酵母双杂交技术
酵母双杂交
酵母转录因子（Gal 4）
与BD-fusion ---诱饵蛋白（bait protein ） 与AD-fusion ---猎物或靶蛋白（prey or target protein）
报告基因（reporter gene）
---Lac Z（编码β -半乳糖苷酶）
报道株
经改造的、含报告基因的重组质粒的宿 主细胞。 酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有 许多优点:
酵母双杂交系统
一、酵母双杂交系统的简介
酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system) 是由Fields和song等在1989年提出的一种在真 核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋 白质相互作用的遗传系统。 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细 胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许 多真核生物的转录因子都是由两个可以分开 的、功能上相互独立的结构域组成的。
DNA结合结构域(BD)
(DNA binding domain)
转录激活因子
转录激活结构域(AD) (activation domain)
•这两个结构域各具功能，互不影响,
•单独存在时都没有转录激活的功能，
•只有二者在空间上充分接近时，才表现出一个完整的
激活特定基因表达的激活因子的功能。
二、酵母双杂交系统的建立
五、酵母双杂交的应用
酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的， 研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、 瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检 测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间 关系的技术。
大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用 来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也 可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互 作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。
酵母双杂交
酵母双杂交酵母双杂交（筛库）pGBK-gene 转化酵母1. 酵母细胞（AH109）划线，YPDA平板，30°C烘箱培养18-20小时。
2. 挑取单细胞菌落，在YPDA培养基中，30°C摇床培养18-20小时至菌液饱和。
3. 次日，取饱和的酵母培养液5ml转接至100mlYPDA培养基中，30°C摇床培养2h，测定OD600，直至OD600达到0.5左右。
4. （超净台下工作，下同）将上述菌液分装在2只50ml离心管（灭菌）中，室温下3000rpm离心5min。
5. 弃上清，重悬于20ml无菌水中，3000rpm离心5min。
6. 弃上清，重悬于10ml 1×TE/LiAc溶液中，3000rpm离心5min。
7. 弃上清，重悬于500μl 1×TE/LiAc溶液中，室温温育10min。
8. 取eppendorf管，每管加100μl酵母细胞、5μl鲑鱼精DNA（10mg/ml，用之前沸水煮2-3min，立即放冰上）、15μl DNA（pGBK连接的基因）。
9. 加入280μlPEG/LiAc 溶液，30°C放置45min（可摇）。
10. 42°C热激10min，立即放冰上2min。
11. 室温下6000-8000rpm离心20~30s，去上清。
12. 重悬于500μl无菌水中，取100-200μl涂在SD-trp板上，30°C烘箱培养48-72h。
酵母大规模转化AD文库1. 挑取上述SD-trp板上的pGBK连的基因转化子，YPDA培养基中培养至饱和。
2.将上述转化子转接至200mlYPDA培养基中，30°C培养至OD600 0.5-0.6左右。
3. 离心收集菌体，20ml无菌水洗涤，3000rpm离心5min。
4. 去上清，重悬于20ml 1×TE/LiAc溶液中，3000rpm离心5min。
酵母双杂交实验
酵母双杂交实验酵母双杂交相关实验方法一、酵母总DNA提取方法（蜗牛酶法）1。
