣也可以看看由Ct值是如何一步一步算出2^-△△Ct的。

温馨提示：最好仔细阅读后才下载使用，万分感谢！。