高效去内毒素亲和填料FF
亲和层析的生物工艺相关应用案例
Part 1、工艺经济性毫无疑问，亲和填料比传统填料（如离子交换或疏水相互作用层析填料）更昂贵。
它们每升的价格要高出三到十倍，因为i) 与生产其它类型的配基相比，用于生物工艺应用的亲和配基的生产更加复杂，因此成本更高，并且ii) 从公司运营的角度看，填料价格体现了AC提供的经济利益，包括减少工艺开发时间以及更高收率的生产操作。
从生产工艺的角度来看，确定填料成本的常用方法是计算每克纯化目标产品的成本。
该成本与填料可以使用的循环次数和有效结合载量（上样×步骤收率）成反比，并与填料和缓冲液成本成正比。
由于AC 填料的成本很高，它对商品总成本的影响可能很大，例如，对于特定的纯化工艺，Protein A可能占到商品总成本的60%。
但是，相比关注AC对纯化工艺总体商品成本的相对成本，如果分析的重点是实际生产成本，那么可以表明，在下游工艺中使用AC 通常会降低商品的总成本。
AC 减少了纯化步骤的数量，从而提高了整体工艺收率并缩短了工艺时间。
图 1 举例说明了这一点，该图显示了非亲和（四步）和基于亲和（三步）纯化工艺的COG 分析比较，它们都产生相同纯度的药物底物（在两个工艺中，最后两个层析步骤相同）。
与非亲和工艺相比，将AC 作为第一步的三步工艺可以将产品的总成本降低 1.5 倍，即使前两个非亲和步骤具有更高的上样载量。
由于与AC 步骤相比，第一个非亲和步骤具有低得多的步骤收率，因此与单个AC 步骤相比，两个非亲和步骤之后的整体工艺收率显著降低(30%)。
总收率越低，生产的产品质量越低，即使非亲和工艺的耗材成本与基于亲和工艺的情况相比要低得多，这也会推动COG 上升。
其他研究人员也报道了类似的结果。
显然，只有在可使整体工艺收率大幅增加时，才应考虑用AC 步骤替换多个非特异性步骤。
图1.基于亲和和非亲和捕获步骤的 DSP 工艺（工艺 I和 II）之间的 COG 分析比较结果示例。
图：A)两个工艺的简化工艺布局（相关的动态结合载量，DBC，在各自的框中给出，两个工艺的所有其它步骤相同）；B) 过程 I（空心符号）和过程 II（实心符号）中每个下游加工步骤后的累积过程产量（三角形）和纯度（圆圈）；C) 以过程 II 值的百分比变化表示的典型过程经济指标的变化。
北京卓冠科技公司系列色谱填料选择指南-肝素琼脂糖凝胶 FF
特性 及应用 AT Ⅲ、脂蛋白、干扰素、 核酸结合蛋白、限制内切 酶、凝血酶 AT Ⅲ、脂蛋白、干扰素、 核酸结合蛋白、限制内切 酶、凝血酶 AT Ⅲ、脂蛋白、干扰素、 核酸结合蛋白、限制内切 酶、凝血酶 AT Ⅲ、脂蛋白、干扰素、 核酸结合蛋白、限制内切 酶、凝血酶 AT Ⅲ、脂蛋白、干扰素、 核酸结合蛋白、限制内切 酶、凝血酶 AT Ⅲ、脂蛋白、干扰素、 核酸结合蛋白、限制内切 酶、凝血酶 AT Ⅲ、脂蛋白、干扰素、 核酸结合蛋白、限制内切 酶、凝血酶
肝素琼脂糖凝胶 FF
一、 简介 肝素是一种含硫酸酯的酸性多糖，将它偶联到交联及活化的琼脂糖凝胶上，该填料具
有很高的物理化学稳定性。 肝素能和抗凝血因子Ⅲ、凝血因子、蛋白合成因子、脂蛋白、干扰素、核酸结合蛋白、
限制内切酶、凝血酶及类凝血酶等生物大分子结合，所以肝素琼脂糖凝胶可以用于这类物质 的纯化。
本产品稳定性好，基团脱落少，使用寿命长，使用方便，应用广泛。
上样，流速为 1ml/min 4、 用缓冲液 1 再洗 5-10 个床体积，流速为 2ml/min
１
北京韦氏博慧色谱科技有限公司 北京经济技术开发区同济中路甲 7 号 B 座 931 室
邮政编码：100176 TEL：010-67804548 13911415318 FAX：010-67804548
162ml， 119 克 NaCl,加适量水溶解后定容到 1000ml。
四、 亲和填料应用的注意事项： 1、 该凝胶从冷室或冰箱中取出后最好在室温下缓慢振摇恢复到室温，然后再装柱，以免产
生气泡影响柱效。 2、 吸附：20-50mM,pH7.4-8.0 的缓冲液，为避免离子交换的干扰，缓冲液中可以适当加
CS-A13-0B 肝素琼脂糖凝胶 FF
内毒素去除试剂盒说明书
内毒素去除试剂盒说明书I. DESCRIPTION细菌内毒素(脂多糖，LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分。
人们在研究革兰氏阴性菌血症和内毒素血症的过程中，发现细菌内毒素在其中起着关键的作用，内毒素使机体免疫功能严重受损，进一步的发展可能引发脓毒性休克，弥散性血管内凝血，急性呼吸窘迫综合症，全身炎症反应综合症或致命性多器官功能衰竭。
