双向电泳常见问题
电泳常见问题及处理方法
电泳常见问题及处理方法1.缩孔这类缺陷在湿的漆膜上看不见，当烘干后漆膜表面出现直径通常为0.5-3.0mm漏底微孔、不漏底的火山口状的凹陷，称为陷穴、凹洼，露底者为缩孔，中间有颗粒但不刮手的称为“鱼眼”。
由于电泳漆湿膜中或表面有尘埃、油渍或与电泳涂料不相容的粒子，成为陷穴中心，因而产生涂膜缺陷。
很多情况下这类缺陷还与被涂物的材质有关，如金属底材上存在微裂纹和微孔等。
原因1:外来油污污染电泳漆膜，油污附着在工件表面，使电泳漆成膜受到影响。
这种原因引起缩孔的几率较大。
解决方法:可检查输送机构、挂具,防止油滴污染漆膜。
从电泳设备制造安装开始就要避免上述物质污染，每一种新零件投入电泳前最好进行相关检验，防止受油、硅油、蜡、脂性碳化物、胶水等污染物对工件，电泳设备及电泳槽液的污染。
原因2:前处理除油不干净，造成润湿性不良，使电泳漆烘干后漆膜有缩孔。
解决方法:加强前处理清洗。
原因3:槽液有油污、异物混入，影响电泳漆膜外观。
解决方法:用吸油纸吸去油污，清除槽液内异物，同时避免异物混入，保持电泳槽液清洁原因4:加漆时有电泳漆没搅拌均匀，使槽液无完全熟化，引起漆膜不良。
解决方法:确保加入的电泳漆搅拌均匀，加强槽液循环，使槽液完全熟化原因5:电泳后水洗中含油分或烘干室内不洁净，循环风含油分，使油分附著在漆膜上面烘干后有缩孔。
解决方法:水洗经常更换,烤箱经常清理.烤箱链轨用油可选用耐高温,不会高温挥发为最佳2.针孔工件上有露底针状小孔，称为针孔，它与缩孔的区别是孔径小，中心无异物，且四周无漆膜堆积凹起。
由漆膜再溶解而引起的针孔，称为再溶解针孔；由电泳过程中产生的气体、湿膜脱泡不良而产生的针孔，称为气体针孔；(1)湿膜针孔:工件未进行烘烤,在空气中凉干,可看到的针孔原因1: 电泳电压过高，电流冲击反应过剧，产生气泡过多，或升压速度过快。
解决方法:适当降低电压,加长软启动时间原因2:溶剂含量偏低。
解决方法:添加溶剂，每次添加不能超过1%原因3:槽液温度过低。
双向聚丙烯酰胺凝胶电泳中的问题及其解决方法
双向聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种在两个方向上进行电泳分离的技术，通常用于核酸和蛋白质的分析。
在进行这种电泳过程中，可能会遇到一些问题。
以下是一些常见问题及其可能的解决方法：
1.电泳带模糊或不清晰：
-可能原因：
-样品质量不纯。
-缓冲液配制有问题。
-电场均匀性差。
-解决方法：
-使用纯净的、高质量的核酸或蛋白质样品。
-重新配置新鲜的缓冲液。
-检查电场均匀性，确保电场平均分布。
2.电泳速度过快或过慢：
-可能原因：
-电流设置不当。
-缓冲液浓度不正确。
-解决方法：
-调整电流，确保在设备规定的范围内。
-检查并重新配置适当浓度的缓冲液。
3.电泳带变形或扭曲：
-可能原因：
-样品加载不均匀。
-凝胶浓度选择不当。
-解决方法：
-确保样品加载均匀，使用适当的体积和加载方法。
-重新制备适当浓度的凝胶。
4.电泳凝胶干燥或开裂：
-可能原因：
-凝胶聚合物浓度太高。
-电泳室湿度不足。
-解决方法：
-降低凝胶聚合物的浓度。
-提高电泳室的湿度，可以考虑使用湿度控制设备。
5.样品负载量过多或过少：
-可能原因：
-样品量测量错误。
-样品浓度过低。
-解决方法：
-确保准确测量样品量。
-调整样品的浓度，确保在电泳中可以产生明显的带。
在实验过程中，及时记录实验条件和参数，有助于更容易地识别和解决问题。
如果问题持续存在，建议向实验室同事、导师或相关领域的专家寻求帮助。
电泳常见问题及解决方法
一、颗粒（1）现象在烘干后的电泳涂膜表面上有手感粗糙的、较硬的粒子，或肉眼可见的细小痱子，往往被涂物的水平面较垂直面严重，这种漆膜病态称为颗粒。
（2）产生原因①CED槽液PH值偏高，碱性物质混入，造成槽液不稳定，树脂析出或凝聚。
②槽内有沉淀“死角”和裸露金属处。
③电泳后清洗液脏、含漆量过高，过滤不良。
④进入的被涂物面及吊具不洁，磷化后水洗不良。
⑤在烘干过程中落上颗粒状污物。
⑥涂装环境脏。
⑦补给涂料或树脂溶解不良，有颗粒。
（3）防治方法①将CED槽液的PH值控制在下限，严禁带入碱性物质，加强过滤，加速槽液的更新。
②消除易沉淀的“死角”和产生沉积涂膜的裸露金属件。
③加强过滤，推荐采用精度为25μm的过滤元件，养活泡沫。
④确保被涂面清洁，不应有磷化沉渣，防止二次污染。
⑤清理烘干室和空气过滤器。
⑥保持涂装环境清洁，检查并消除空气的尘埃源。
⑦确保新补涂料溶解良好，色浆细度在标准范围内。
二、缩孔（陷穴）（1）现象在湿的电泳涂膜上看不见，当烘干后漆膜表面出现火山口状的凹坑，直径通常为~,不露底的称为陷穴、凹洼、露底的称为缩孔，中间有颗粒的称为“鱼眼”。
产生这一弊病的主要原因是电泳湿涂膜中或表面有尘埃，油污与电泳涂料不相溶的粒子，成为陷穴中心，使烘干初期的湿漆膜流展能力不均衡，而产生涂膜缺陷。
（2）产生原因①被涂物前处理脱脂不良或清洗后又落上油污、尘埃。
②槽液中混入油污，漂浮在液面或乳化在槽液中。
③电泳后冲洗液混入油污。
④烘干室内不净，循环风内含油分。
⑤槽液的颜基比失调，颜料含量低的易产生缩孔。
⑥涂装环境脏、空气可能含有油雾、漆雾，含有机硅物质等污染被涂物或湿涂膜。
⑦补给涂料有缩孔或其中树脂溶解不良，中和不好。
（3）防治方法①加强被涂物的脱脂工序，确保磷化膜不被二次污染。
②在槽液循环系统设除油过滤袋，同时查清油污源，严禁油污带入槽中。
③提高后清洗水质，加强过滤。
④保持烘干室和循环热风的清洁。
⑤调整槽液的颜基比，适当加色浆提高颜料含量。
电泳常见问题及处理方法
电泳常见问题及处理方法电泳是一种常用于分离生物分子的实验技术，但在实验过程中常常会遇到一些问题。
以下是电泳实验中常见问题及相应的处理方法：**1. ** 电流不稳定或电流为零：- **可能原因：** 电源故障、电极接触不良、电极泄露或电极材料老化。
- **处理方法：**-检查电源设备，确保其正常工作。
-检查电极接触情况，确保良好接触。
-替换老化的电极材料。
