荧光定量PCR实验数据分析
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21
原始多通道荧光信号-v2.0
22
质控报告-V2.0
23
理想的实验结果
可疑的扩增曲线
案例1:是否存在扩增？ • 一些形状和正常的扩增曲线有区别的曲线，该如何判断呢？
正常的扩增曲线
平台期很低
25
如何判断它们是真正的扩增？ • 这些曲线都有典型的指数增长期，而且和其他的曲线平行（虽
然比较短）。
10
绝对定量实验效果的评估
11
CT值差与模板量差的关系
CT = k lg X0 + b
CT2— CT1= （k lg X02 + b） —（k lg X01 + b） CT2— CT1= k (lg X02 — lg X01 )
CT2— CT1= k lg (X02 /X01 )
lg (X02 /X01 )= (CT2— CT1)/k
荧光定量PCR实验数据分 析与常见问题解决
技术支持 黄志
内容
• Life Technologies 公司定量PCR仪产品概览 • 荧光定量PCR实验数据分析 • 荧光定量PCR实验常见问题的解决
2
AB荧光定量PCR仪的发展历史
1995 世界上第一台定量PCR仪--7700型诞生 1997 推出面向医疗系统用户的5700型定量PCR仪 2000 推出7900型384孔定量PCR仪 2001 推出7900型96孔定量PCR仪 2001 推出7000型96孔定量PCR仪 2004 获得定量PCR仪专利－确立AB在业界内的领先地位 2004 第5代定量PCR仪7300\7500型诞生 2007 第6代定量PCR仪StepOne和StepOne Plus问世 2010 第7代定量PCR仪ViiA 7发布 2011 最新荧光定量PCR仪 QuantStudio 12K Flex 发布
7
基线的设定
系统背景信号，在扣除背景过程中影响扩增信号的数值，最终影响Ct值。 默认自动分析，比如设定在“3-15”个循环。 手动设置时要避开前期的荧光波动与后期的扩增信号。 必要时可以独立设定制定样品的基线取值范围（V2.0）。
8
阈值线的设定
默认设定为同类扩增基线信号标准差的10倍，反映扩增信号具 有统计学显著的意义。不同扩增子应当独立设定阈值线。
实验结果的考评指标
定性实验：
•是否为显著的“S型”扩增曲线 •扩增曲线的“高度”----表示体现扩增性能的“强度” •阳性对照的Ct值是否在“预期”的位置 ： 过早——污染或加样错误 过晚——存在抑制剂或扩增体系条件不佳 •阴性对照是否报告Ct值 污染、探针特异性差、阈值线设定过低
绝对定量实验：
•标准曲线的斜率或扩增效率 •标准曲线的决定系数值：R2 •检测样品是否偏离标准曲线 •重复样品Ct值的标准差
?
29
如何判断它们是否存在扩增？ • 首先，和同一反应中的其他扩增曲线相比，这些曲线的形状
不相同。
30
如何判断它们是否存在扩增？ • 同时，这些曲线都没有明显的指数增长期。
• 阴性样品的对照
在样品制备过程中，加入已知的阴性样品（或水），并将提取物作为模板 加入反应体系，参与整个实验过程。
目的：监控整个实验操作过程中是否存在污染。
16
故障排除时提供有用信息的软件界面
17
原始荧光组分曲线-v2.0
18
扩增曲线-v2.0
19
标准曲线-v2.0
20
原始多通道荧光信号-v2.0
10 X2
X1
CT2-CT1
K
CT 2-CT 1klgX X12
当扩增效率为100时，K=-3.32，
当扩增效率为100时，K=-3.32，
若C T相差1，则两个样品的浓度差异为： 两个样品的浓度差异为10倍，则C T 差异为：
10 X2
X1
1
3.320.5
C T-2C T 13.3 2 lg 10 3.32
26
如何判断它们是真正的扩增？ • 同时也具有特征性的三个增长阶段。
27
是什么原因造成平台期很低? • 可能是目标模板的浓度太低。
− 通常如果模板的起始浓度太低, 反应体系会形成大量的引物二 聚体。
− 大量引物二聚体的形成使得引物很快消耗完，从而造成扩增曲 线的平台期很低。
28
案例2:是否存在扩增？
6
基线与阈值线的设置
一般情况下选择软件默认的“自动设置”； 特殊情况下或必要时，可以手动设置； 手动设置的原则请查询“Data Analysis on the ABI PRISM® 7700 Sequence Detection
System: Setting Baselines and Thresholds: Guide: Rev A ”，文件号： 4370923 。
14
仪器、循环条件
导致异常实验数据的常见原因:
实验污染 反应试剂质量问题 未正确密封而导致的试剂蒸发 错误的荧光染料设置 错误的反应程序设置 使用错误的耗Leabharlann Baidu 荧光污染 仪器硬件问题
15
两种容易混淆的阴性对照
• 无模板的阴性对照
在反应体系中不加入核酸模板，而以水为替代的对照 目的：监控配制反应体系的试剂是否存在污染。
浓度增加1倍，CT值减小1个单位 浓度增加10倍，CT值减小3.3个单位
12
荧光定量PCR实验常见问题
13
病原体核酸检测效果的主要影响因素
导致巨大差别的因素
导致一般差别的因素
样品采集和储运 采样部位、保存液、冻融
样品量
核酸抽提 交叉污染、抑制剂、病毒裂解 样品量、回收率
核酸定量检测
引物、探针设计/合成质量 核酸的纯度和完整性 预混液的质量
3
AB荧光定量PCR仪家族
第一、二代 7700 5700
第三、四代 7000 7900
第五代
第六代
7300 7500 stepone /plus
第七代 ViiA 7
4
最新型 QuantStudio
荧光定量PCR实验数据分析
5
荧光PCR实验结果的分析流程
查验扩增曲线 检查 NTC 检查 阳性对照 检查阴性对照 检查 / 调整基线 检查 / 调整阈值 分析 样品数据
手动设置在“指数扩增期”，避开前期的背景荧光波动与后期 的非指数扩增及阴性对照最高点。
对于绝对定量实验，阈值线设定在使得标准曲线的决定系数值 （R2）接近1，斜率接近-3.32的地方。
对于无标准曲线的实验，阈值线设定在使得重复样品Ct值差异 最小的位置。
阈值线设定在保障灵敏度均为最佳的位置
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原始多通道荧光信号-v2.0
22
质控报告-V2.0
23
理想的实验结果
可疑的扩增曲线
案例1:是否存在扩增？ • 一些形状和正常的扩增曲线有区别的曲线，该如何判断呢？
正常的扩增曲线
平台期很低
25
如何判断它们是真正的扩增？ • 这些曲线都有典型的指数增长期，而且和其他的曲线平行（虽
然比较短）。
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绝对定量实验效果的评估
11
CT值差与模板量差的关系
CT = k lg X0 + b
CT2— CT1= （k lg X02 + b） —（k lg X01 + b） CT2— CT1= k (lg X02 — lg X01 )
CT2— CT1= k lg (X02 /X01 )
lg (X02 /X01 )= (CT2— CT1)/k
荧光定量PCR实验数据分 析与常见问题解决
技术支持 黄志
内容
• Life Technologies 公司定量PCR仪产品概览 • 荧光定量PCR实验数据分析 • 荧光定量PCR实验常见问题的解决
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AB荧光定量PCR仪的发展历史
1995 世界上第一台定量PCR仪--7700型诞生 1997 推出面向医疗系统用户的5700型定量PCR仪 2000 推出7900型384孔定量PCR仪 2001 推出7900型96孔定量PCR仪 2001 推出7000型96孔定量PCR仪 2004 获得定量PCR仪专利－确立AB在业界内的领先地位 2004 第5代定量PCR仪7300\7500型诞生 2007 第6代定量PCR仪StepOne和StepOne Plus问世 2010 第7代定量PCR仪ViiA 7发布 2011 最新荧光定量PCR仪 QuantStudio 12K Flex 发布
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基线的设定
系统背景信号，在扣除背景过程中影响扩增信号的数值，最终影响Ct值。 默认自动分析，比如设定在“3-15”个循环。 手动设置时要避开前期的荧光波动与后期的扩增信号。 必要时可以独立设定制定样品的基线取值范围（V2.0）。
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阈值线的设定
默认设定为同类扩增基线信号标准差的10倍，反映扩增信号具 有统计学显著的意义。不同扩增子应当独立设定阈值线。
实验结果的考评指标
定性实验：
•是否为显著的“S型”扩增曲线 •扩增曲线的“高度”----表示体现扩增性能的“强度” •阳性对照的Ct值是否在“预期”的位置 ： 过早——污染或加样错误 过晚——存在抑制剂或扩增体系条件不佳 •阴性对照是否报告Ct值 污染、探针特异性差、阈值线设定过低
绝对定量实验：
•标准曲线的斜率或扩增效率 •标准曲线的决定系数值：R2 •检测样品是否偏离标准曲线 •重复样品Ct值的标准差
?