酵母质粒提取试剂bufferi0.9mol/lsorbitol0.1mol/ledtabufferii50mm/ltris20mm/ledtabufferiii10mm/l tris1mm/ledta2、操作步骤：（1）收集新鲜细菌，加入150μlbufferi、25μL蜗牛酶（30mg/ml）（2）37℃水浴1小时。
(3)10000rpm离心10min，去上清，沉淀中加入250μlbufferii。
(4)加入25μl10%sds，65℃水浴30min，每间隔5min中震荡一次。
(5)加入25μl5mol/l醋酸钾，冰浴60min。
(6)4℃12000rpm离心15min，取上清。
（7）向上清液中加入2-3倍体积的无水乙醇，充分混合，并在-20℃下静置1小时以上。
（8）取出，在4℃12000rpm下离心15分钟，丢弃上清液。
(9)加入150μlbufferiii溶解沉淀，用等体积苯酚/氯仿/异戊醇抽提。
(10)12000rpm离心15min。
（11）将上清液转移到新的离心管中，并添加6μl（10u/μl）核糖核酸酶，在37℃下放置30分钟。
（12）取上清液并添加等量的异丙醇。
（13）在4℃下静置10分钟超过1小时或过夜。
（14）在4℃下以10000 rpm离心5分钟。
(15)弃上清，并把沉淀溶于10μlbufferiii中。
二、小规模酵母转化1、酵母转化试剂：除PEG过滤灭菌外，其他转化试剂需要在与普通培养基灭菌相同的条件下进行高温高压灭菌。
(1)m醋酸锂（lithiumacetate）（2）聚乙二醇（PEG）分子量3350，浓度50%（w/V）（3）PEG/liac溶液的制备（即用）800μl50%peg100μl10×te100μl10×liac1ml总体积（4）1.1×TE/liac溶液（用于使用和制备）11ml10×TE（5）11ml10×liac（6）78mlddh202。
酵母双杂交ad自激活验证步骤
酵母双杂交ad自激活验证步骤
酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid）是一种常用的蛋白质相互作用研究技术。
下面是酵母双杂交AD自激活验证的步骤：
1. 构建酵母双杂交AD靶蛋白的表达载体：将目标蛋白的编码序列克隆到酵母双杂交AD表达载体中，将其与AD激活域相连，以使目标蛋白能够激活报告基因的表达。
2. 转化AD靶蛋白表达载体到酵母菌株中：通过酵母转化方法将AD靶蛋白表达载体导入酵母菌中，使其能够表达目标蛋白并激活报告基因。
3. 培养转化后的酵母菌株：将转化后的酵母菌株分别培养在选择性培养基上，其中包含AD靶蛋白表达载体所对应的选择性标记物，以筛选出成功转化的酵母菌株。
4. 鉴定AD自激活：通过观察报告基因的表达情况，若转化后的酵母菌株在选择性培养基上形成克隆，表明AD靶蛋白具有自激活能力。
此时需要通过相应的对照实验来确认AD靶蛋白的自激活性质。
需要注意的是，酵母双杂交中AD自激活验证的结果需要慎重解读，因为自激活可能会产生误报。
因此，在进行酵母双杂交实验时，通常需要配对对照实验来排除自激活的影响，以确保结果的准确性。
蛋白互作常用的研究方法
蛋白互作常用的研究方法
蛋白质互作常用的研究方法包括酵母双杂交技术、免疫共沉淀和GST pull-down实验。
1. 酵母双杂交技术：主要用来进行互作蛋白的筛选，缺点就是假阳性较高，所以需要进行结果验证，一般可采用免疫共沉淀或GST-pull down实验进
行验证。
2. 免疫共沉淀：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内相互作用的有效方法。
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
当用预先固化在argarose beads上的蛋白质A 的抗体免疫沉淀A蛋白，那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉
淀下来。
再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行Western blot检测，进而证明两者间的相互作用。
3. GST pull-down实验：是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试
验技术。
其基本原理是先构建靶蛋白-GST融合蛋白载体，然后进行体外表
达及纯化。
但是也存在一定局限性。
这些方法各有优缺点，应根据研究目的和具体情况选择合适的方法。
酵母双杂交技术
酵母双杂交常规技术一．双杂交系统原理及应用范围蛋白质之间的互作是很多反应机制分子水平的核心动作，如DNA合成、转录激活、蛋白质翻译、蛋白质定位和信号转导等所有的的反应的完成都涉及到蛋白质复合体的作用。