因此，内毒素的去除对于人类疾病治疗的注射型药品、生物制品等都是必须的，尤其对于基因药物、蛋白药物、单抗克隆药物、治疗性疫苗、小分子化学药物等生物制品的下游纯化处理来说就显得非常重要。
本试剂盒使用的是一类高效内毒素去除树脂，它以修饰过的多粘菌素B（PMB）为配体，进行特异性的内毒素去除。
经此亲和树脂纯化，样品最终的内毒素水平可低于0.1 EU/ml。
亲和树脂的主要特性如下表：规格 1.5 ml预装柱结合能力高达2,000,000 EU/ml 树脂配基修饰的多粘菌素B (PMB)pH 范围pH 5-10基质4% 交联的琼脂糖凝胶颗粒大小90 µm保存温度2°C-8°C使用寿命18个月平衡缓冲液磷酸盐缓冲液，pH 8.0适合纯化对象蛋白，多肽，抗体，多糖等离子条件0.1-0.5 M NaCl可耐受试剂20% DMSO, 20% 乙醇, 20% 甘油;1 M 尿素, 300 mM 咪唑; 0.05% 吐温-20, 10 mM DTT 等II. KEY FEATURES·高稳定性，高去除效率·高结合力：> 2, 000, 000 EU / ml (CV)·无需恒流泵即可调节流速·重复使用5次不会改变柱子效果·使用方便，试剂盒中提供无热源缓冲液，无热源收集管，无热源枪头等III. CONTENTS试剂盒内容 3 – 5个测试亲和树脂 1.5 ml 预装柱再生缓冲液125 ml平衡缓冲液125 ml流速控制器1个无热源接收管 1 包(3个/包)无热源枪头(1 ml) 2包(6个/包) 说明书1份IV. MATERIALS AND EQUIPMENT NEEDED BUT NOT PROVIDED1. 铁架台2. 0.1 M的氢氧化钠和0.1M盐酸, 用于调节样品pH值V. ENDOTOXIN REMOVAL PROTOCOL样品处理：样品的pH值和离子强度在内毒素去除的过程中起着重要作用。
包涵体的纯化和复性情况总结
板块一、大肠杆菌（这里讨论的大肠杆菌为非分泌到培养基中的重组蛋白，是否有重组蛋白分泌到培养基中的工程菌我没有见过。
）一、关于菌体的量大肠杆菌表达的基因工程蛋白是纯化人员最方便获得的原料，对纯化工艺开发来说几乎没有原料方面的限制。
常看到有战友用个几毫升的菌液去做纯化，对此我十分不解，同样要做，为什么不多做点呢？很少的菌体会给纯化带来一些难以估计的问题，工艺的重复性和放大往往出现问题。
因此，要做个好工艺就多发酵表达一些菌体吧。
我做纯化时，初始工艺摸索用的菌体量一般为10g左右。
二、关于是否包涵体表达包涵体的定义我就不讲了。
我要讲的是，一个基因工程蛋白是否是包涵体表达的说法本身就不完全准确。
至于包涵体在电镜下的晶体颗粒表现等等对我们纯化来说毫无意义，我相信做纯化工艺的人没有谁去看这个电镜，也不关心。
我们判断的依据只是SDS-PAGE，目的蛋白在破菌沉淀中，我们就认为是包涵体表达，但这是一个似是而非的结论。
看着没问题，实际上是有毛病的。
关键在于你用的是什么破菌缓冲液！有些蛋白在用缓冲液A破菌时是在破菌沉淀中，而用缓冲液B破菌时却在破菌上清中。
缓冲液A和B的差别可能只是pH上相差1-2个单位。
那么它是包涵体表达还是可溶上清表达呢？说这个问题主要在于有些战友往往非常在意他的目标蛋白是否包涵体表达。
甚至还有包涵体表达就用专门的包涵体蛋白纯化方法等等。
我们应该关心的是目标蛋白在什么缓冲体系下是可溶的，在什么缓冲体系下是不溶的！不要让包涵体这个概念给你误导。
三、关于表达量我们常常在发表的文章上看到，我这个工程菌的目标蛋白的表达量达到菌体总蛋白的30%、50%等等。
我要说都是文章的作者在忽悠。
不知道他们是如何定量的，用的最多的大概就是SDS-PAGE的扫描分析吧。
且不说一个SDS-PAGE不能表现出所有的菌体蛋白，电泳的染色方法、染色脱色强度、照片的曝光强度、扫描分析时的条带选择等等无不对这个百分比影响巨大。
在公司的QC部门做的对此应该最有体验，20%的条带要它变成30%又有何难？我的观点是对待表达量的描述不可定量，只能定性。
内毒素去除试剂盒说明书(1)[1]
![内毒素去除试剂盒说明书(1)[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/d796620652ea551810a68795.png)
内毒素去除试剂盒说明书内毒素去除试剂盒说明书I. DESCRIPTION细菌内毒素(脂多糖，LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分。
