微生物限度方法学验证 ppt
微生物限度方法学验证
微生物限度检查方法学验证一、检验方法依据微生物计数法（中国药典2015年版四部1105）；控制菌检查法（中国药典2015年版四部1106）；非无菌药品微生物限度标准（中国药典2015年版四部1107）；抑菌效力检查法（中国药典2015年版四部1121）检查。
表4试剂稀释液：（1）pH6.8取，摇匀，既得。
（2）0.9%（3）0.05用。
（420ml徐徐滴入。
1细菌、霉菌、酵母菌接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，培养48小时。
上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养7天，加入5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液（用带有无菌棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管）用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。
2控制菌接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时。
用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu的菌悬液。
菌悬液在室温下放置应在122.130～35℃培养48小时，计数；取白色念珠菌、黑曲霉1ml(内含菌约50～100cfu)，注入无菌平皿中（取用黑曲霉时应注意自身安全），立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23～28℃培养72小时，计数。
同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验，作为对照。
其大小、形态应与对照培养基一致，且数量应不小于对照培养基的70%。
细菌、霉菌及酵母菌培养基适用性检查证明此批次培养基可以准确的检测出相应微生物情况。
微生物限度检查法
微生物限度检查法微生物限度检查在环境的洁净度10000级和局部100级的单向流空气区域内进行，其全过程应严格遵守无菌操作，以防再污染。
单向流空气区域、工作台面及环境必须定期按国家《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌测试方法》现行标准进行洁净度验证。
隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
灭菌和培养温度：细菌培养温度为30～35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23～28℃；控制菌培养温度为35～37℃检验量：检验量指供试品一次检验的用量。
一般为10g或10ml；化学药膜剂为100cm2；贵重或微量包装的药品可酌减（不得少于3g）。
检查沙门菌的供试品其检验量增加10g或10ml。
一般随机抽样不少于检验用量（2个以上最小包装）的3倍量。
供试液的制备：用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制备供试液或选用适宜的乳化剂、分散剂、中和剂制备供试液；其用量应验证，在该检验条件无抗菌作用。
供试液制备妥后不得超过1h就加入检验用培养基具抑菌活性的供试品当供试品具有抑菌活性时，应将供试液中的抑菌活性消除后，方能依法检查。
常用的方法有：⏹稀释法——降低供试品的相对浓度⏹薄膜法——利用体积差异分离⏹中和法——利用化学（生物）专属性灭活⏹离心法——利用沉降系数差异分离一、微生物限度检查法验证对药品进行微生物限度检查法时，首先应进行检测方法的验证。
如细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认该计数方法是否科学、准确、客观。
若供试品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。
验证时，按供试液的制备，细菌、霉菌和酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。
对各试验菌的回收率应逐一进行验证。
验证用菌株及菌液的制备菌株大肠埃希菌CMCC（B）44102、金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003、枯草芽孢杆菌、CMCC（B）63501白色念株菌CMCC (F) 98001、黑曲霉菌CMCC(F)98003 。
微生物限度检验方法验证__概述说明
微生物限度检验方法验证概述说明1. 引言1.1 概述微生物限度检验方法验证是一项重要的实验技术，用于评估和确认微生物对产品的影响程度和存在情况。
它可以帮助我们了解产品中是否存在有害微生物，并确保产品在使用过程中的安全性。
本文旨在介绍微生物限度检验方法验证的概念、重要性以及一般流程，并详细介绍常见的验证技术及其特点。
1.2 文章结构本文将分为五个部分进行阐述。
首先，在引言部分可以了解到微生物限度检验方法验证的概述、目的和文章结构。
接下来，在第二部分中探讨微生物限度检验方法验证的重要性，包括其背景与意义、验证方法的必要性以及验证结果的影响和应用。
第三部分将介绍微生物限度检验方法验证的一般流程，包括设计验证方案和实验步骤、样品的准备与处理，以及实验操作及数据分析。
在第四部分中，则具体介绍常见微生物限度检验方法验证技术，包括营养琼脂培养基平板计数法验证方法、膜过滤法验证方法以及PCR法验证方法。
最后，在第五部分中进行总结，对微生物限度检验方法验证的重要性进行归纳，并展望未来的发展方向。