而随着酵母双杂系统的成熟和完善，其在蛋白质互作研究中的应用越来越广泛。
酵母双杂交系统是基于转录因子的典型结构特征所建立的，它利用了酵母的转录因子GAL4基因产物，该蛋白拥有两个典型的转录因子结构域DNA结合结构域（BD）与转录激活结构域（AD）。
前者结合GAL1启动子区的DNA序列，后者则激活转录（Fields and Song，1989）。
Fields和Song分别构建了含有含有编码GAL4 DNA结合结构域（GAL4BD）和GAL4转录激活结构（GAL4AD）序列的载体。
将我们所要研究的目的基因分别装载到这两个质粒载体中，两个结构域序列则分别与基因的ORF进行融合。
当转入相应酵母菌株后，若在酵母内表达的不同蛋白发生互作，则将使GAL4-BD和GAL4-AD相互靠近结合，再进一步与上游激活序列结合，激活相应报告基因（report gene）的表达。
特点与优点酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。
酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点：（1）作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。
（2）检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。
（3）检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。
（4）酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。
局限性和存在的问题酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效和快速的方法，有多方面的应用，但仍存在一些局限性。
(完整版)酵母双杂交原理
酵母双杂交系统原理酵母双杂交系统(Yeast Two-hybrid System)由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。
典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA 结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。
前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。
二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。
而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。
酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。
主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。
上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。
融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。
例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)，而GAL4-ad没有。
因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。
双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。
报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。
最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。
〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。
〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。
一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。
酵母双杂交技术
缺点： （1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白 质－蛋白质相互作用； （2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合， 而可能有第三者在中间起桥梁作用； （3）必须在实验前预测目的蛋白是什么， 以选择最后检测的抗体，所以，若预测不 正确，实验就得不到结果，方法本身具有 冒险性。