人们在研究革兰氏阴性菌血症和内毒素血症的过程中，发现细菌内毒素在其中起着关键的作用，内毒素使机体免疫功能严重受损，进一步的发展可能引发脓毒性休克，弥散性血管内凝血，急性呼吸窘迫综合症，全身炎症反应综合症或致命性多器官功能衰竭。
因此，内毒素的去除对于人类疾病治疗的注射型药品、生物制品等都是必须的，尤其对于基因药物、蛋白药物、单抗克隆药物、治疗性疫苗、小分子化学药物等生物制品的下游纯化处理来说就显得非常重要。
本试剂盒使用的是一类高效内毒素去除树脂，它以修饰过的多粘菌素B（PMB）为配体，进行特异性的内毒素去除。
经此亲和树脂纯化，样品最终的内毒素水平可低于0.1 EU/ml。
亲和树脂的主要特性如下表：规格 1.5 ml预装柱结合能力高达2,000,000 EU/ml 树脂配基修饰的多粘菌素B (PMB)pH 范围pH 5-10基质4% 交联的琼脂糖凝胶颗粒大小90 µm保存温度2°C-8°C使用寿命18个月平衡缓冲液磷酸盐缓冲液，pH 8.0适合纯化对象蛋白，多肽，抗体，多糖等离子条件0.1-0.5 M NaCl可耐受试剂20% DMSO, 20% 乙醇, 20% 甘油;1 M 尿素, 300 mM 咪唑; 0.05% 吐温-20, 10 mM DTT 等II. KEY FEATURES·高稳定性，高去除效率·高结合力：> 2, 000, 000 EU / ml (CV)·无需恒流泵即可调节流速·重复使用5次不会改变柱子效果·使用方便，试剂盒中提供无热源缓冲液，无热源收集管，无热源枪头等III. CONTENTS试剂盒内容 3 – 5个测试亲和树脂 1.5 ml 预装柱再生缓冲液125 ml平衡缓冲液125 ml流速控制器1个无热源接收管 1 包(3个/包)无热源枪头(1 ml) 2包(6个/包) 说明书1份IV . MATERIALS AND EQUIPMENT NEEDED BUT NOT PROVIDED 1. 铁架台2. 0.1 M 的氢氧化钠和0.1M 盐酸, 用于调节样品pH 值V . ENDOTOXIN REMOVAL PROTOCOL样品处理：样品的pH 值和离子强度在内毒素去除的过程中起着重要作用。
蛋白纯化实验常见问题精华解析
蛋白纯化实验常见问题精华解析本文主要介绍了蛋白纯化过程中常见的问题.内容选择方面恐存众不足，望指正。
1）我现在手头有个融合蛋白，纯化的时候用助溶剂溶解后做了GST 亲和层析，之后用蛋白酶切割后却发现目的蛋白没有活性。
请问有哪些可能会出现这种原因？怎么解决？测过基因序列，没有问题。
细胞破碎后，融合蛋白在沉淀里，我用助溶剂提取后，可以用GST做亲和层析，但效率只有50～60％左右。
洗脱完融合蛋白不需要助溶剂，但这样的条件下切割完后目的蛋白会沉淀，我用0.5％CHAPS 助溶可勉强溶解部分，目的蛋白疏水性比较强。
既然是疏水性很强你可以加点甘油或者乙二醇降低极性，这样溶解就会好得多，此外你也直接加2%的PEG这样也降低极性，同时保护你的蛋白，你再做纯化就可以了，我以前遇到这样的蛋白是用10%的乙醇加3-5%的PEG5000，这样的情况下蛋白还是活性回收率很高，我觉得那些表面活性剂能不用还是不用的好，你失去活性你可以监测一下提取，纯化，酶切到底哪里失去了活性，这样更容易解决你的问题。
还有注意缓冲液PH值，看看改变它对溶解度有没有影响。
蛋白有沉淀那你可以稍微把蛋白的浓度降低点，这也是个办法。
2)请问楼主有没有合成过配体为FMN的亲和胶？我已经给你发了相关一些偶联的材料，请查收，现在一般要自己合成亲和填料，有很多公司都提供活化好的介质，自己偶联就可以，其中比较常用的有溴化氰琼脂糖凝胶，环氧琼脂糖凝胶，氨基琼脂糖凝胶，羧基琼脂糖凝胶，活化酯琼脂糖凝胶，以及巯基琼脂糖凝胶等，但是如果是小分子的配基最好选择有3-10碳作为手臂的活化介质为好，此外也曾经有文献报导固定辅酶时，偶联位置不同，选择性有差别，因此你可以选择自己适合的活化介质。
不同的活化的介质对偶联的配基有不同的要求，所以要对自己的配基了解比较清楚就可以选择合适的活化介质。
我一般在合成的时候大多选择环氧琼脂糖凝胶，它能应用的范围广氨基巯基羟基都可以，而且合成的介质刚性好，非特异吸附少，所以不需要特殊处理未反应基团。
内毒素的检测和去除
内毒素的检测和去除1 内毒素及其来源1.1内毒素内毒素（endotoxin）是存在于革兰氏阴性菌细胞壁外膜表面的一种大分子物质，一般只有在细胞死亡或分解时自行释放到周围介质中，特殊条件下也可以从活细胞中直接泄漏出来。
内毒素又被称为热原，是一种脂多糖物质，具有耐热性，不易被去除。