**2. ** 样品移动过快或过慢：- **可能原因：** 缓冲液浓度、电场强度、电泳时间等因素影响。
- **处理方法：**-调整缓冲液的浓度，确保适当的离子浓度。
-调整电场强度。
-控制电泳时间，确保合适的分离时间。
**3. ** 电泳带模糊或扩散：- **可能原因：** 样品浓度过高、电场强度过大、电极材料老化等。
- **处理方法：**-减少样品浓度。
-降低电场强度。
-更新电极材料。
**4. ** 电泳带畸变：- **可能原因：** 缓冲液PH值不合适、电极材料污染、样品准备不当等。
- **处理方法：**-调整缓冲液PH值。
-清理电极材料。
-重新准备样品。
**5. ** 电泳槽泄露：- **可能原因：** 电泳槽密封不良、槽体老化等。
- **处理方法：**-检查槽体密封情况。
-更换老化的槽体。
**6. ** 电泳带粘在电极上：- **可能原因：** 电极表面污染、电场强度过大等。
- **处理方法：**-清理电极表面。
-降低电场强度。
**7. ** 电泳结束后凝胶上有色斑：- **可能原因：** 染色不充分、凝胶中存在异物等。
- **处理方法：**-加强染色过程。
-小心操作，避免在凝胶中引入异物。
**8. ** 凝胶破裂：- **可能原因：** 凝胶制备不当、电场强度过大等。
- **处理方法：**-仔细制备凝胶，确保无气泡。
-降低电场强度。
电泳实验中出现问题时，及时采取正确的处理方法是确保实验成功的关键。
通过检查设备、调整实验条件和注意样品制备，可以有效避免或解决电泳过程中的常见问题。
蛋白质组双向电泳实验中一些常见失误的分析
蛋白质组双向电泳实验中一些常见失误的分析Ξ刘健平,陈国华,陈本美,周 平,唐瑶云(中南大学湘雅医学院分析测试中心,中国湖南长沙 410078)摘 要:从以固相pH梯度等电聚焦为第一向,S DS2PAGE电泳为第二向进行的蛋白质组双向电泳实验中挑选了一些常见的硝酸银染色22DE失误图谱,将它们进行分类,初步分析造成各类失误的可能原因,探讨相应的解决方法和总结实验操作中应该注意的事项.关键词:固相pH梯度;蛋白质组;双向电泳中图分类号:Q5233 文献标识码:A文章编号:100727847(2003)022******* Analysis of T roubles in22Dimensional G elsE lectrophoresis of Proteomic StudiesLIU Jian2ping,CHEN G uo2hua,CHEN Ben2mei,ZHOU Ping,T ANG Y ao2yun (The Central Testing Lab,Xiangya School o f Medicine,Central South Univer sity,Changsha410078,Hunan,China)Abstract:S ome failure images in22dimensional gel electrophoresis of proteomic studies were collected and classified.P ossible reas ons for troubles were analyzed and the methods to overcome them were discussed.K ey w ords:imm obilized pH gradient;proteome;tw o2dimensional gel electrophoresis(Life Science Research,2003,7(2):177～180) 蛋白质组学是新近形成的生命科学研究热点,一般包括双向电泳分离技术和质谱检测鉴定技术两大部分.双向电泳分离技术所涉及的环节较多,一般包括蛋白质提取、等电聚焦、蛋白质转移、S DS2PAGE电泳、凝胶硝酸银染色等环节,每一环节又包括若干步骤,如蛋白质提取环节又可以细分为裂解液组成配方、裂解方式选择、抑制蛋白酶降解活性、使蛋白质溶解、去折叠、变性及解聚合、除去核酸、离子、脂类、多糖类、酚类等杂质步骤.由此可见双向电泳分离技术是一个受多种因素控制的技术,其中任何一种因素没有理想地控制好都有可能引起整个实验的失败,而且这种失败往往要等到双向电泳图谱硝酸银染色显影之后才能看到,此时不但已耗费大量人工和试剂,而且有时还难以迅速和准确地找到失误的真正原因.我们从实际工作中挑选了一些典型的22DE失误图谱,将它们进行分类,初步分析造成各类失误的可能原因,探讨相应的解决方法和总结实验操作中应该注意的事项.1 取图方法根据蛋白质斑点的有或无、斑点是否规则清晰、斑点是否有横向或纵向条纹、斑点在整张图谱中的分布是否扭曲或倾斜或团聚或离散、凝胶的背景色是否清晰均匀、凝胶图谱中非斑点处是否有横向或纵向的条纹及条纹出现的位置等标准,从大量22DE凝胶硝酸银染色结果图谱中挑选出一些典型的失误图谱作为分析研究的对象.第7卷 第2期2003年6月 生命科学研究Life Science Research V ol.7 N o.2June2003Ξ收稿日期:2002212229;修回日期:2003202225作者简介:刘健平(19712),男,湖南溆浦人,中南大学助理研究员,硕士,主要从事蛋白质组学和蛋白质化学研究,T el:+86207312 4805312,E2mail:hnljp888@2 失误图谱图1～10中,从左到右为第一向等电聚焦阳性到阴性的方向,从上到下为第二向S DS2PAGE 电泳高分子量蛋白质到低分子量蛋白质的方向.