酵母单杂交技术
HIS3：筛选标记
Serial analysis of gene expression
AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA
Isolate SAGE tags
Link tags together and sequence
Quantify Tags and Determine Patterns of Gene Expression
BiFC技术原理将荧光蛋白在某些特定的位点切开，形成不发荧光的N和C 端2个多肽，称为N片段(N-fragment)和C片段(C-fragment)。 当这 2 个荧光蛋白的片段分别 连接到 1 组有相互作用的目标 蛋白上，在细胞内共表达或体 外混合这 2 个融合蛋白时，由 于目标蛋白质的相互作用，荧 光蛋白的 2 个片段在空间上互 相靠近互, DNA chip, or DNA microarry） ：生物芯片的一种。它是将DNA分子固定于支持物上，并与标记的样品杂交
，通过自动化仪器检测杂交信号的强度来判断样品中靶分子的数量，进而得知 样品中mRNA的表达量，也可进行基因突变体的检测和基因序列的测定，为 进一步了解基因间的相互关系及基因克隆提供有用的工具 GeneChip 将探针固定在特定的固体基质上，而原来印记在膜上的目标 DNA或RNA进行标记，然后进行的大规模的杂交。
5、利用EST数据库发现新基因
酵母双杂交技术原理
酵母双杂交技术原理
酵母双杂交技术是一种DNA定向克隆的分子生物学技术，又称为抗性转移技术。
它利用细胞壁抗生素的抗性性质作为分子生物学过程的引物，分子生物学的原理是利用噬菌体感染酵母的策略，将目标DNA 片段转移到仅有两种抗性的酵母菌中去。
具体的操作步骤如下：首先制备携带乙醇容抗体型剂量胞壁抗生素的噬菌体，再将酵母菌与这些抗生素装载的噬菌体混合放置，此时目标DNA会受到噬菌体的选择性感染，而不会感染来源酵母菌，进而将目标DNA进行吸收，最后再使酵母双向繁殖，最终形成携带抗性基因的酵母菌。
酵母双杂交的原理
酵母双杂交的原理
酵母双杂交(YeastTwo-hybridSystem，Y2H)是一种具有实验性方法的蛋白质相互作用实验，它可以用来验证和确定两个蛋白在体内及体外之间存在相互作用。
这种蛋白质相互作用可以发生在体内，也可以发生在体外。
在这种实验中，使用的物质是由两个融合的蛋白质组成的双融合蛋白，一个蛋白是结合调控区或结合位点，另一个蛋白质是响应元件，它可以检测到调控区里结合的物质的存在，从而启动一系列的反应，其结果是显示双杂交蛋白中调控区是否与响应元件相结合。
二、酵母双杂交的原理
酵母双杂交的基本原理源于酵母菌的基因调控机制。
它的基本原理是，将一个结合调控区的蛋白（称为“结合蛋白”）与一个响应元件（称为“受体蛋白”）结合起来，当结合蛋白结合到调控区并激活响应元件时，酵母细胞就会对外在的细胞因子做出反应。
当结合蛋白结合调控区并激活响应元件时，酵母细胞就会产生一种光变化，从而表明蛋白质之间存在相互作用。
简单地说，酵母双杂交的原理是利用双融合蛋白将一个结合调控区的蛋白和一个响应元件结合在一起，当结合调控区的蛋白结合到结合调控区时，响应元件就会激活，酵母细胞就会产生一些外在细胞因子，如光变化。
从而可以检测到蛋白质之间发生相互作用。
三、酵母双杂交的应用
酵母双杂交技术的应用非常广泛，可以用来验证和确定蛋白质之
间的相互作用，也可以用来研究蛋白的结构和功能，并有助于发现新的药物靶标。
此外，它也可以用于研究基因调控机制，研究染色体的结构，以及研究蛋白质和核酸之间的相互作用等。
酵母双杂交系统原理
酵母双杂交系统原理酵母双杂交系统是一种常用的蛋白质相互作用研究方法，它通过酵母细胞内两个蛋白质的相互作用来筛选出蛋白质间的相互作用关系，从而揭示细胞内蛋白质相互作用的网络。
酵母双杂交系统的原理主要包括构建酵母表达载体、转化酵母细胞、筛选阳性克隆和验证蛋白质相互作用。
下面将详细介绍酵母双杂交系统的原理。
首先，构建酵母表达载体。
在酵母双杂交系统中，需要构建两个不同的表达载体，一个用于携带“诱饵”基因，另一个用于携带“靶标”基因。
诱饵基因编码的蛋白质与靶标基因编码的蛋白质是我们想要研究的两个相互作用蛋白。
这两个基因分别被插入到酵母表达载体的多个位点上，以便在酵母细胞内进行表达。
其次，转化酵母细胞。
构建好的酵母表达载体需要通过转化的方式导入到酵母细胞内。
在酵母细胞内，这两个载体会分别表达诱饵蛋白和靶标蛋白，从而在细胞内形成一种相互作用的条件。
接着，筛选阳性克隆。
经过转化后的酵母细胞需要进行筛选，以筛选出表达了诱饵蛋白和靶标蛋白的阳性克隆。