若疫苗中存在一定浓度的内毒素，接种动物后，可引起动物发热，休克等，严重时甚至造成死亡。
1.2内毒素的来源因为革兰氏阴性菌无处不在，所以内毒素几乎存在于任何地方。
在疫苗生产中一定要重视和尽可能减少内毒素的污染。
生产用水中内毒素的含量是导致疫苗安全性的关键因素之一。
大量研究表明，疫苗生产过程中内毒素主要来源于培养液和配制用水，其在贮存过程中易受到革兰氏阴性菌的污染。
贮水罐，纯水系统的过滤器和连接管道，以及培养液容器等都可能受到革兰氏阴性菌的污染。
工作人员进出车间携带的物品，以及空气净化系统久不维护，都有可能造成生产车间内的空气尘埃浓度升高，导致内毒素污染。
生产用具、管道、泵、阀门、滤器等的清洗消毒不彻底也会造成内毒素污染。
生产原料的污染，如血液制品，细胞培养基。
人为操作不规范也会引起内毒素污染。
2内毒素的检测目前，内毒素的检测方法较多，但是各存在利弊，因此，选取检测方法要根据实际需求，不建议采取单一的检测方法。
2.1鲎试验法鲎试验法是通过酶的级联反应而实现，内毒素在二价阳离子的参与下激活C因子（FC），然后激活其它酶原，产生一系列凝集酶反应。
该方法是目前检测内毒素最特异和最灵敏的方法。
2.2重组C因子法重组C因子法是使用一个单一的蛋白（重组C因子）作为有效活性成分。
反应中内毒素激活重组C因子，活化的重组C因子将荧光底物裂解，产生荧光复合物，定量检测荧光复合物来量化内毒素。
这种方法可有效避免假阳性的产生。
该方法可用于药品生产，环境，器械生产中的内毒素检测。
2.3热原试验法该方法是比较广泛的检测热原的方法，利用微量内毒素可引起动物体温升高的特性来测试其含量。
内毒素除去填料操作流程
内毒素除去填料操作流程内毒素除去填料操作流程内毒素是细菌细胞壁分解产生的一种有害物质，可以导致人体免疫系统失调、炎症反应，甚至休克、多器官功能障碍综合征等危重症状。
在生物技术制药生产过程中，许多制剂和工艺均需要去除内毒素，以保证生产质量和生产安全，其中内毒素除去填料操作是重要的一环。
以下是该流程的详细过程。
一、装备准备1.1 验证设备清洁状态，确认无杂质和残留；1.2 确定用于内毒素除去的填料类型、数量与规格；1.3 检查系统的肝素或其他抗凝剂的添加和有效性；1.4 确定后续操作的条件和参数，如温度、pH值等。
二、填料投入和平衡2.1 将干燥的填料通过口径合适的漏斗、箱、塔等设备中填充到提前清洗并灭菌的内毒素除去设备（如脱色树脂、离子交换树脂、高效蛋白等）中；2.2 使用预定容积的缓冲液洗数组，直到液体流出无色；2.3 使用预定容积的样品处理液洗数组以平衡填料。
二次洗涤、平衡的次数及洗涤液配比必须按照操作手册中的要求执行，以确保填料质量和操作效率。
三、样品处理和内毒素除去3.1 使用灭菌的取样器、管和工具采集待处理样品；3.2 将样品送到内毒素除去装置中，按照操作手册中给定的操作流程，并根据生产要求严格控制洗柿剂、缓冲液的质量和色度；3.3 保持填料床深度，并注意搅拌速度和时间，冷却系统应该及时跟进；3.4 所处理的样品通过滤器或其他装置从除去装置中收集；四、检测与结果分析4.1 将处理后的样品送往实验室，对样品内毒素含量进行检测；4.2 根据检测结果，分析数据；4.3 对于不符合要求的样品通过重复操作，重新进行去除内毒素的操作；4.4 处理效果和操作过程记录在操作手册中。
以上为内毒素除去填料操作流程的详细介绍，有效、规范的操作可以保证产品质量和生产效率，在生物技术制药等生产过程中有着广泛的应用。
去除内毒素
在下游纯化中，可应用不同层析技术在纯化生物分子的同时，去除各种污染物。
《去除——内毒素》
■内毒素又称热原。含脂肪 A、糖类和 蛋白，是带负电的复合大分子。 内毒素的脂肪 A 部份有很强的疏水性。 但在高盐下会凝集，无法上疏水层析。 利用疏水层析试验盒(17-1349-01)可选 择结合目标蛋白的介质而去除内毒素。 内毒素与阴离子交换介质 Q 或 DEAE Sepharose Fast Flow 有较强结合。可 在洗脱目标蛋白后用高盐缓冲液或 NaOH 去除。
利用 CNBr 或 NHS Sepharose FF 可偶 联内毒素底物如LAL,PMB,自动成亲合 层析介质结合内毒素。内毒素经常是多 利用核酸酶将核酸切成小片断， 用凝胶 聚体， 凝胶过滤层析可有效地将之去除。 过滤做精细纯化时便很容易去除了。
1
如何选择凝胶
生物分子下游纯化的对象一般包括蛋白、酶、重组蛋白、单抗、抗体及抗原、肽类、病毒、核酸等。纯化前首先需要测定 生物分子的各物理和化学特性，然后通过实验选择出最有效的纯化流程。 《测定——分子量、PI》