1.3 目的本文的目的是为读者提供一个清晰全面了解微生物限度检验方法验证的文章。
通过介绍其概述、重要性、一般流程和常见技术，希望读者能够理解微生物限度检验方法验证在产品质量控制中的作用，并对未来方向有所思考。
同时，本文也为从事相关研究和实验工作的科研人员提供了参考和指导，以提高微生物限度检验方法验证技术的应用水平。
2. 微生物限度检验方法验证的重要性2.1 微生物限度检验的背景和意义微生物限度检验是一项重要的质量控制方法，用于评估药品、食品、化妆品以及其他消费产品中是否存在病原微生物和致病菌。
微生物污染可能引发严重的健康问题，包括细菌感染、传染病传播和中毒等。
因此，确保产品符合相关标准和法规对于保护公众健康至关重要。
2.2 验证方法的必要性验证微生物限度检验方法的准确性和可靠性是非常必要的。
通过验证方法，可以确认该方法能够准确地检测出有害微生物存在，并排除误报或漏报的可能性。
药品微生物限度检测技术PPT课件
检
喷雾剂供
查
试品
1.4.2供试品检查
非
无 菌
① 平皿法
平皿法包括倾注法和涂布法
产
品 微 生 物 限 度 检 查
除另有规定外， 取规定量供试 品，按方法适 用性试验确认 的方法进行供 试液制备和菌 数测定，每稀
培养和计数 ：除另有规定外， 胰酪大豆胨琼脂培养基平板 在30～35℃培养3天，沙氏葡 萄糖琼脂培养基平板在20～ 25℃培养5 天，观察菌落生 长情况，点计平板上生长的 所有菌落数，必要时可适当 延长培养时间至7 天进行菌落
微
生
1.3.3计数方法适用性试验
物
限
度
检
查
非 无
1.3 计数培养基适用性检查和供试品计 数方法适用性试验
菌 1.3.1菌液制备及使用
产 品
菌种
微
试验用菌株的传代次数不得超过5
生
代（从菌种保藏中心获得的干燥菌
物
限
种为第0代），并采用适宜的菌种
度
保藏技术进行保存，以保证试验菌
检 查
株的生物学特性
检
查
非
② 薄膜过滤法
无
除另有规定外，按计数方法适用性试
菌
验确认的方法进行供试液制备。取相
产
当于1g、1ml 或10 cm²供试品的供试 液，若供试品所含的菌数较多时，可
品
取适宜稀释级的供试液，照方法适用
微
性试验确认的方法加至适量稀释液中， 立即过滤，冲洗，冲洗后取出滤膜， 培养和计数：培养条件
生
菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基 和计数方法同平皿计数
值报告菌数
非
③ MPN 法
无
微生物检验技术培训PPT课件
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二、无菌检查
4.供试品的无菌检查
•无菌检查法包括
• 薄膜过滤法 • 直接接种法
•只要供试品性质允许，应采用薄膜过滤法。 •供试品无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与方法适 用性试验确认的方法相同。 •无菌试验过程中，若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂 等试剂，应证明其有效性，且对微生物无毒性。
3d
培养基
生孢梭菌
空白
1支
枯草芽孢杆菌
各2支 胰酪大豆胨液体
白色念珠菌 黑曲霉
培养基
20～25℃
5d
【10版：改良
马丁培养基】
结空果白判定:
1支
空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏
度检查符合规定。
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二、无菌检查
3.方法适用性试验（方法验证试验）
•当 进 行 产 品 无 菌 检 查 法 时 ， 应 进 行 方 法 适 用 性 试 验 ， 以 确 认 所 采 用 的 方 法 适 合 于 该产品的无菌检查。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，应重新进 行方法适用性试验。 •验 证 时 ， 按 “ 供 试 品 的 无 菌 检 查 ” 的 规 定 及 下 列 要 求 进 行 操 作 。 对 每 一 试 验 菌 应 逐一进行验证。 •方法适用性试验也可与供试品的无菌检查同时进行 。
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二、无菌检查
4.供试品的无菌检查
•结 果 判 断
• 当符合下列至少一个条件时方可判试验结果无效： • （1）无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果 不符合无菌检查法的要求。 • （2）回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的 因素。 • （3）供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌 试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。
微生物限度方法学验证PPT课件
养基上， 23～28℃培养5～7天，加3～5ml0.9％无菌氯 化钠溶液洗下霉菌孢子，吸出菌液，取 1ml菌液加0.9％ 无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-
4～ 10-6，使菌数约为50～100cfu/ml。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
菌液组：测定所加的试验菌数。 平皿法：取试验用的1ml菌液（约50～100cfu），分别注 入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2 个平皿，按平皿法测定其菌落数。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