这一步通常通过对酵母细胞进行培养和筛选培养基来实现，只有表达了两个蛋白质的酵母细胞才能生长并形成克隆。
最后，验证蛋白质相互作用。
经过筛选得到的阳性克隆需要进行蛋白质相互作用的验证。
这一步通常通过蛋白质相互作用实验来进行，例如酵母双杂交实验、共免疫沉淀实验等。
通过这些实验，可以验证诱饵蛋白和靶标蛋白之间是否存在相互作用关系。
总的来说，酵母双杂交系统的原理是通过构建酵母表达载体、转化酵母细胞、筛选阳性克隆和验证蛋白质相互作用来揭示蛋白质间的相互作用关系。
这一方法在蛋白质相互作用研究中具有重要的应用价值，可以帮助科研人员更好地理解细胞内蛋白质相互作用的网络，从而为疾病治疗和药物开发提供重要的理论基础。
酵母双杂交步骤
酵母双杂交步骤酵母双杂交是一种常用的实验方法，用于研究基因之间的相互作用以及确定基因功能。
这种方法可以帮助科学家更好地理解生物学系统的复杂性，并为疾病的研究提供重要线索。
下面将介绍酵母双杂交的步骤及其意义。
进行酵母双杂交实验需要准备两个重要的构建：酵母表达载体和融合蛋白质的基因。
酵母表达载体通常包含启动子、选择标记基因和复制起点等元件，可以在酵母细胞中稳定表达外源基因。
而融合蛋白质的基因则是由研究人员设计合成，其中包含感兴趣的基因片段与激活结构域的融合。
将融合蛋白质的基因克隆到酵母表达载体中，构建成表达载体。
然后将这些表达载体分别转化到两株不同的酵母菌株中，形成两个亲本菌株。
接着，将这两个亲本菌株进行交配，使它们在同一酵母细胞内共存。
接下来，通过培养这个双杂交菌株，观察融合蛋白质是否发生相互作用。
如果两个融合蛋白质相互结合，可能会激活报告基因的表达，从而产生可检测的信号。
通过检测这些信号，可以初步判断这两个蛋白质之间是否存在相互作用。
为了验证这种相互作用的真实性，通常需要进行一系列的对照实验和进一步的验证。
例如，可以利用突变体蛋白质来确认相互作用位点，也可以通过共沉淀实验证明这种相互作用在细胞内是否真实发生。
酵母双杂交实验是一种简单而有效的方法，可以帮助科学家快速筛选出潜在的蛋白质相互作用，并为后续的深入研究提供基础。
通过这种方法，研究人员可以更好地理解生物学系统的复杂性，揭示基因之间的相互关系，为疾病的研究和治疗提供新的思路。
总的来说，酵母双杂交是一种重要的实验方法，对于生物学研究具有重要意义。
通过这种方法，科学家们可以揭示基因之间的相互作用，探索生物学系统的奥秘，为人类健康和疾病治疗提供新的思路和方法。
希望未来能有更多的科研工作者投入到这一领域，共同推动生命科学的发展和进步。
酵母双杂交实验原理
酵母双杂交实验是一种用于研究蛋白质之间相互作用的实验方法，它基于真核生物调控转录起始过程的机制。
酵母双杂交实验主要通过检测两个蛋白质在酵母细胞中的相互作用，从而揭示它们在生物体内的功能和相互作用。
酵母双杂交实验原理如下：
1. 构建重组质粒：首先，将目标蛋白质的表达载体与酵母双杂交系统中的启动子、激活子等调控元件进行重组，得到重组质粒。
2. 转化酵母细胞：将重组质粒转化到酵母细胞中，使目标蛋白质在酵母细胞中表达。
3. 筛选融合蛋白：利用选择性培养基，筛选出成功表达目标蛋白质的酵母细胞。
4. 鉴定蛋白质互作：将筛选出的酵母细胞进行混合、共培养，观察转录激活效应。
如果两个蛋白质之间存在相互作用，它们会结合在一起，形成完整的转录激活因子，从而激活报告基因的转录。
通过检测报告基因的表达水平，可以判断蛋白质之间是否发生相互作用以及作用强度。
5. 结果分析：根据实验结果，分析蛋白质之间的相互作用，进一步研究它们在生物体内的功能和调控机制。
目前常用的酵母双杂交系统有LexA系统和Gal4系统两种。
LexA系统基于原核蛋白LexA的DNA结合域和转录激活域，而Gal4系统则利用了酵母转录激活因子GAL4的DNA结合域和转录激活域。
这两种系统在实验操作和应用范围上略有不同，但均具有较高的灵敏度和特异性。
酵母双杂交技术
酵母双杂交技术引言酵母双杂交技术是一种常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。
该技术能够检测和分析细胞内发生的蛋白质-蛋白质相互作用，帮助科学家了解细胞信号传导、代谢途径和疾病发生机制。
本文将介绍酵母双杂交技术的原理、应用和优缺点。
原理酵母双杂交技术利用酵母细胞（通常是酿酒酵母）作为表达蛋白质的平台，通过操纵DNA序列，使得感兴趣的两个蛋白质分别与酵母细胞内的两个杂交域相连。
当两个蛋白质相互作用时，通过激活或抑制报告基因的表达来检测相互作用的发生。
具体来说，酵母双杂交技术包括以下几个步骤：1.构建融合基因表达质粒：将感兴趣的两个蛋白质的编码序列插入特定的表达质粒中，其中一个蛋白质与活化域相连，另一个蛋白质与靶向域相连。
2.转化酵母细胞：将构建好的表达质粒导入酵母细胞中，使其能够表达融合蛋白质。