■当目标蛋白的物理特性如分子量、 PI 等都不清楚 时，可用 PAGE 电泳方法或层析方法加以测定。分 离范围广阔的 Superose HR 预装柱很适合测定未知 蛋白的分子量。用 少量离子交换介质 在多个含不同 pH 缓冲液的试管中，可简易地测出 PI，并选择纯化 用缓冲液的最佳 pH。 ■纯化 IgG 抗原最有效的方法是用活化偶联介质如 CNBr、 NHs activated Sepharose FF 偶联 IgG,再进 一步获取 IgG 抗原。 ■ HiTrap IgM 是用来纯化融合瘤细胞培养的单抗 IgM，结合量达 5mg IgM 。 HiTrap IgY 是专门用来纯 化 IgY，结合量达 100mg 纯 IgY。 离子交换层析有助进一步获各组份纯品。 另外， 多糖 药物需去除可引起过敏反应的蛋白质，传统 Sevag 方法用丁醇脱蛋白需反复数十次。阴阳离子交换法 可以一、两步快速去除多糖中残存的蛋白质。 SOURCE 5 、 15 、 30RPC 反相层析也很适合各种中 药有效成分的检测、 分离和放大制备。 由于中药的成 分非常复杂， SOURCE 反相层析可用范围为 pH114，并可用 1M NaOH，1M HCL 清洗、再生。比传 统硅胶反相层析更易于工艺优化及在位清洗，寿命 也更长。
内毒素及其去除
构建生物经济体系
打造生物经济旗舰
疏水与分子筛
疏水层析法利用高盐增加蛋白疏水性与介质结合，而在 高盐体系中内毒素由于脂质 A部分有很强的疏水性发凝 集，无法与层析介质结合，因此能够有效去除内毒素
分子筛是利用凝胶的网状结构根据分子大小进行分离的 一种方法。一般抗体分子量为几万道尔顿,而内毒素分子 量为几十万至上百万道尔顿,常是多聚体,因此利用分子筛 可以有效去除内毒素,但其处理量小,处理时间较长。
适用于亲水性蛋白的内毒去除，会使一些有毒的 Triton X-114 残存在蛋白溶液中
构建生物经济体系
打造生物经济旗舰
阴离子交换层析
离子交换层析的速度快、载量高、浓缩效应好 ,在早期下游纯化中担当重要角色。一般而言, 内毒素比蛋白质在阴离子交换介质上的结合强 很多,分子量越小的内毒素结合得越强,多数要 在柱再生(1M氯化钠) 或在位清洗(1M氢氧化钠 )时才从介质上洗脱下来
内毒素去除方法存在选择性差，样品回收率低等问题。下面主要介 绍几种生产中常用的方法
一
相分离法Triton X-114
二
阴离子交换层析
三
疏水层析与分子筛
四
亲和层析
构建生物经济体系
打造生物经济旗舰
相分离法Triton X-114
此法用于较大重组蛋白质（rCK-bb、Rck-mb）中LPS的去除 ，经过三次相分离后，LPS从104 EU/ml降到了几个EU/ml， 去除率超过97%，蛋白的回收率大于90%。
内毒素在pH〉2时都是带负电。阴离子层析填料自身带 正电能够吸附内毒。可使用流穿模式，上样前样品PH控 制在目的蛋白PI以下，使其带正电。这样内毒素结合在 填料上，目的蛋白直接流穿
如二乙胺乙基（DEAE）阴 离子交换介质适于从碱性蛋 白质（即带正电的蛋白质， 如尿激酶）中去除内毒素，
内毒素去除工艺
内毒素去除工艺
内毒素是一种存在于细菌细胞壁中的毒性物质，对于许多领域的生物制药、食品加工和医疗保健等都是一个重要问题。
内毒素去除是一个关键的工艺，尤其在生物制药中非常重要，因为内毒素可能会对最终产品的安全性和有效性产生负面影响。
以下是一些常见的内毒素去除工艺：
1.细胞培养条件优化：通过调节培养条件，如温度、pH、营养物质等，可以减少内毒素的产生。
优化培养条件可以降低内毒素在生产过程中的生成量。
2.细胞壁破裂：利用物理或化学方法破裂细胞壁，释放细胞内的目标产物，同时也释放内毒素。
后续的纯化过程需要采取方法去除内毒素。
3.色谱分离技术：某些色谱技术（ 如离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和层析等）可以通过选择性地分离内毒素以及其他目标物质，从而实现内毒素的去除。
4.超滤/透析：利用超滤或透析技术，根据内毒素与其他物质在分子大小和性质上的差异，将内毒素从溶液中去除。
5.吸附剂：使用特定的吸附剂或树脂，如多肽、多糖、凝胶等，可以将内毒素选择性地吸附并去除。
6.免疫吸附法：利用针对内毒素的抗体或亲和层析树脂，将内毒素从混合溶液中特异性地吸附去除。
7.端毒素化工艺：有些生物制品经过特定化学修饰，将内毒素转化成无毒的形式。
在实际应用中，通常需要结合多种方法来有效去除内毒素，以确保最终产品的质量和安全性。
不同的产品和工艺可能需要定制化的内