供试品对照组：取规定量供试液，按菌落计数方法测定 供试品本底菌数。（和试验组采用同法）
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌 计数所规定的方法及要求进行。对各试验菌的回收率 应逐一进行验证。验证试验至少应进行3次独立的平行 试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
细菌计数验证用菌株：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯 草芽孢杆菌。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
稀释剂对照组：若供试液制备需要分散、乳化，中和、 离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组， 以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时， 可用相应的稀释剂替代供试品，加入试验菌，使最终菌 浓度为每1ml 供试液含50～100cfu，按试验组的供试液 制备方法和菌落计数方法测定其菌数。
样品稀释级的选择：最低稀释级，1g或1ml。
培养基：营养琼脂、玫瑰红钠琼脂、改良马丁培养基、 营养肉汤培养基、改良马丁琼脂培养基。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
药品微生物限度检查法PPT教学课件
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操作环境
• 检验全过程应严格遵守无菌操作，在环境洁 净度10000级和局部洁净度100级单向流空气 区域内进行，以防止再污染。单向流空气区 域、工作台面及环境应定期按中华人民共和 国国家标准GB/T 16292～16294-1996 《医药 工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降 菌的测试方法》进行洁净度验证。
• 取供试品5g(5ml)，加入司盘80 5g、单硬脂 酸甘油酯3g、聚山梨酯80 10g的无菌溶化 混合物（温度低于45℃）的烧杯中，用无 菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃左右的 稀释剂至100ml，边加边搅拌，使供试品充 分乳化，作为1:20供试液。
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特殊供试液制备方法
• 取供试品10g，加至含玻璃珠和20ml的 无菌十四烷酸异丙酯的容器中，充分振 摇，使供试品溶解，再加入约45℃的稀 释剂，振摇5-10分钟，萃取，待油水明 显分层，取其水层作为1:10供试液。
• 一个细菌、霉菌或酵母菌的菌落均可由一 个或多个菌细胞生长繁殖而成，因此供试 品中所测得的菌落数，实际为菌落形成单 位数（colony forming unity, cfu）
• ·供试品检验的全过程必须符合无菌技术 要求。
• 培养基、稀释剂、实验器具等的灭菌，按 灭菌法（见附录）的要求采用验证合格的 灭菌程序灭菌。
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操作要点
• 作供试品稀释时，每一稀释级都要更换吸管。 • ·细菌培养48h，真菌培养72h，计数。如菌落极小，不
易辨认可适当延长培养时间。再点计菌落数。 • 含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培养基测定
• 检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml或 cm2）
• 一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小 包装单位）的3倍量供试品。
微生物限度和无菌检查法验证PPT教学课件
2020/12/09
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中国药典2005年版对微生物限度检查法和无菌 检查法进行了修订完善，明确规定进行药微生物 限度和无菌检查法验证目的是确认试验中应选择 药典收载的何种供试液制备方法、何种测定方法， 以及验证确定的检测系统是否适用于该药品的检 验。如果供试品有抑菌性，影响测定结果，则应 采用适当的方法消除供试液的抑菌活性后再进行 检查。也就是说，只有通过方法验证，才能确定 针对具体品种的具体的检验方法，保证采用的方 法的科学性和检验结果的准确性。
适宜、简单有效的消除抑菌性的方法是当前验证 工作的关键。Βιβλιοθήκη 2020/12/096
方法验证的步骤与内容 1、制备验证试验用菌液 按药典无菌检查法中培养基灵敏度检查项中试验用 菌液的制备方法将规定需用的试验菌分别制成每毫 升中含10～100个菌（CFU）的供试菌液。 2、样品的前处理方法 样品的前处理方法是验证试验的一部分，需证明所 用的处理方法对各试验菌的生长无影响。
微生物限度和无菌检查法验证
2020/12/09
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微生物限度和无菌检查法验证意义：