3.遴选正交剪切位点：利用酵母细胞染色质中的正交剪切位点，确保融合蛋白质能够发挥其相互作用。
4.检测相互作用：通过报告基因（如荧光蛋白）的表达情况来检测融合蛋白质之间的相互作用程度。
一般来说，如果两个融合蛋白质相互作用，则报告基因被激活，表达结果可通过荧光显微镜观察或酵母细胞生长的特征来检测。
应用1.蛋白质相互作用网络研究：酵母双杂交技术可以帮助科学家构建蛋白质相互作用网络，了解细胞内不同蛋白质之间的相互关系和调控机制。
2.疾病相关蛋白质研究：酵母双杂交技术可以用于筛选和鉴定一些与疾病相关的蛋白质，帮助研究人员深入了解疾病的发生机制，并开发新的治疗方法。
3.药物靶点筛选：酵母双杂交技术可以用于筛选药物靶点，帮助研究人员发现新的药物靶点，从而加速药物研发过程。
优缺点酵母双杂交技术具有以下优点：•高通量：酵母双杂交技术可以同时检测大量蛋白质之间的相互作用，有助于加速研究的进程。
•对新蛋白质相互作用的发现：酵母双杂交技术可以帮助发现未知的蛋白质相互作用，有助于揭示新的细胞信号传导途径和代谢途径。
•相对简洁易行：酵母双杂交技术不需要复杂的实验设备，相对容易实施。
酵母双杂交原理和具体流程
酵母双杂交原理和具体流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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酵母双杂交是一种利用酵母遗传学方法来研究蛋白质相互作用的技术。
酵母双杂交点对点技术
酵母双杂交点对点技术
酵母双杂交点对点技术是一种常用的蛋白质相互作用研究技术。
该技术利用酵母细胞株中的双杂交系统，将感兴趣的蛋白质分别与两个互补的活化域（AD和BD）融合，形成“鱼钩”式融合蛋白，然后将这些融合蛋白引入酵母细胞中，使其与另一个具有互补的融合蛋白相互作用，从而形成一个新的转录激活因子，使酵母细胞表达可检测的标记物，从而间接地确定两个蛋白质之间的相互作用。
该技术具有高通量、高灵敏度、易于操作、能够筛选出大量的相互作用蛋白等优点，已经成为细胞信号传递、蛋白质相互作用研究的重要手段。
- 1 -。
酵母双杂交酵母单杂交酵母三杂交课件
酵母单杂交系统的应用
寻找与特定DNA序列相互作用的蛋白质
01
通过将待研究的蛋白质与转录因子融合，可以筛选出与特定
DNA序列相互作用的蛋白质。
研究蛋白质的功能
02
通过分析蛋白质与DNA的相互作用，可以深入了解蛋白质的功
酵母杂交技术的发展趋势
操作简便化
随着技术的发展，酵母杂交技术 的操作将越来越简便，使得更多 的实验室和研究人员能够利用该
技术进行研究。
应用广泛化
随着研究的深入，酵母杂交技术 的应用范围将越来越广泛，不仅 局限于蛋白质之间的相互作用研 究，还可以应用于转录因子活性
等方面的研究。
系统化与自动化
未来，随着技术的发展，酵母杂 交技术将逐渐实现系统化和自动 化，进一步提高实验的准确性和
该方法基于真核生物的转录调控机制，通过将两个蛋白质的 编码基因分别与酵母的转录激活因子基因GAL4的N端和C端 融合，形成两个融合蛋白，再观察这两个融合蛋白在酵母细 胞中的相互作用对转录的影响。
酵母双杂交系统的应用
基因表达调控研究
药物筛选
通过分析不同条件下蛋白质之间的相 互作用，了解相关基因的表达调控机 制。
酵母三杂交系统
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酵母单Байду номын сангаас交
酵母双杂原理
酵母双杂原理酵母双杂原理是指利用两种不同的酵母株，分别进行杂交，产生新的杂交酵母株的方法。
这种方法被广泛应用于酿造、面包制作、酒精生产等领域。
酵母是一种单细胞真菌，广泛存在于自然界中。
酵母可以利用葡萄糖等碳水化合物进行发酵，产生二氧化碳和乙醇等物质。
这种发酵作用被广泛应用于酿造、面包制作、酒精生产等领域。
酵母双杂原理的出现，是为了解决酿酒、面包制作等领域中出现的问题。
传统的酿造方法中，只使用一种酵母株进行发酵，容易出现酵母菌株的变异，导致酿造的质量下降。
而酵母双杂原理可以产生新的杂交酵母株，这些酵母株具有更好的性能和更强的适应性，可以提高酿造、面包制作的效率和品质。
酵母双杂原理的具体操作方法是：先分别选取两种不同的酵母株，进行培养和筛选。
然后将这两种酵母株进行杂交，产生新的杂交酵母株。
最后对杂交酵母株进行筛选和培养，获得具有更好性能的酵母株。
酵母双杂原理的应用非常广泛。
在酿酒领域中，利用这种方法可以产生更好的酵母株，提高酒的品质和产量。
在面包制作领域中，利用这种方法可以产生更好的酵母株，提高面包的质量和口感。
在酒精生产领域中，利用这种方法可以产生更好的酵母株，提高酒精的产量和纯度。