毒素去除方案。
在生产过程中，严格的质量控制和监测是至关重要的，以确保内毒素的去除效果和产品质量的稳定性。
如何去除内毒素
3.2.1原本法用于去除实验用玻璃器皿上的内毒素。
将玻璃器皿置于烤箱中，加热到250℃，持续30min，即可去除内毒素。
3.2.2方法与步骤1、内毒素去除效率的评估（1）制备浓度分别为1000和1000EU/mL 的CSE溶液。
按内毒素测量方法检测这些溶液。
（2）向所有待去除内毒素的玻璃器皿滴入1mL的CSE溶液。
（每种类型的玻璃器皿至少有3EU的CSE）。
（3）将玻璃器皿置放烤箱中，在60℃下，干烤持续30min，烘干，然后在烤箱中，250℃下，干烤30min。
（4）加入适量的LAL水，剧烈振荡5min，以清洗玻璃器皿，然后测量清洗后的LAL水中的内毒素的浓度。
（5）比较原来的内毒素含量和现存的内毒素浓度。
当内毒素含量至少减少了3—log时，该方法有效。
必要时，重复操作，去除内毒素。
用鲎度验法计算内毒素去除的百分比。
2、去除实验玻璃器皿上的内毒素确定可使内毒素玻璃器皿上的内毒素对于用来配置无同一内毒素溶液的玻璃器皿，重复操作，直至内毒素含量下降3—log。
（例如，1000 IEU和10000 10EU）数个加热循环后，用前述的鲎试验法，测定内毒素含量。
3、对照阴性对照：用只盛有LAL水的玻璃器皿，在250℃下，干烤30min并用LAL法测量内毒素的含量。
阳性对照：干燥（60℃，30min）每种玻璃器皿中的内毒素溶液，不经过干烤（250℃，30min）去内毒素的操作，然后测定其内毒素质量。
3.2.3质控与提示（1）保烤箱散热均匀，为此，在操作过程中，可将玻璃器皿放置在烤箱中的每一层上，当温度在250℃后，温度的波动不要超过±15℃。
（2）用含100EU的内毒素过行的检测，可用来确定去内毒素的效率。
用含10000EU的内毒素进行的检测，可用来确定对内毒素含量较高的器皿去除内毒素的效率。
（3）如果如果不理想，可增加每一次操作的时间和操作次数。
（4）其他技术适用于培养基的内毒素，例如，超滤，反向渗透，但比较昂贵。
去除内毒素的研究及临床应用(一种新型亲和层析膜内毒素清除初步应用)
去除内毒素的研究及临床应用(一种新型亲和层析膜内毒素清除初步应用)周康;刘康达;陈梅芳;谢倩;张尤历;商振华;郭为【期刊名称】《镇江医学院学报》【年(卷),期】1998(8)4【摘要】随着生物工程及生命医学及制药工业迅速发展,尤其许多重要的产品被开发,多种生物原物质可通过生物工程获得,但其表达工程菌往往是大肠杆菌.产品易受内毒素污染,迫切需要一种高效能的用于去除内毒素的色谱柱。
这是目前生物技术产品中有待解决的问题之一。
因此,需要一种能清除内毒素的有效手段,既不破坏原有的有效成份,又能够完全地把内毒素去除。
亲和色谱法是利用物质的生物学特性来表达到物质的分离,是去除内毒素的一种期望中较为理想的方法。
我们以大孔纤维膜（尼龙66）为介质,以已二胺为间隔臂.以组氨酸或多粘菌素B为配基.制备成亲和层析膜.同时以应用较为灵敏的定量内毒素的检测技术（最低检测限达0.03Eu ／ml,最高检测限达0.5Eu／ml）对不同产品制剂内含内毒素去除前后进行定量检测分析。
初步进行了自来水含内毒素的清除率,它能达到99.86％,对胸二磷胆碱纳（CytidineDiphosphateCholineCDP-C）内含内毒素的清除率达95.3％,而其药品的有效成分保留车在88％～95.5％。
另外,对此膜的一次再生率也能达到99.8％的内毒素清除率。
初步结果认为它是在目前方法手段中只为理想的一种清除内毒素的方法。
它的最大优点就在于“亲和”对内毒素能较好地予以吸附.对其他有好成份一律不予吸附或吸附量甚微。
同时.保留?【总页数】2页(P465-466)【关键词】内毒素清除;亲和层析膜;生物技术产品【作者】周康;刘康达;陈梅芳;谢倩;张尤历;商振华;郭为【作者单位】上海医科大学附属中山医院实验研究中心;中科院大连化学物理研究所【正文语种】中文【中图分类】TQ464;TQ460.64【相关文献】1.聚酰胺亲和膜色谱用于去除内毒素的研究Ⅱ.去除条件最佳化和应用 [J], 商振华;周冬梅;郭为;于亿年;周良模;潘明臣;周康2.一种新型兔源内毒素结合蛋白的分离纯化及体外生物活性的初步研究 [J], 葛晓冬;刘友生;王晓东;潘峰;周萍3.亲和层析法去除新生小牛血清内毒素的初步研究 [J], 宋崴4.去除内毒素的研究及临床应用（一种新型亲和层析膜内毒素清除初… [J], 周康;商振华5.应用亲和层析法去除内毒素的研究 [J], 赵克胜;孔海燕;张小纯因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