图1 仅图谱下端能看到少量斑点Fig.1 Only little spots are visible in low p art of thegel图2 部分斑点在垂直方向向某条纵轴倾斜Fig.2 Spots concentrate to a vertical axis line ofgel图3 部分斑点在局部区域团聚Fig.3 Some spots aggregate and crowd in thegel图4 图谱上端非斑点处有较多垂直方向条纹或团块Fig.4 V ertical streakΠsmear or agglomerate in thegel图5 有黑色颗粒和手印等杂质,看不到斑点Fig.5 Spots are invisible,contaminated by black p ar2ticles andfingerprint图6 图谱上端非斑点处有水平方向的浓条纹Fig.6 H orizontal stripes across the whole up p art of gel 871 生 命 科 学 研 究 2003年图7 在垂直方向单个斑点变成双点Fig.7 Spots verticallydoubled图8 斑点在水平方向有拖迹条纹Fig.8 Spots streakhorizontally图9 图谱在非斑点处有垂直方向的“∧”型纹、空白间隙或斑点不规则扭曲Fig.9 V ertical “∧”streak or gap or spots distortion across the wholegel图10 部分斑点有垂直方向拖迹条纹,背景色很深Fig.10 Some spots streak vertically and high b ack 2ground3 原因分析及讨论对于图1,可能的原因及解决办法:1)蛋白质从第一向转移到第二向时不完全,应该在第二向电泳开始时按单片凝胶10mA 先跑30min 的低电流电泳,然后再升高到单片凝胶20mA 电泳至溴酚蓝迁移到底部为止;2)平衡时间不充分,蛋白质被重新氧化,应该延长胶条的平衡时间至15min ,平衡液需要新鲜配制;3)蛋白质在水化时没有充分进入胶条,应该新鲜配制并且添加足够体积的水化液进入第一向电泳槽中,如在18cm 规格的第一向电泳槽中应该添加350μl 的水化液,另外还可提高IPG 缓冲液的浓度,如由0.5%提高到2%及延长等电聚焦的时间;4)蛋白质在高重力场下(>105g )长时间离心会使高分子量的蛋白质非特异性地丢失,应该避免对样品的这种离心处理.对于图2,可能的原因及解决办法:1)凝胶聚合太快或聚合时发生泄露引起左下角局部区域不均匀,应该将凝胶混合均匀再灌胶并且检查是否泄漏后再封一层薄水层;2)第二向凝胶顶端不平整引起胶条与它接触不好,使得琼脂糖固定液渗入两者之间的接触面空隙,或气泡或杂质渗入,应该平整好第二向凝胶顶端,放置胶条时要排除气泡或杂质.971第2期 刘健平等:蛋白质组双向电泳实验中一些常见失误的分析 对于图3,可能的原因及解决办法:1)凝胶浓度不合适,或聚合不均匀,应该调整分离胶的浓度并正确灌制凝胶;2)电泳时电流过大,电泳过程太快,应该降低电泳的电流至单片凝胶20mA;3)琼脂糖固定液浓度过高,或杂质阻止高分子蛋白质顺利进入第二向凝胶,应该使用新鲜配制0.5%的琼脂糖固定液,或除去杂质.对于图4,可能的原因的解决办法:1)蛋白质样品中含有较多的核酸,它们增加样品的粘性并造成非斑点处的背景拖迹,甚至还可能封闭凝胶孔,应该使用DNase I和RNAase A酶降解它们;2)核苷酸、磷脂、代谢物等内源性的小离子杂质常常造成胶条阳性端等电聚焦不理想,应该用TC AΠ丙酮法、透析等方法除去它们;3)两性电解质被银染上色,应该使用IPG缓冲液作为两性电解质,必要时可将其浓度降低至0.5%.对于图5,可能的原因及解决办法:1)银染步骤中硝酸银试剂失效,应该使用新鲜配制的硝酸银溶液染色,要戴干净的塑料手套并使用新鲜过滤的双蒸水;2)敏化、显影等步骤中的试剂含较多杂质,应该使用高纯度的试剂.对于图6,可能的原因及解决办法:1)第二向电泳缓冲液中含有杂质,或电泳装置不干净,应该使用新鲜配制的电泳缓冲液并使用干净的玻璃板和电泳槽电泳;2)琼脂糖固定液含有杂质,应该使用新鲜配制的琼脂糖固定液.对于图7,可能的原因及解决办法:1)胶条在第二向凝胶顶端没有正确放置,应该以胶条的塑料保护膜面紧贴长玻璃板的方式放置胶条入两玻璃板的空隙内;2)水化液体积不够,或水化液在等电聚焦槽内分布不均匀使得胶条或胶条的局部区域水化不充分,应该确保足够的体积的水化液在整个第一向等电聚焦槽内均匀铺开,排除胶条胶面与槽面之间的气泡.对于图8,可能的原因及解决办法:1)等电聚焦不充分,应该延长等电聚焦的时间,可以使用3 500V或8000V的高电压以便取得良好的等电聚焦效果;2)过度等电聚焦(>105Vh)能够造成电渗和蛋白质飘移,应该减少等电聚焦的时间;3)蛋白质样品中含有离子,或离子型去污剂如S DS,应该将水化液的离子浓度控制在10mm olΠL以内,可以采用透析、层析、TC A沉淀等方法脱去离子,或使非离子型去污剂的浓度至少8倍于S DS的浓度;4)离子等杂质影响等电聚焦,尤其在酸性端如此,应该除去样品中的杂质.对于图9,可能的原因及解决办法:1)对水平S DS2PAGE而言,凝胶上面的水滴,或下面的气泡会引起热传导不均匀,应该使凝胶稍干燥或排除气泡后再电泳;2)气泡或水化液中的杂质存在于胶条与第二向凝胶顶端的接触面之间,应该排除气泡或杂质;3)电泳时热传导不均匀,或温度过高,应该调节电泳时恒温水循环仪温度为16℃;4)蛋白质没有充分溶解,应该增加裂解液中尿素或CH APS等试剂的含量使蛋白质尽可能完全地、稳定地溶解.对于图10,可能的原因及解决办法:1)硝酸银染色中显色时间太长导致凝胶背景底色过深,应该减少银染和显色时间;2)第二向电泳缓冲液配制不当,S DS含量不足,应该使用新鲜配制的电泳缓冲液并使S DS含量达到0.1%;3)对水平S DS2PAGE而言发生了电渗现象,应该在平衡液中添加甘油和尿素.蛋白质组双向电泳分离技术是受多种因素影响的多步骤实验,只有处理好样品的裂解、蛋白质的提取、溶解和变性、杂质的去除、胶条的水化、蛋白质的等电聚焦、胶条的平衡、S DS2PAGE、凝胶的硝酸银染色显影等步骤,才有可能获得较高重现性、可比性和稳定性的22DE图谱,蛋白质组双向电泳分离技术的实验条件才算成功建立.参考文献(R eferences):[1] BERKE LM AN T om,STE NTE DT T irra.22D E lectrophoresis UsingImm obilized pH G radients Principles&M ethods[M].US A:Amersham Pharmacia Biotech,1998.37241.[2] ESTE VE2ROMERO J,SIM O2A LFONS O E,BERSCIANI F.Sam plestreaks and smears in imm obilized pH gradient gels[J].E lectrophoresis,1996,17:7042708.081 生 命 科 学 研 究 2003年。