除了以上领域，酵母双杂原理还可以应用于其他领域，如生物医学、生物能源等领域。
在这些领域中，酵母双杂原理可以产生更好的酵母株，提高生产效率和产量，为人类的生产和生活带来更多的福利。
酵母双杂原理是一种非常重要的酵母育种方法，可以产生更好的酵母株，提高生产效率和产量。
随着科技的不断进步，相信酵母双杂原理将会在更多的领域中发挥作用，为人类创造更多的福利。
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酵母双杂交系统
1．原理
酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。
研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的
结构域(domain)组成的。
例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113
个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。
GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而
转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。
但是，单独的DNA结合域不
能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只
有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。
2．试验流程
酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细
胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为: 2．1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建
成诱饵质粒。
2．2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。
2．3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。
2．4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱
饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。
利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。
3．特点
优点
蛋白--蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。
酵母双杂交系统的建立
为研究这一问题提供了有利的手段和方法。
缺点
尽管该系统己被证实为一种非常有效的方法，但它也有自身的缺点和问题。
1、它并非对所有蛋白质都适用，这是由其原理所决定的。
双杂交系统要求两种杂
交体蛋白都是融合蛋白，都必须能进入细胞核内。
因为融合蛋白相互作用激活
报告基因转录是在细胞核内发生的。
2、假阳性的发生较为频繁。
所谓假阳性，即指未能与诱饵蛋白发生作用而被误认为是阳性反应的蛋白。
而且部分假阳性
原因不清，可能与酵母中其他蛋白质的作用有关。
3、在酵母菌株中大量表达外源蛋白将产生毒性作用，从而影响菌株生长和报告基因的表达。
使用酵母双杂交技术应注意的问题
真正明了酵母双杂交技术的主要原理及筛选方法是进行酵母双杂交实验的前提，构建成功的诱饵质粒及大量的材料准备是进行酵母双杂交实验的保证。
只
有明了双杂交的原理，才有可能设计实验进程、才能有目的的进行材料准备，
并能对实验结果作出预测与分析，尤其要对具体实验中各种选择性压力培养基
的使用目的要十分清楚。
大量的材料准备、较长的实验流程是酵母双杂交有别
于其他实验的特点，而其操作技术本身并不十分困难。
特别应提出的是，一个
阳性克隆的编号往往要被反复记录多次，因此，要时时注意编号的正确性。
另外，若从公司购得待筛选的酵母cDNA文库，应注意不同的公司有不同的产品，且各公司的产品不断更新换代，要认真阅读实验指导手册，以防出现失误。
4．应用
研究已知蛋白间的相互作用、寻找在蛋白—蛋白相互作用中起关键作用的结构域、寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白。
相信随着分子生物学技术的发展与推广，酵母双杂交技术在今后的蛋白质组学研究中将发挥更大的作用。
酵母双杂交系统操作方法
LexA酵母双杂交系统简介
一、LexA酵母双杂交系统的设计原理