去除内毒素的方法总结
内毒素的去除是做蛋白表达时至关重要的一步,同时也是非常棘手的问题，本文就针对内毒素的去除方法以及各方法的注意事项进行了归纳总结。
一、什么是内毒素？内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的脂多糖。
内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来，所以叫做内毒素。
所有能引起热原反应的物质称为热原。
药品中的热原主要是细菌内毒素。
一般可以认为：细菌内毒素是热原，但热原不等于细菌内毒素。
二、细菌内毒素的理化性质•耐热性：彻底灭活需250℃高温干烤一小时•水溶性：可溶于水，生产中可用无热原水冲洗以除去热原。
•不挥发性•被吸附性：可被活性碳吸附•被酸碱破坏： 0.1M HCl或0.1M NaOH 浸泡4小时•被氧化剂破坏：30%双氧水浸泡4小时，可完全破坏三、器皿中内毒素的去除:a.干热法•适用对象：耐热物品如玻璃制品、金属制品等生产过程中所用的容器•处理方法： 180℃3～ 4h 或 250℃ 30min～ 2h•注意事项：• 1.在干烤前，被加热的玻璃器皿上最好不要有水珠，否则可能会使玻璃器皿损坏。
• 2.烘烤结束后，玻璃器皿不要马上从电热烘箱中拿出，要等温度适度降低之后才可以拿出，以免因温差太大而造成玻璃器皿损坏。
• 3.器皿上不能含有纸质或塑料制品，以免烘烤时燃烧或熔化。
b.化学降解法•适用对象：主要用于去除玻璃、塑料和其它高分子材料器皿上的内毒素。
•处理方法：常用3～5％双氧水、重铬酸钾硫酸清洁液（重铬酸钾∶硫酸∶水常用配比1∶1∶10 或1∶2∶8 ）、0.1M HCl或0.1 M NaOH浸泡去除。
一般处理4h以上。
•注意事项：佩戴防护用具，防止皮肤直接接触。
四、溶液中内毒素的去除但是，各种去内毒素的方法不是孤立的，可以相互结合使用。
比如，如果液相分离法得到的蛋白内毒素水平未达标，可以接着利用分子筛法进一步去除内毒素。
五、作为目前去内毒素常用的方法，液相分离法的注意事项值得我们重视1.液相分离方法应用于蛋白纯化中内毒素的去除a.目的蛋白上样后，用预冷的基础溶液+1% Triton X-114缓慢淋洗柱子，直至A280数值稳定不变；b.用预冷的去内毒素基础溶液淋洗柱子，直至A280数值达到基线，稳定不变；c.用各梯度去内毒素的洗脱液洗脱，收集各洗脱液于去内毒素的收集管中。
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本产品有严格的生产质量控制标准，我们力求为您提供最满意的产品、最完备的技术支
持和服务，欢迎业内朋友交流合作。
除了为您提供各种包装规格的高效去内毒素亲和填料 FF 外，我们还提供它各种填料、 柱子和其他服务，包括： 1、填料和柱子选择以及预实验 2、开发各种生物大分子的分离纯化工艺，为您解决分离纯化的难题 3、帮助您合成特殊要求的色谱填料，包括偶联各种配基 4、按客户要求提供各种填料及规格的预装柱，并配相应接口用于各种纯化设备。 5、代理各种进口填料，为客户提供最专业的售前和售后服务。
高效去内毒素亲和填料 FF
一、 简介
内毒素在生物样品中用常规的方法很难去除，而且有的时候它还会和生物制品结合，
这样去除就变得非常复杂，尤其是用原核表达的产品，内毒素含量有时候高达上万 EU/mg，
这样更增加去除的困难。
国际公认最好的方法就是把某些物质偶联到琼脂糖凝胶上做成特异吸附内毒素的亲和
填料，这样它可以特异吸附内毒素，而样品本身不损失，我们就是把这类物质偶联到高度交
结果：
浓度（mg/ml） 内毒素 (Eu/mg)
处理前的样品 2.90
5000-7000
处理后的样品 2.90 <5
四、 亲和填料应用的注意事项： 1、 该亲和填料每次使用前都需用 Buffer 1 处理，包括第一次使用时。 2、 配制缓冲液要用无内毒素的注射级用水，配制过程要防止引入内毒素。 3、 适当延长填料与样品溶液的处理时间可以加大内毒素的吸附量。 4、 如果用磁力搅拌要注意转速别太快，避免搅碎填料。 5、 样品如果本身是带负性电荷，为增加样品回收率，样品中可以加<0.2M NaCl。 6、 样品 pH 可以在 7-9 范围内。 7、 样品内毒素太高，超过填料处理量，需要稀释样品找到内毒素的范围，和经去除后内毒
联的琼脂糖凝胶上制备高效去内毒素亲和填料 FF.