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如何判断它们是否存在扩增？ • 首先，和同一反应中的其他扩增曲线相比，这些曲线的形状
不相同。
30
如何判断它们是否存在扩增？ • 同时，这些曲线都没有明显的指数增长期。
• 阴性样品的对照
在样品制备过程中，加入已知的阴性样品（或水），并将提取物作为模板 加入反应体系，参与整个实验过程。
目的：监控整个实验操作过程中是否存在污染。
16
故障排除时提供有用信息的软件界面
17
原始荧光组分曲线-v2.0
18
扩增曲线-v2.0
19
标准曲线-v2.0
20
原始多通道荧光信号-v2.0
10 X2
X1
CT2-CT1
K
CT 2-CT 1klgX X12
当扩增效率为100时，K=-3.32，
当扩增效率为100时，K=-3.32，
若C T相差1，则两个样品的浓度差异为： 两个样品的浓度差异为10倍，则C T 差异为：
10 X2
X1
1
3.320.5
C T-2C T 13.3 2 lg 10 3.32
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如何判断它们是真正的扩增？ • 同时也具有特征性的三个增长阶段。
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是什么原因造成平台期很低? • 可能是目标模板的浓度太低。
− 通常如果模板的起始浓度太低, 反应体系会形成大量的引物二 聚体。
− 大量引物二聚体的形成使得引物很快消耗完，从而造成扩增曲 线的平台期很低。
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案例2:是否存在扩增？
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基线与阈值线的设置
一般情况下选择软件默认的“自动设置”； 特殊情况下或必要时，可以手动设置； 手动设置的原则请查询“Data Analysis on the ABI PRISM® 7700 Sequence Detection
System: Setting Baselines and Thresholds: Guide: Rev A ”，文件号： 4370923 。
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仪器、循环条件
导致异常实验数据的常见原因:
实验污染 反应试剂质量问题 未正确密封而导致的试剂蒸发 错误的荧光染料设置 错误的反应程序设置 使用错误的耗Leabharlann Baidu 荧光污染 仪器硬件问题
15
两种容易混淆的阴性对照
• 无模板的阴性对照
在反应体系中不加入核酸模板，而以水为替代的对照 目的：监控配制反应体系的试剂是否存在污染。
浓度增加1倍，CT值减小1个单位 浓度增加10倍，CT值减小3.3个单位
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荧光定量PCR实验常见问题
13
病原体核酸检测效果的主要影响因素
导致巨大差别的因素
导致一般差别的因素
样品采集和储运 采样部位、保存液、冻融
样品量
核酸抽提 交叉污染、抑制剂、病毒裂解 样品量、回收率
核酸定量检测
引物、探针设计/合成质量 核酸的纯度和完整性 预混液的质量
3
AB荧光定量PCR仪家族
第一、二代 7700 5700
第三、四代 7000 7900
第五代
第六代
7300 7500 stepone /plus
第七代 ViiA 7
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最新型 QuantStudio
荧光定量PCR实验数据分析
5
荧光PCR实验结果的分析流程
查验扩增曲线 检查 NTC 检查 阳性对照 检查阴性对照 检查 / 调整基线 检查 / 调整阈值 分析 样品数据
手动设置在“指数扩增期”，避开前期的背景荧光波动与后期 的非指数扩增及阴性对照最高点。
对于绝对定量实验，阈值线设定在使得标准曲线的决定系数值 （R2）接近1，斜率接近-3.32的地方。
对于无标准曲线的实验，阈值线设定在使得重复样品Ct值差异 最小的位置。
阈值线设定在保障灵敏度均为最佳的位置
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