双向电泳常见问题
双向电泳常见问题蛋白质的变性及其应用在热、酸、碱、重金属盐、紫外线等作用下，蛋白质会发生性质改变而凝结，这种作用就叫做蛋白质的变性。
蛋白质变性后，不仅失去了原来的可溶性，同时也失去了生理活性。
本文主要从影响蛋白质变性作用的因素以及蛋白质变性作用的应用两方面加以论述。
一、温度随着温度的变化，蛋白质的性质也随之变化。
一般说来，在低温时蛋白质的活性较弱，并且温度越低、活性越弱，但在低温时蛋白质一般不发生变性作用；在较高的温度时，蛋白质的活性增强，并且在一定温度范围内，温度越高、活性越强，在加热（或高温）时，蛋白质活性丧失，发生变性作用。
因此，我们可通过控制温度，来控制蛋白质的性质向着有利于我们需要的方面进行。
例如：1。
低温冷冻、冷藏。
许多含蛋白质的物质，如蛋类、肉类、鱼类等长久放置时会在某些微生物（或细菌）的作用下发生腐败。
根据在低温时微生物（或细菌）活动性较弱的性质，可以用冰箱、冷库等将这些物质贮存较长的时间。
同理，一些含水量高的食品，如水果、疏菜等可冷藏贮存。
2。
有酶参与的各种发酵作用，如酿酒、酿醋、制酱等，都要控制适宜的温度。
温度太高，酶发生变性作用，发酵停止；温度太低，酶的活性减弱，发酵速度减慢，甚至停止。
根瘤菌的固氮作用是在室温下进行的。
3。
作物浸种、菌种疏菜（如蘑菇、灵芝）等的生长、豆芽的生长、鸡鸭等禽蛋的孵化等都要控制适宜的温度，温度过高或过低效果都不好。
4。
在日常生活中，为了减少疾病，防止各种病菌对人体的侵害，一般不要喝生水，不要吃未煮熟的食物，因为这里面的一些细菌、病菌没有经高温杀死。
夏天，有时如果稀饭、汤菜等做多了，可将多余的饭菜重新煮沸后放置在锅里，由于整个锅内的细菌已被杀死，因此短时间内饭菜不会变质。
当衣服上沾有鲜血斑时，宜用温水洗，千万不能用热水洗，否则，会引起蛋白质凝固，沾附在纤维上难以洗净。
5。
在医疗卫生、公共场所中的应用。
在医院里当病人因皮肤破裂引起出血时，医生常用冰块将出血的部位冷冻起来，其作用主要有：①使血管收缩，减少出血；②使表面的血凝固，阻止内部的血液流出；③降低病菌的活性，防止感染。
双向电泳中横条纹解析
双向电泳常见问题解答（一）——水平条纹随着人类基因组草图完成，蛋白质组研究全面展开。
作为经典蛋白质组学分离技术，双向电泳越来越被科研人员所熟知。
但要想得到漂亮的双向电泳谱图，却并不那么容易。
我们将针对双向电泳过程中常出现的问题进行总结，希望能给您的实验带来帮助。
本期我们重点关注双向电泳图谱中常出现的水平条纹。
双向电泳水平条纹的产生主要来自于样品本身和一向等电聚焦电泳，下面就从这两方面的原因及其解决办法进行详述。
一、样品制备问题1．样品中存在影响等电聚焦的杂质蛋白样品中任何离子净电荷的污染都将影响等电聚焦，并引起水平条纹。
严重的污染物干扰，我们在等电聚焦过程中可以观察到：低电压运行时，软件和仪器监测到的电流很快就达到50 µA的限定，预设的高电压不能达到；严重时可能导致电弧产生或IPG胶条燃烧。
常见的污染包括样品制备过程中引入的盐和其他带电小分子、去污剂；以及样品本身内源性的杂质，包括各种内源性的带电小分子，核酸、多糖、脂类、酚类等非蛋白杂质。
了解样品中主要污染物的组成，并且在样品制备过程中采取有针对性的办法去除污染物即可改善水平条纹。
盐和带电小分子：水化上样将盐离子浓度降低到10 mM以下，而杯上样则限制样品盐浓度不超过50 mM。
脱盐常用脱盐柱、旋转透析或透析袋；而用TCA和丙酮沉淀再重悬，是一个更有效的脱盐方法，但往往TCA清除不尽，蛋白复溶效率不高。
2-D Clean-Up Kit （货号80-6484-51）则采用专利的共沉淀剂和洗涤附加物，可以定量沉淀各种来源的蛋白质，蛋白复溶率通常大于90%。
使用2-D Clean-Up Kit不会造成斑点增加或减少，或斑点位置的变化，操作简单，整个过程可以在一个小时内完成。
另外，使用劣质水、尿素或其他试剂也会造成导电性升高；尿素还易分解为带电的产物。
选用优质试剂，重要的试剂包括尿素、硫脲、DTT、去污剂、载体两性电解质、水等，防止一向等电聚焦所需的这些试剂因本身纯度不够，而引入带电杂质。
电泳常见问题分析
防治措施：改进工件的入槽条件，入槽后停留一段时间再通电电泳，使附着在工件上的气体尽量排除；检查循环系统和阴极掩蔽情况，对不合要求的地方进行调整；加大循环量，使槽内流速均匀，防止气泡在槽内滞留；适当调整电泳电压及槽液参数，使之符合工艺要求。
（12）氧化膜破裂。透过电泳漆膜，可以看到型材表面有无规则的裂纹。
（4）雾斑。与正常部位相比，局部出现无光亮斑点，侧光观察更为明显。容易出现在型材的大面和水平面上。
产生原因：酸雾、碱雾或有机溶剂气雾飞入电泳涂装工序的气氛中，附着在烘烤前的漆膜表面引起局部凝固、交联反应而产生的；漆液的中和度偏离控制范围；热水洗槽的温度、pH 值控制不好；电泳后水洗槽的pH 值太低。
（16）水平表面粗糙。亦称L效果差。被涂物电泳后水平表面粗糙，无光泽而垂直表面正常。
产生原因：槽液固体分低，有细小的凝聚物、不溶颗粒；槽液溶剂含量过低；槽液电导率太高，杂质离子含量太高；pH值太低，溶解性差；槽衬里破损，腐蚀。
防治措施：提高槽液固体分，加强过滤；适当补加电泳漆配套溶剂；加强槽液精制或排掉部分RO透过液，补加去离子水；倒槽检修槽衬里。
（2）麻点。亦称颗粒状异物，灰尘附着等。尘埃等附着在漆膜表面或漆膜下形成有手感的凹凸物。
产生原因：电泳槽前的水洗水太脏；电泳槽液中存在较粗大的机械杂质；车间空气中含有尘埃等漂浮物飘落到放在沥干区的工件上；烘烤炉内存在尘灰等杂物。
防治措施：更换电泳前水洗水；检查电泳槽过滤装置并过滤电泳槽液；搞好车间环境卫生，控制沥干区风向，防止灰尘飘浮；清理烘烤炉内卫生，清洁或更换热风循环过滤网。