本公司将 USP 级别的内毒素的类似底物偶联到药品级的高度交联的琼脂糖凝胶上，可
以特异去除病毒，核酸和蛋白等样品中的内毒素。由于采用新的偶联的方法，这种填料刚性
更好，特异性更强，载量更高，稳定性好，样品回收率更高。它能耐受 37 度高温，5 天性
能不会降低。
粒径 (μm)
90 90 90 90 90 90 90
耐压 MPa 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
最大流速 (cm/h) 300 300 300 300 300 300 300
北京韦氏博慧色谱科技有限公司 电话：010-67804548 13911415318：联系人:韦新桂 E-mail: weixingui@ 公司网站：/ 传真：010-67804548。
内毒素的类似底物
4mg /ml 10000-14000Eu/ml 平均 50μm 300cm/h 3-10，在位清洗时 pH 范围可到 2-11 常温 +4~8℃ 20%乙醇
二、 应用范围 去除各种溶液样品中的内毒素。
三、 应用实例 实验名称：去除内毒素
实验步骤：
1． 将高效去内毒素亲和填料 FF 在滤器（G3 砂心漏斗也可以）中先用 1－2 倍填料体
本产品一般直接加入到样品中以去除其中的内毒素，而不必装柱，使用方便，非常有
效，而且很容易放大。此外在使用过程中配基不脱落，安全可靠，可以重复使用。
填料特性： 特点 基质
特异性强，无脱落，样品回收率高 琼脂糖凝胶
配基 配基密度 吸附载量 亲和填料的颗粒大小 最大流速 pH 范围 使用温度 保存温度 保存液体
产品目录：
货号
CS-L02-0A CS-L02-0B CS-L02-00 CS-L02-01 CS-L02-02 CS-L02-03 CS-L02-04
产品名称
高效去内毒素亲和填料 FF 高效去内毒素亲和填料 FF 高效去内毒素亲和填料 FF 高效去内毒素亲和填料 FF 高效去内毒素亲和填料 FF 高效去内毒素亲和填料 FF 高效去内毒素亲和填料 FF
缓冲液 1 组成：1%脱氧胆酸钠，20 mM磷酸盐缓冲液，pH7.0。配制：称取Na2HPO4.12H2O 2.43g，NaH2PO4.2H2O 0.25g，NaCl 4.5g，脱氧胆酸钠 5.0g，加注射用水溶解 并定容到 500ml
注：上述各步操作中用到的玻璃仪器、滤器均要 250℃干烤 2h；0.2µm 滤膜要用 0.1M NaOH 浸泡过夜后 121℃高压灭菌 30min。 如果觉得上面的方法处理很麻烦，而且时间长，可以把填料装填到色谱柱中，然后用 0.1M NaOH 平衡 5 个床体积，然后用注射用水洗 30 个床体积，然后上样，把流穿的样 品接到上样的容器中循环去除内毒素，流速控制在 2ml/min，这样 5-8 个小时可去除内 毒素。不过这样的方法不如把填料和样品混合震荡的方法，原因在于有时候内毒素和样 品结合，需要较长时间去除。脱氧胆酸钠溶液低温容易成胨状，使用时温度可以到 30 度，避免流不动堵柱子或漏斗。
素的范围对照，就可以知道效果，如果一次去除不完全，可以重复，直到合格为止。 8、 该亲和填料保存条件为 20%乙醇，+4~8℃。
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北京韦氏博慧色谱科技有限公司 北京经济技术开发区同济中路甲 7 号 B 座 931 室 邮政编码：100176 TEL：010-67804548 13911415318 FAX：010-67804548
定货请参考光盘中的定货须知。购买本公司产品可获得一张内容非常丰富的纯化光盘，包括 表达，提取，分离，酶切等操作指南以及各公司纯化产品的说明书及手册，是生物大分子分 离纯化难得的学习材料。
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包装
5ml 预装柱 20ml 预装柱
10ml 25ml 100ml 500 ml 大包装
载量 EU/ml 10000-14000 10000-14000 10000-14000 10000-14000 10000-14000 10000-14000 10000-14000
特性 及应用 去除内毒素 去除内毒素 去除内毒素 去除内毒素 去除内毒素 去除内毒素 去除内毒素
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积的 Buffer 1 抽洗，再用 3－5 倍凝胶体积的 Buffer 1 将凝胶充分混匀，保持 10min， 用 50－100 倍凝胶体积的注射水分 10－20 次抽洗。 2． 根据样品溶液中内毒素的含量加入一定量经上述处理的高效去内毒素亲和填料 FF （通常比例为一份样品用 1/2 或 1/3 的填料），于三角瓶中 4℃、150rpm 振荡 48h。 3． 将以上样品无菌过滤，测内毒素含量。