中国药典2000年版及以前的版本虽然收载了微生 物限度检查法和无菌检查法，但在如何保证检验方 法的科学性及检验结果的准确性方面存在一些问题， 与国外药典的相关要求比较有一定差距，关键是未 明确对检验方法进行必要的方法学验证。以前品种 的申报资料中一般仅提供微生物限度检查或无菌检 查的检查结果，无方法学验证内容。但从保证药品 安全性的实际出发，不同品种需要选择建立各自适 当的检查方法，即使是仿制药，由于不同生产企业 采用的工艺、辅料等的不同，其产品可能表现出不 同的抑菌特性，进行微生物限度检查或无菌检查时， 具体的检查方法也不能简单地照搬，需要通过试验 验证核实已有的试验方法和检测系统是否适用，因 此，也需要进行必要的方法验证。
药品微生物限度检查方法验证步骤及示教
药品微生物限度检查方法验证一般步骤1.样品及确定验证项目样品要求：不含菌或少量菌验证项目：根据药品用药途径、处方、制法确定。
细菌、霉菌及酵母菌计数验证（一般必作）；控制菌检查如为中药制剂必须查标准，根据用药途径、处方、制法确定控制菌检查项目。
特殊的如滴眼剂、用于烧伤、严重创伤等应根据制剂通则项下要求及微生物限度标准来确定。
2. 确定供试液制备方法3. 方法选择预试验（1）目的：确定样品对试验菌有无抑菌活性及计数验证各试验菌的回收试验方法。
（2）查资料，根据样品的功能、主治及所含成分等确定方法选择预试验方案。
（3）根据预试验结果确定各试验菌计数验证方法控制菌验证方法4. 验证试验：选择3个批号样品进行3次独立实验，证明方法的有效性；5. 据验证结果优化试验条件，建立微生物限度检查方法SOP。
6. 写出验证资料。
示教内容11.5.上午：菌液制备方法：一. 新鲜浓菌液制备（要求学员练习操作的内容）新鲜浓菌液接种：细菌大肠埃希菌[CMCC（B）44102]金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]生孢梭菌[CMCC（B）64941]（厌氧梭菌）铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]培养基：营养肉汤3-5ml、硫乙醇酸盐流体培养基3-5ml接种及培养：1.分别取各试验菌半个--1个菌落分别接种营养肉汤（充分研匀、摇匀），36±1℃培养16-18小时。
2.生孢梭菌新鲜培养物取0.1ml接种硫乙醇酸盐流体培养基（临用前排氧）36±1℃培养18-24小时。
霉菌及酵母菌白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]培养基：改良马丁培养基3-5ml；改良马丁琼脂培养基斜面1.取白色念珠菌的菌落接种改良马丁培养基23-28℃培养24小时（可用36±1℃培养18-24）。
2.黑曲霉孢子悬液的制备：沾取黑曲霉孢子接种改良马丁琼脂培养（红字为示教内容基，培养5-7天待培养物黑色孢子生长（全部变黑，已制备好斜面培养物示教）加入5-10ml0.9%氯化钠溶液，小心振挡洗脱表面的黑色孢子1-2次，吸出洗脱液（注意不要触到菌丝体）即为孢子悬液。
微生物限度方法学验证完整版
微生物限度方法学验证 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】微生物限度检查方法学验证一、检验方法依据微生物计数法（中国药典2015年版四部1105）；控制菌检查法（中国药典2015年版四部1106）；非无菌药品微生物限度标准（中国药典2015年版四部1107）；抑菌效力检查法（中国药典2015年版四部1121）检查。
二、菌种、培养基及稀释液表2培养基表3对照用培养基表4试剂稀释液：（1）缓冲液取L磷酸二氢钾溶液250ml,加L氢氧化钠溶液118ml,用水稀释至1000ml，摇匀，既得。
（2）%无菌氯化钠溶液取氯化钠，加水溶解使成1000ml，过滤，分装、灭菌。
（3）％（ml/ml）聚山梨酯80的%无菌氯化钠溶液取聚山梨酯80 ，用％无菌氯化钠溶液溶解并稀释至1000ml，滤过，分装，灭菌，备用。
（4）靛基质试液取对二甲氨基苯甲醛，加入95%乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取盐酸20ml徐徐滴入。
三、菌液的制备1细菌、霉菌、酵母菌接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，培养48小时。
上述培养物用%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养7天，加入5ml含％（ml/ml）聚山梨酯80的%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液（用带有无菌棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管）用%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含孢子数50～100cfu的孢子悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。
2控制菌接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时。
用%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu 的菌悬液。
微生物限度检查方法学验证实验
《中国药典》 2005年版微生物限度检查法的方法验证试验目录一、微生物限度检查的意义二、微生物限度检查的范围三、验证的目的四、验证的类型五、验证的过程一、微生物限度检查的意义药品是治病防病，关系患者生命健康的特殊商品，必须保证其质量,用药的安全与有效。
微生物污染药品引起的药源性疾病屡见不鲜，在国内外均有报道。
为保证药品质量，必须对微生物污染进行必要的控制和检验。