（6）涂料滴痕。亦称漆斑或漆流痕。漆膜表面有略为凸起的漆斑或朝下的漆流痕迹，有手感。
产生原因：电泳出槽后停留时间过长；涂料的浓度不适当；电泳后水洗不足；RO2水洗槽固体分过高；未滴干的导电梁从正在沥干的料挂上方跨过。
电泳常见问题及处理方法
电泳常见问题及处理方法1.缩孔这类缺陷在湿的漆膜上看不见，当烘干后漆膜表面出现直径通常为0.5-3.0mm漏底微孔、不漏底的火山口状的凹陷，称为陷穴、凹洼，露底者为缩孔，中间有颗粒但不刮手的称为“鱼眼”。
由于电泳漆湿膜中或表面有尘埃、油渍或与电泳涂料不相容的粒子，成为陷穴中心，因而产生涂膜缺陷。
很多情况下这类缺陷还与被涂物的材质有关，如金属底材上存在微裂纹和微孔等。
原因1:外来油污污染电泳漆膜，油污附着在工件表面，使电泳漆成膜受到影响。
这种原因引起缩孔的几率较大。
解决方法:可检查输送机构、挂具,防止油滴污染漆膜。
从电泳设备制造安装开始就要避免上述物质污染，每一种新零件投入电泳前最好进行相关检验，防止受油、硅油、蜡、脂性碳化物、胶水等污染物对工件，电泳设备及电泳槽液的污染。
原因2:前处理除油不干净，造成润湿性不良，使电泳漆烘干后漆膜有缩孔。
解决方法:加强前处理清洗。
原因3:槽液有油污、异物混入，影响电泳漆膜外观。
解决方法:用吸油纸吸去油污，清除槽液内异物，同时避免异物混入，保持电泳槽液清洁原因4:加漆时有电泳漆没搅拌均匀，使槽液无完全熟化，引起漆膜不良。
解决方法:确保加入的电泳漆搅拌均匀，加强槽液循环，使槽液完全熟化原因5:电泳后水洗中含油分或烘干室内不洁净，循环风含油分，使油分附著在漆膜上面烘干后有缩孔。
解决方法:水洗经常更换,烤箱经常清理.烤箱链轨用油可选用耐高温,不会高温挥发为最佳2.针孔工件上有露底针状小孔，称为针孔，它与缩孔的区别是孔径小，中心无异物，且四周无漆膜堆积凹起。
由漆膜再溶解而引起的针孔，称为再溶解针孔；由电泳过程中产生的气体、湿膜脱泡不良而产生的针孔，称为气体针孔；(1)湿膜针孔:工件未进行烘烤,在空气中凉干,可看到的针孔原因1: 电泳电压过高，电流冲击反应过剧，产生气泡过多，或升压速度过快。
解决方法:适当降低电压,加长软启动时间原因2:溶剂含量偏低。
解决方法:添加溶剂，每次添加不能超过1%原因3:槽液温度过低。
双向电泳仪使用注意事项
双向电泳仪使用注意事项双向电泳仪是一种常用的实验仪器，广泛应用于蛋白质分析、基因测序等领域。
正确使用双向电泳仪能够提高实验结果的准确性和可靠性。
下面将介绍一些双向电泳仪的使用注意事项，以帮助读者更好地操作该仪器。
1. 仪器检查和准备在使用双向电泳仪之前，需要进行仪器的检查和准备工作。
首先，确保仪器的电源和连接线路正常无损，并检查仪器的各个部件是否完好。
接下来，检查电泳槽中的缓冲液是否充足，并根据实验需要进行调整。
此外，还需要检查电泳槽的温度控制系统是否正常工作，以及电泳槽内的电极是否安装正确。
只有在仪器检查和准备工作完成后，才能进行实验操作。
2. 样品处理和加载在进行双向电泳实验之前，需要对样品进行处理和加载。
首先，将待测样品进行蛋白质提取或基因提取，并根据实验目的选择相应的电泳胶进行凝胶制备。
凝胶制备完成后，将样品加载到凝胶的适当位置上。
在加载样品之前，可以在凝胶的加载点处加入一定量的标记染料，以便观察电泳进程和结果。
3. 电泳条件设置在进行双向电泳实验时，需要合理设置电泳条件。
首先，根据样品的性质和实验目的选择合适的电泳缓冲液和电泳温度。
然后，根据凝胶的大小和样品的数量设置电场强度和运行时间。
通常情况下，电泳开始时先采用较低的电场强度进行预运行，然后逐渐增加电场强度进行正式运行。
在整个电泳过程中，需要注意保持电场强度和温度的稳定，以确保实验结果的可重复性和准确性。
4. 实验记录和数据分析在进行双向电泳实验时，需要及时记录实验过程和观察结果。
记录的内容包括实验日期、样品名称、电泳条件、实验操作等。
同时，还需要记录凝胶的电泳进程和结果，包括蛋白质或基因的迁移位置和带状图案。
实验记录的完整和准确对于后续的数据分析和结果解释至关重要。
5. 仪器维护和清洁在使用双向电泳仪之后，需要进行仪器的维护和清洁工作。
首先，及时清除电泳槽内的残留凝胶和缓冲液，避免其对仪器产生腐蚀和污染。
其次，对仪器的电极进行清洗和消毒，以保持其表面的洁净。
双向电泳法问题回答
双向电泳法双向电泳法是一种用于分离蛋白质的方法，它可以将复杂的蛋白质样品划分成更小、更简单的部分。
通过该方法，人们可以更深入地研究蛋白质的结构、功能以及表达。
双向电泳法包括两个主要步骤：等电聚焦和SDS-PAGE。
等电聚焦利用电场的不同电势将蛋白质分离成在不同等电点停留的充电种类。
这些蛋白质将从水面通过凝胶的毛孔流动到其他场中。
最外部的电极会使凝胶中的这些蛋白质向相反方向移动，然后再进行SDS-PAGE步骤，通过蛋白质的大小来将它们分类。
尽管双向电泳法已经存在了很长时间，但它仍然是生物学研究人员中非常受欢迎的技术之一。
它可以用于各种样品，如人类组织、细胞培养物、微生物以及植物，这些样品都可以用来进行不同范围和实验室需求下的研究。
相比于其他蛋白质分析技术，双向电泳法具有许多优点。
例如：1. 高解析度。
双向电泳法可以将复杂的蛋白质混合物分离成百上千的谱带。
这使得研究人员可以在不同的谱带上针对不同的蛋白质进行研究。
2. 对小分子靶标进行优化。
一些较小的蛋白质，像激素和细胞因子，往往不能被其他分离技术轻易捕捉。
双向电泳法可以确保在凝胶中打出一个小谱带，并通过调整电泳参数来使这些小蛋白质也可以被检测到。
3. 无需标记。
使用双向电泳法，不需要先对样品进行标记，因为样品中的蛋白质被用电势和电压从样品移动到凝胶上。
虽然双向电泳法已经成为了研究蛋白质及蛋白质体系结构的主要方法，但是其也带来了许多挑战。
其中最重要的是凝胶表面的不均匀性，以及分子的截断现象。
凝胶表面的不均匀性会影响蛋白质的分离，而分子的截断现象则意味着某些蛋白质的片段可能比完整的蛋白质更容易被检测到。
总的来说，双向电泳法是对蛋白质研究进行更深入了解的重要工具。
它提供了高分辨率、高通量和无需标记的优点，仍在各种研究领域广泛应用。