报告质粒p8op-LacZ的GAL4 UAS编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活剂的
情况下，报告基因LacZ的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3，可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因组DNA上。
质粒pLexA的筛选标志为HIS3，在双杂交系统中用于表达DNA-BD(202个氨基酸残基组
成的LexA蛋白)与目标蛋白(钓饵，Bait)的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子
ADH1的调控，选择与报告基因的操纵子LexA×8结合。
质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoR I与Xho I)上游，含有SV40核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及AD(来自于E.coli的88
个氨基酸残基组成的B42蛋白)等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。
在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu，它与LacZ报告基因具有相同的
操纵子-LexA，但两者启动子不同。
根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性，即可激活报告
基因的转录和表达。
分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体和pB42AD质
粒载体的多克隆位点中，然后共同转入含有报告基因的酵母菌株，如果蛋白X与Y能相互
作用，则启动报告基因的转录和表达，通过检测报告基因的表达情况，就可以间接反映蛋
白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。
如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库，则可用X从该文库中筛选出能与其相互
作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。
二、商品化酵母双杂交系统的组成
1. 载体质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库
2. 酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侣菌株）
3. 大肠杆菌菌株：E.coli KC8株
4. 对照质粒：
质粒用途
pLexA-53，pB42AD-T 阳性对照
pLexA-Pos(LexA/GAL4 AD融合蛋白〕阳性对照
pLexA-Lam(LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用) 假阳性检测质粒
5. 引物：
pLexA测序引物及pB42AD测序引物。
三、酵母双杂交实验的基本流程
1. 将报告基因p8op-LacZ转化酵母EGY48菌株，用培养基SD/-Ura筛选。
2. 同时构建或扩增DNA文库，并纯化足够的质粒以转化酵母细胞。
3. 构建DNA-BD/靶蛋白质粒pLexA-X，作为钓饵(bait)。
4. 将上述钓饵质粒pLexA-X转化EGY48(p8op-LacZ)细胞株，用SD/-His/-Ura筛选；并用固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Ura检测此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活报告基因的活性，以及对酵母细胞是否具有杀伤毒性。
转化质粒选择培养基克隆生长情况说明
(含有Gal/Raf)
pLexA-Pos SD/-His，-Ura 蓝阳性对照
pLexA SD/-His，-Ura 白阴性对照
PlexA-X SD/-His，-Ura 白没有直接激活活性
PlexA-X SD/-His，-Ura 蓝具有直接激活活性
PlexA-X SD/-His，-Ura 菌落不能生长酵母细胞毒性
4-1. 如果pLexA-X -半乳糖苷酶的信号作用。
能够自动激活报告基因，则设法去除其激活活性部位、或者将LacZ报告基因整合入基因组，减少
4-2. 如果pLexA-X虽然不会自动激活报告基因，但对酵母宿主细胞有毒性，则需要与纯化的文库DNA同时转化酵母。