其意义在于(1)保证药品质量已有许多实例表明，药品污染微生物不仅危机病人用药安全，而且也直接影响药品的有效性，所以药品卫生质量是药品质量不可分割的部分。
(2) 反映药品生产工艺的科学性，合理性及质量管理水平，通过检验，凡工艺条件，生产管理水平，生产人员的素质差，不注意文明生产的单位和企业，其生产的药品，染菌必然严重，不合格率无疑就高。
微生物限度的检验是提供药品卫生质量的重要依据，因而在保证销售与使用过程中药品的有效性和安全性，是促进与提高生产单位全面质量管理水平与提高药品质量的重要措施。
二、微生物限度检查的范围1．根据药品使用要求，把药品化为两大类:(1) 规定灭菌药品:包括注射剂和输液剂，及用于体腔，严重烧伤,溃疡,出血用药等制剂。
(2) 非规定灭菌药品:包括常用口服制剂与一般外用制剂。
对这一部分制剂一般不要求绝对无菌，允许一定限量的微生物存在，但同时规定不得有可疑致病的细菌存在。
由于致病菌的范围很广，各国药典都规定了几个常见的致病菌或指示菌作为控制菌。
2．在非灭菌的各种制剂中，对每克或每毫升的药品按剂型或品种不同规定(1)染菌量检查:包括细菌数，霉菌数及酵母菌数测定，以检查这几类微生物对药品的污染程度。
(2) 控制菌检查:包括大肠埃希菌，大肠菌群，沙门菌，金黄色葡萄球菌及铜绿假单孢菌，生孢羧菌。
3．药品微生物限度检验中的困难，最根本的原因在于检验对象本身的特殊性。
(1) 不确定性:药品受外来微生物的污染，这种污染是可有可无;在有中又可多可少;其种类可以多样.污染的情况依生产,设备,原材料,管理,剂型等等条件而定,非药品本身所固有.所以微生物限度检验的对象是不确定的。
无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
计数 (CFU)
均值 (CFU)
22 26 24
金黄色葡萄 球菌
36 39
38
枯草芽孢杆 菌
62 66
64
铜绿假单胞 菌
58 54
56
生孢梭菌 20 20
20
菌种 计数(CFU) 均值(CFU)
表2 真菌数计数结果 黑曲霉菌
白色念珠菌
86
93
86
83
89
85
2024/4/20
无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
7. 活菌计数 活菌计数结果见表1。
2024/4/20
无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
5
第5页
10－4稀释 10－5稀释 10－7稀释
试验次数
1 2 1212
金黄色葡萄球菌
56 60
枯草芽孢杆菌
77 79
白色念珠菌
86 70
黑曲霉菌
80 76
铜绿假单胞菌
47 50
2024/4/20
无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
方法： 中国药典相关微生物程度检验法方法验 证试验。
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无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
30
第30页
详细操作方法
菌液制备： (1)取经37℃培养18~24h，金黄色葡萄球菌 、大肠埃希菌、枯草杆菌肉汤培养物 1ml+9ml盐水，10倍稀释至10-5 ~10-7，细菌 数约为50~100cfu/ml，做活菌计数备用。
2024/4/20
无菌检查微生物限度检查方法学验证实例
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第20页
供试液制备：每2支以100ml生理盐 水溶解，混匀备用。
薄膜过滤：将要求量供试品按薄膜 过滤法过滤，冲洗，每次50ml，在最 终一次冲洗液中逐一加入试验菌少于 100CFU。按要求将培养基直接加至 滤筒内。天天观察并统计结果。
《微生物限度检验》PPT课件
可以接受的标准 — 平板法
1、重现性良好 - 三批不同批次的样品/产品 - 三次独立的试验
2、验证数据合理有效（微生物的回收率） - 阴性对照：无污染事件发生 - 样品组（ 回收率）： A = C ± 30% （ 偏差≤ 30%）
3、样品的处理方法和检验方法与检验规程相符
PTP课件26
改良马丁培养基 20-25℃ 1824h
改良马丁斜面培养基 20-25℃ 5-7天
PTP课件17
微生物计数方法验证用菌株：
USP29版
菌株名称
ATCC编号
大肠埃希氏菌(Escherichia coli)
ATCC 8739
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ATCC 6538
大肠杆菌
10g (10ml)样品
90ml TSB 35-37 ℃,1848h
沙门菌
10g (10ml)样品
90ml TSB 35-37 ℃,1824h
铜绿假单胞菌
10g (10ml)样 品 90ml 缓冲蛋白 胨水
金黄色葡萄球 菌
10g (10ml)样 品
90ml 缓冲蛋 白胨水
梭菌
10g (10ml)样品
- 供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小 时。
- 供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃。 - 供试液的体积：100ml。
PTP课件14
稀释剂（ 中国药典2005版）
（1） pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲溶液 （2） pH6.8无菌磷酸盐缓冲液 （3） pH7.6无菌磷酸盐缓冲液
固体：10g 供试品+稀释剂至100ml 液体：10ml供试品+稀释剂至100ml