随着基因和蛋白质测序技术的快速发展，相信它也将在不远的将来得到不断地改进和提升。
双向电泳问题
现象14：垂直拖尾
可能原因：SDS电泳缓冲液中的SDS量不足
解决办法： 使用0.1%SDS 点评： SDS的量不足一般不是因为加少了， 而是因为操作上的损失， 因为SDS所加的 量很少， 而且是很轻的粉尘， 所以在配电极液的时候不能在加完水之后才加， 容易造 成SDS浮在溶液面上难以溶解。（如果是前一天配的话， 充分搅拌后静置等泡沫消除， 第2天补足到3L）， 除了这种情况以外，平衡不完全和第二向的缓冲buffer有问题的话 也能造成垂直方向拖尾的产生。 这个时候就要注意严格控制2步平衡的时间，并且注意 擦干洗胶面的水， 如果是2向BUFFER的问题的话， 就注意看是不是每次都出现相似的 竖条纹， 如果是就必须更换新的溶液。
双向电泳常见问题
用户园地26双向电泳常见问题回答(一)——样品制备试剂盒篇双向电泳，作为蛋白质组学研究的经典手段，已经得到非常广泛的应用。
然而双向电泳不是一件简单的差事，太多的不确定性困挠大家，我们近期将推出系列双向电泳常见问题回答，内容涵盖样品制备，一向等电聚焦，到二向SDS电泳等，希望能给大家的实验提供参考。
众所周知，要得到良好的双向电泳结果，其技术的核心就是样品制备，这一步处理的好坏将直接影响2-D 结果。
在最初的样品制备中丢失的关键蛋白永远不能失而复得，GE Healthcare Ettan系列的样品制备试剂盒为双向电泳的样品制备提供了方便、可重复的、一致的解决方案。
以下我们总结分析了大家在使用样品制备试剂盒时常见的问题及可能原因，便于参考。
Sample Grinding kit 样品研磨试剂盒应用：样品研磨试剂盒是即用型裂解少量组织和细胞样品以提取蛋白的试剂盒Q：树脂干了，是否还能再用？A：可以，树脂是惰性的材料，没有影响Q：是否研磨树脂会破坏高分子的蛋白或DNA？是否会结合蛋白和核酸吗？A：不同于其他的研磨材料，我们的研磨树脂很不会破坏gDNA或高分子量的蛋白，也不会结合蛋白和核酸。
2-D Protein Extraction Buffer蛋白抽提缓冲液应用： 2-D蛋白抽提缓冲液为制备高质量的蛋白裂解液提供了一种便利的方法。
目前有6种蛋白抽提缓冲液可供选择，便于用户筛选最合适的缓冲液。
这6种蛋白抽提缓冲液皆源自对可靠而有效的蛋白抽提缓冲液的升级改良，以求进一步提高2D凝胶分析中的点分辨率。
Q：一个包装的抽提缓冲液可以用来处理多少样品？A：对于Trial Kit，处理10-20个样品（100mg组织），常规包装的缓冲液可以处理50-100个样品。
Vivaspin sample concentratorsVivaspin超滤浓缩管应用：Vivaspin Sample Concentrators适用于以膜超滤的方式对生物样品进行快速非变性的浓缩。
双向电泳过程中的常见问题及解决方法
油 ，％ Ｓ Ｓ １ ＇ ５ ｍ ｌＬＴ ｓＨ １ｐ ２ Ｄ ，％ＤＩ ０ｍ ｏ ｒ — Ｃ ，Ｈ值 ８ ８ 中轻缓 震 Ｔ， ／ ｉ ．） 荡平衡 １ ｏ ５ｍｉ。在 Ｓ Ｓ平衡液 Ｂ ６ｍ ｌＬ尿素 ， ％甘油 ，％ Ｄ （ ｏ ／ ３ ０ ２
质 。根据 每个蛋 白质点 的等 电点 和分 子量 进行 双 向 电泳
随着大量生物基 因组序列 的测 定 ， 们发 现在 生物 的基 人 因组 序列中有许 多序 列不 能够 找 到 已有 的同 源序 列 。这 些
序列 的功能就成 为后 基 因组 时代 的重 要工 作 内容 。现 有 的 鉴定基 因功能 的方 法主 要有 Ｎ ｒ ｅ ｏ ｈｒ ｔ ｎ印迹 、 Ｄ Ｔ 基 因芯 片 ＤＲ 、 等 。但是这些 方法 都没 有 考虑 到 ｍ Ｎ Ｒ Ａ的翻译 以 及翻 译后
分离能够进行大量 蛋 白质点 的分离 。
１ 材料与方法
Ｓ Ｓ２５ Ｄ ，．％碘 乙酰 胺 ， 量溴 酚 蓝 ， ｍ ｌＬＴｓ Ｃ，Ｈ值 痕 ５ ｍ ｏ ｆ— １ｐ ０ ／ ｉＨ
８８ 中轻缓震 荡平衡 １ ｉ。 ．） ５ｍｎ
１６ Ｄ ．Ａ Ｅ聚 丙 烯酰 胺 凝 胶 电泳 ． Ｓ ＳＰ Ｇ
主要有 ： 电聚焦不充分 ； 白质样 品纯度不 够 ； 向电泳前 等 蛋 双
８８甘油的浓度至少要 达到 ２％； ．， ０ ⑤蛋 白质氧化交 联或者 重
新折 叠 ， 白在 二 向分离 时氧化 容易 出现纵 条纹 ， 蛋 如果样 品
胶条平衡不充 分。
没有烷基化 ， 以在含有 碘代乙酰胺 的第 二次平衡 缓 冲液中 可
２ 中存 在 的主 要问题 有 ： 白质 点太 少 ； 白质 点 拖 蛋 蛋
作者简介 舒海燕（９５ ） 女 ， １７ 一 ， 河南 罗山人， 师， 讲 从事遗传学研究
蛋白质双向电泳注意点
蛋白质双向电泳注意点
蛋白质的双向电泳的第一向为等电聚焦（Isoelectrofocusing, IEF）,根据蛋白质的等电点不同进行分离；第二向为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），按亚基分子量大小进行分离。
经过电荷和分子量两次分离后，可以得到蛋白质分子的等电点和分子量信息。
注意事项：
1. 一向聚焦与二向电泳之间需要平衡，时间视蛋白质的性质而定，一般为10min，最多不超过15min。
2. 过量的上样量会引起双向图形畸形，特别在一向聚焦时，当样品浓度超过5mg时，则蛋白质凝聚和沉淀，使二向时产生水平和垂直条纹。
3. 含尿素的试剂均应避免过高的温度处理，一般不要超过30℃，否则尿素分解产生异硫氰酸盐会引起羧基甲酰化而导致电荷不均一性。
4. 第一向中过量的去污剂会严重影响双向电泳图谱，因此聚焦完毕进行平衡前，用双蒸馏水冲洗胶条，以除去残留的去污剂。
5. 双向电泳中双向凝胶间的界面紧密接触非常重要，如果接触不好或者两者之间留有气泡，则导致转移时分子扩散。
6. 双向电泳中的条纹现象是常见的问题。
水平条纹可能与一向电泳时间不够，聚焦不好有关，或者在加样处产生沉淀和引起重新溶解所致；纵向条纹则表明样品没溶解，这可以通过调整样品量，增加电泳时间，改善样品的溶解状态，同时在加样前通过高速离心以除掉所有不溶物。
电泳中常犯的六大错误