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细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
试验组： 平皿法：取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50～ 100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基， 每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。
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细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
试验组： 培养基稀释法（平皿法）：取试验可能用的最低稀释级 供试液1ml分别注入n个平皿，每个平皿再注入50～100 cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每 株试验菌平行制备2份，按平皿法测定其菌落数。
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细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
计数方法的验证——结果判断指标 试验组的菌回收率（≥70%） 稀释剂对照组的菌回收率（≥70%）
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细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
试验组的菌回收率计算：
（试验组菌落计数-供试品对照组菌落计数）÷菌液组×%
稀释剂对照组的菌回收率计算： 稀释剂对照组菌落计数÷菌液组×% 每一验证菌株均应进行上述试验。 验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计
供试品的处理： 固体：10g 供试品+稀释剂至100ml 液体：10ml供试品+稀释剂至100ml 抑菌性供试品可采用加中和剂、自然沉降、离心或
薄膜过滤。
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细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
• 菌液组 • 供试品对照组 • 试验组 • 稀释剂对照组 每一验证菌株均应进行上述试验（顺序）。
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细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
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细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
稀释剂对照组：若供试液制备需要分散、乳化，中和、 离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组， 以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时， 可用相应的稀释剂替代供试品，加入试验菌，使最终菌 浓度为每1ml 供试液含50～100cfu，按试验组的供试液 制备方法和菌落计数方法测定其菌数。
菌液组：测定所加的试验菌数。 平皿法：取试验用的1ml菌液（约50～100cfu），分别注 入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2 个平皿，按平皿法测定其菌落数。
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细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
供试品对照组：取规定量供试液，按菌落计数方法测定 供试品本底菌数。（和试验组采用同法）
算各试验菌每次试验的回收率。
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细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
验证细菌各平皿倾入营养琼脂培养基。 验证霉菌、酵母菌各平皿倾入玫瑰红钠琼脂培养基。 置规定温度培养48或72h,菌落计数。计算回收率。
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细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
微生物限度检查方法的验证
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微生物限度检查方法的验证
• 细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证 ——准确性（回收率）
• 控制菌检查法的验证——专属性
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细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
验证的目的：
确认所采用的方法适合该药品的细菌、霉菌、酵母 菌数的测定。照此检查法和检验条件进行供试品细菌、 霉菌、酵母菌数检查能保证检验结果的准确、可靠。