正确的操作 煮沸后让样品冷却至60°C左右，然后加入碘乙酰胺。通常我们在100 μl样品中加入10 μl 20%（w/v）的碘乙酰胺水溶液，并在室温下孵育30分钟。
通过这一步，我们可以获得更为锐利的条带，并排除了一些假象，如两条带、其他的高 分子量条带、点样孔中的沉淀，以及凝胶上的线。
4. SDS电泳中运行缓冲液的滴定 到目前为止，大部分单向和双向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用是在基于Lämmli的不连 续缓冲液系统中开展的[1]。其他基于磷酸盐、咪唑或其他缓冲液的均一系统表现出的分 辨率和重复性不高。在不连续的“Lämmli”系统中，积层胶和分离胶缓冲液是由指定pH 值的Tris和氯离子缓冲液组成的 – 其中含有或不含SDS，运行缓冲液中则包含SDS、 Tris和甘氨酸。氯离子作为前导离子和甘氨酸作为尾随离子之间的不连续性控制蛋白缓 慢进入聚丙烯酰胺凝胶，并实现积层效应，产生非常锐利和清晰可辨的区带。
参考文献 [2] Rabilloud, T., Use of thiourea to increase the solubility of membrane proteins in twodimensional electrophoresis. Electrophoresis 1998, 19, 758 –760.
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电泳常见问题解答
1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。
在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。
由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。
当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。
2. 样品如何处理？根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。
1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta 巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。
一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。
2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。
100ul样品缓冲液中10ul 20％的碘乙酸胺，并在室温保温30min。
3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1％SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。
3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris －HCL系统，TEMED与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
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双向电泳常见问题
1. 重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽，直接跑2D 的一向吗？
一般情况下是可以的。
但当上样量特别大时，可能会有一部分蛋白质没有被胶条吸收，这样跑完1D 和2D 胶后，会有很多横向条纹。
所以在这种情况下，最好在重泡胀后，将胶条转移到另外一个电泳漕中进行电泳。
2. 为什么我在等电聚焦前加的矿物油在聚焦后会减少，暴露出了胶条的背面？
这是因为BioRad 的电泳槽有个盖子。
为了固定电泳槽中的胶条，这个盖子上设计了对应的突起，以便压住胶条。
由于虹吸作用，这个突起会导引矿物油到相邻的空电泳槽，从而降低有胶条的电泳槽中的矿物油液面。
如果由此把胶条暴露在空气中，那对等电聚焦的影响将是毁灭性的。
为了防止这个现象的发生，可以在相邻的空电泳槽里，也加入适量（80 ％满）的矿物油。
3. 跑第一向时，为什么要设定一个电流的最大值电压(50 μ A/ 胶)？
电流的平方和功率成正比。
电流增大，功率增大，放出的热量也随之增大，就会导致胶条的温度增加。
当温度超过30 摄氏度时，缓冲液里的尿素就容易解离，产生一些极性分子，从而对等电聚焦产生影响。
4. 跑第一向时，为什么刚开始的电压比较低，而后逐渐增高？
刚开始时，体系内的带电小分子比较多（比如无机盐和双极性分子）。
所以在这个阶段，电流主要是由这些小分子的移动所产生的。
由于这些分子质量小，移动他们不需要很高的电压。
当这些小分子移动到他们的目的地时（无机盐移动到极性相反的电极；两性分子移动到对应的pH 条带），体系内的蛋白质才开始肩负起运载电流的任务，逐渐向所对应的pH 区域移动。
5. 跑第一向时，为什么会产生一条蓝色的条带，并逐渐向酸性端移动？
蓝色条带是缓冲液中痕量的溴酚蓝被聚焦所产生的。
溴酚蓝也是pH 指示剂，当它移动到酸性区时（pH4 ），颜色会变成黄色。
溴酚蓝的这个移动过程大体上发生在极性小分子的聚焦之后，蛋白质大分子聚焦之前。
6. 跑第一向时，为什么电压总达不到预定值？
当上样量比较大时或体系内盐分比较多时，聚焦的电压有可能达不到所设定的数值。
7. 跑第一向时，在电压达到预定值后，电流为什么会降低？
当上样量比较少时，所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的pH 值区域值，从而变成中性分子。
这样，体系的电阻越来越大，在恒定的电压下，电流就会越来越小。
8. 跑第一向时，为什么在两个电极丝附近有气泡产生？
等电聚焦完成后，所有的蛋白质都移动到了相应的pI 值区域，而成为中心分子。