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细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
试验组： 薄膜过滤法：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液， 过滤，冲洗，应在最后一次的冲洗液中加入50～100cfu 试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。至少要一张 膜。
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细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
试验组： 离心沉淀法：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液， 如供试液含许多药渣，先以低速500r/min离心3～5min， 取上清液，再以3000 r/min离心10～30min，取下面1ml 液体（A)，并用适当的稀释剂洗涤管底，将洗涤液与液 体（A)一起采用平皿法或薄膜过滤法计数。
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细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
验证的步骤：
• 根据样品特性，制定检验方法和检验条件。
• 保证验证试验所用的仪器、培养基和试剂等均符合试 验要求。
• 按制定的方法进行试验。
• 根据验证结果，判断是否符合验证的标准。若符合,按 验证的方法和条件进行药品的微生物限度检查；若不 符合，应重新设立验证方案，再进行验证，直至验证 结果符合设立的验证标准。
菌液制备 (3)接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培
养基上， 23～28℃培养5～7天，加3～5ml0.9％无菌氯 化钠溶液洗下霉菌孢子，吸出菌液，取 1ml菌液加0.9％ 无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-
4～ 10-6，使菌数约为50～100cfu/ml。
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细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
草芽孢杆菌。
霉菌、酵母菌计数验证用菌株：白色念珠菌、黑曲霉。
菌株选择的原则:代表性,普遍性,低或非致病性,标准 菌株(或该药品中常见的污染菌)。
菌种的要求：不得超过5代。采用适宜的方法保存。加菌
量:50～100cfu。
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细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
验证方法选择：平皿法（包括稀释法）、薄膜过滤法、 中和法、离心沉淀法、联合方法。
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细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌 计数所规定的方法及要求进行。对各试验菌的回收率 应逐一进行验证。验证试验至少应进行3次独立的平行 试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。
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细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
细菌计数验证用菌株：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯
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细菌、霉菌、酵母菌计数方法的பைடு நூலகம்证
菌液制备 (2)接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养
基中，23～28℃培养18～24小时，取此培养液1ml加0.9％ 无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～ 10-7，使菌数约为50～100cfu/ml。
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细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
样品稀释级的选择：最低稀释级，1g或1ml。
培养基：营养琼脂、玫瑰红钠琼脂、改良马丁培养基、 营养肉汤培养基、改良马丁琼脂培养基。
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细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
菌液制备 (1)接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌
的新鲜培养物至10ml营养肉汤中，35～37℃培养18～24小 时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍 递增稀释法，稀释至10-5～10-7，使菌数约为50～100cfu /ml。