这是加在体系上的电压就开始电解水分子，在阳极产生氧气，在阴极产生氢气。
9. 重泡胀缓冲液(rehydration buffer)中的硫脲的作用是什么，双极性分子的作用是什么？硫脲的作用是增加蛋白质的溶解性，特别是碱性蛋白的溶解性。
双极性分子的作用也是增加蛋白质的溶解性。
当蛋白移动到相应的pH 值后，就变成了中性分子。
而不带电荷的蛋白质分子容易聚集，从而降低其在随后的二向胶时的迁移效率，可能会造成竖的脱尾。
而硫脲和双极性小分子则会鉴定中性蛋白质之间的相互作用，防止它们的聚集。
10. 怎样估计2D 胶上蛋白质点的分子量和pI 值？
可以用BioRad 生产的2D 胶标准蛋白来校准。
也可以用体系内已知蛋白来做比对。
11. 为什么2D 胶上的蛋白点有横的和竖的脱尾？
横的脱尾可能是：1 ）一向等电聚焦不完全；2 ）某些蛋白质本身的原因（糖蛋白）；3 ）
蛋白的丰度太高。
竖的脱尾是因为跑二向时，蛋白的溶解度不好。
12. 什么成分会影响2D 胶的效果？
核酸，盐，去垢剂等等。
13. 2D 胶的上样量应该在什么范围？
上样量和样品有关。
样品内蛋白种类多的上样量要大些，这样每个点才有足够的量被检测到。
一般的全细胞裂解体系，上样量大概在100 微克（银染）到500 微克（考染）之间。
14. 我的蛋白质浓度很低，应该用什么方法来浓缩？
蛋白质的浓缩有很多方法。
大致有超滤法，沉淀法和透析法。
超滤比较温和，对蛋白质不会有修饰和改变，蛋白的种类一般不会有丢失。
它的缺点是总样品的量可能会减少（被膜所吸附）。
另外超滤对样品的要求比较高。
甘油，去垢剂都会堵塞滤膜，影响超滤的效果。
沉淀法比较快速，容易操作，对盐，甘油，去垢剂的耐受性好。
缺点是可能会有部分种类的蛋白没有被沉淀下来（丢失）。
沉淀法中，又以TCA 法最为普遍使用。
使用TCA 法时，一定要用冷的纯丙酮清洗蛋白沉淀两次，去处残留的TCA 和其他沉淀下来的杂质。
透析法只使用于量比较大的样品，量小时，操作困难。
透析法可以和超滤法联用。
先把样品透析到一个比较干净的环境（不含盐，甘油，去垢剂或其它杂质，比如碳酸氢氨溶液），然后再进行超滤。
去除杂质—关键是尽量不丢失蛋白和减少蛋白修饰
核酸的去除:
对电泳的影响:增加样品粘度,于蛋白质形成复合物后会出现假象迁移和条纹.
解决方法:用适量的不含蛋白酶的核酸内切酶进行降解,或是利用合成载体两性电解质
同核酸结合形成复合物的能力,再通过超速离心来去除复合物.
多糖的清除:
影响:带负电的多糖会与蛋白形成复合物,导致托尾和影响聚焦.
解决:用超离心和高pH,高离子强度,和TCA等沉淀法.
去污剂的清除:
影响:SDS能与蛋白形成带负电的复合物,对等电聚焦影响大,需要清除.
解决:用含载体两性电解质或两性离子去污剂的溶胀液稀释,或丙酮沉淀.
盐离子和外带电小分子的清除:
影响:样品中的盐增加凝胶条的电导,使其无法达到设置的电压,从而影响蛋白质聚焦,带电小分子会引起水的流动,使胶条的一端肿胀而另一端变干,导致两端的酸碱性蛋白无法聚焦,造成托尾或丢失.
解决: 透析去除盐成分,TCA-丙酮沉淀法可以清除小分子.
15. 蛋白质从一向（IPG胶条）到二向（SDS凝胶）的转移为避免点脱尾和损失高分子
量蛋白，应缓慢进行（场强小于10V/cm）。
16.第二向电泳中，用Mini Protein 3电泳槽时，以电流为标准，开始进样的低电流为5mA/gel，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，再加大电流到10-15mA/gel；以电压为标准，开始进样的低电压为50-75V/gel，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，再加大电压到150-200V /gel。
用Protein II电泳槽时，以电流为标准，开始进样的低电流为10mA/gel，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，再加大电流到20-30mA/gel；以电压为标准，开始进样的低电压为75-100V /gel，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，再加大电压到300-400mA/gel。
17.平衡过程导致蛋白丢失约5%-25%，还会使分辨率降低，平衡30分钟时，蛋白带变宽40%，所以平衡时间不可过长。
如果不经平衡，把等电聚焦凝胶直接放在第二向凝胶上会导致高分子量蛋白的纹理现象，并且等电聚焦凝胶会粘在SDS胶上。
缩短平衡时间可以减少扩散，但同时会减少向第二向的转移。
所以平衡时间要充分长（至少2×10分钟），但也不要超过（2×15分钟）
18.每根胶条蛋白质的总上样量由特定的样品，胶条的pH范围，及最终的检测方式决定。
下表是进行银氨染色时的蛋白质上样参考。
19.所有包含尿素的溶液加热温度不超过30℃，否则会发生蛋白氨甲酰化。
引起蛋白
质pI值的偏移
20. 当样品中含盐量较高时，建议选用慢速升压。
当样品中含盐量一般时，选用线性升压。
当样品中含盐量很少时，可以选用快速升压，这样可以节省聚焦时间。
21. 一般7cm胶条的极限电流不超过30μA/根，17cm胶条的极限电流不超过50μA/根，最好也在30μA/根以下。
22. 不同的样品需要的volt-hours不同。
当聚焦过程无法达到最高电压时，只要最后能
达到总的volt-hours，且7cm胶条电压不低于3000伏，11cm胶条电压不低于5000伏，17cm
胶条电压不低于7000伏，也能对样品进行充分的聚焦。
23. 等电聚焦溶胀缓冲液和样品溶液中都要加入两性电解质，它能够帮助蛋白质溶解。
两性电解质的选择取决于IPG胶条的pH范围。
下图可提供参考。
24. 因为样品和样品之间存在差异，所以这种上样量仅提供参考。
对于窄pH范围的IPG 胶条，需要比宽pH范围的IPG胶条上更多的样品，这是因为pI值不在此范围内的蛋白质在等电聚焦的过程中会走出胶条。
单pH范围IPG胶条的上样量是通常的4-5倍还多，这样就可以很好的检测低丰度的蛋白质。