影响原生质体培养的因素

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第九章++植物原生质体培养

（五）复杂有机物
在原生质体培养中，常加入一些复杂有机物，可以不同程度的提高再生细胞分裂频率，促进细胞团的形成。常用的有机物有谷氨酰氨、水解乳蛋白、水解酪蛋白、肌醇、椰乳、酵母浸出物等。
二、培养方法
原生质体培养一般采用液体培养的方法，因为：（一）液体浅层培养
（二）平板法培养
（三）悬滴法培养（四）固液结合培养法
的压力。
（一）渗透压保护剂
（二应注意的问题
（一）渗透压保护剂
原生质体分离及培养过程中渗透压的调节通常利用糖或糖醇来控制，常用的渗压剂有甘露醇、山梨醇、葡萄糖和蔗糖，其中甘露醇和山梨醇或其组合最常用。叶原生质体分离时最常用的为甘露醇（浓度为 0.23~0.90M）。有效的渗透浓度决定于原生质体分离期间叶细胞的渗透压。内源细胞渗透压明显地受环境条件的影响，并且能够用暗处理植株和幼叶组织等措施加以控制。
三、酶处理
1、原生质体分离在很大程度上取决于所用酶的性质和浓度，因此要做好酶种类、处理浓度的选择。 2、酶处理的适宜条件（1）pH值酶的活性与pH有关，用于分离原生质体的大多数酶适宜的PH为4.7-6.0 。（2）温度对用来分离原生质体的酶类来说，最适温度是40~50℃，但分离原生质体时以25~30℃ 为宜。（3）光照通常在黑暗或在低光强下分离原生质体。
（二）应注意的问题
1、在酶处理液、原生质体清洗介质及原生质体培养基中必须加入合适的渗透压保护剂。 2、原生质体在轻微高渗溶液中比在等渗溶液中稳定。较高水平的渗透压虽可阻止原生质体破裂，但影响细胞的代谢、分裂和生长。 3、在分离原生质体时，可以使用电解质渗压剂，但在原生质体培养时一般不用。 4、当用非电解质为渗压剂时，在酶液中加入某些盐类，如Cacl2、KH2PO4、葡聚糖硫酸钾，可以提高质膜的稳定性。

原生质体制备

1.影响原生质体数量和活力的因素（1）细胞壁降解酶的种类和组合不同植物种类或同一植物种的不同器官以及它们的培养细胞，由于它们的细胞壁结构组成不同，分解细胞壁所需的酶类也不同。

例如，叶片及其培养细胞用纤维素酶和果胶酶，根尖细胞以果胶酶为主附加纤维素酶或粗制纤维素酶（Driselase酶），花粉母细胞和四分体期小孢子用蜗牛酶和胼胝质酶，成熟花粉用果胶酶和纤维素醇。

（2）渗造压稳定剂用酶法降解细胞壁前，为防止原生质体的破坏，一般需先用高渗液处理细胞，使细胞处于微弱的质壁分离状态，有利于完整原生质体的释放。

这种高渗液称为渗透压稳定剂。

常用的滲透压稳定剂有甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、盐类（KCI、MgSO4.7H2O）等。

在降解细胞壁时，渗透压稳定剂往往和酶制剂混合使用。

滲透压稳定剂中，用得最多的是甘露醇，常用于烟草、胡萝ト、柑橘、蚕豆原生质体制备；蔗糖常用于烟草、月季等；山梨醇常用于油菜原生质体制备。

滲透压稳定剂种类及浓度的选择应根据植物种类而异，例如胡萝ト用0.56mol ／L甘露醇，月季用14％蔗糖，柑橘用0.8mol／L甘露醇，蚕豆用0.7mol／L甘露醇，烟草的四分体用7％熊糖，烟草的成熟花粉用13％甘露醇。

（3）质膜稳定剂质膜稳定剂可以增加完整原生质体数量、防止质膜破坏，促进原生质体胞壁再生和细胞分裂形成细胞团。

如在分离烟草原生质体时，在酶液中加人入葡聚糖硫酸钾，一旦洗净确液进行培养，原生质体很快长壁并持续细胞分裂形成细胞团。

而未加葡聚糖硫酸钾的对照，原生质体经一周培养即解体。

常用的原生质膜稳定剂有葡聚糖硫酸钾、MES、氯化钙、磷酸二氢钾等。

（4）pH的影响分离原生质体时，酶液的pH是值得注意的问题。

因为降解酶的活力和细胞活力最适pH是不一致的低pH时（＜4.5），酶的活力强，原生质体分离速度快，但细胞活力差，破坏的细胞较多；pH偏高时，酶活力差，原生质体分离速度慢，完整的原生质体数目较多。

细胞工程植物原生质体培养和体细胞杂交

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细胞工程植物原生质体培养和体细胞杂交
(三) 渗透压稳定剂
➢ 常用：甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖和盐类等。
➢ 不同物种原生质体分离时，所需的渗透压稳定剂也不同。
➢ 原生质体在轻微高渗溶液中比在等渗溶液中更为稳定。
➢ 较高水平的渗透剂可以阻止原生质体的破裂和出芽，但同时也可能会抑制原生质体的分裂。
细胞工程植物原生质体培养和体细胞杂交
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•马铃薯原生质体再生植株
细胞工程植物原生质体培养和体细胞杂交
四、原生质体培养过程中的遗传变异
• 适应性变异为非遗传变异，会随着环境条件的改变丧失其变异特征。
漂浮法不连续梯度法
细胞工程植物原生质体培养和体细胞杂交
沉降法
• 方法：比重小的等渗溶液中，对酶解物先过滤，再低速离心，使完整的原生质体沉降于管底。
• 渗透压调节剂：甘露醇。 • 筛网过滤：除去大的组织碎片和残渣，孔径
44~169μm，依原生质体大小来定。 • 离心：900~4500r/min。
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细胞工程植物原生质体培养和体细胞杂交
（二）酶的种类、组合和酶解时间
• 草本植物：2~3种酶混合液。纤维素酶为 0.5%~3%，果胶酶为0.1%~1%。
• 木本植物：纤维素酶同草本，果胶酶更多。 • 成熟花粉粒和四分体小孢子：除纤维素酶类和果
胶酶类外，尚需降解胼胝质层的蜗牛酶和胼胝质酶，浓度为0.5%~2%。
➢ 温度：一般为24~30℃，但不同物种间差异比较大。
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细胞工程植物原生质体培养和体细胞杂交
三、原生质体再生过程
1、细胞壁再生 2、细胞分裂和愈伤组织或胚状体形成 3、植株再生

植物原生质体培养的影响因素分析

Ａｎｌｉｆｉｆｕｎｅｆｃｏｓｏａｏｏａｔｃｔｅａｙｓｓｏｎｌｅｃａｔｒｎｐｌｎｔｐｒｔｐｌｓｕｌｕｒ
ＭＡｕｉｌｎＬＩＹｕｚＨ —ｉｇ， — ｈｕ
（ｌｇｆＰｒｔｃｌｕｅＧａｓｒｃｌｕａｉｅｓｔ，ｎｈｕ７０７Ｃｈｎ）Ｃｏｌｅｏａａｕｔｒ，ｎｕＡｇｉｕｔｒｌＵｎｖｒｉｙＬａｚｏ３００，ｉａｅ
ห้องสมุดไป่ตู้
用．些遗传上异源的或多倍体植物的同一个体来一源的体细胞中往往产生无性分离的现象，同时培养
过程中发生体细胞变异，生质体为分离其中的有原用变异提供了机会．正是这一特殊性能，使原生质体
成为植物遗传育种的一个理想的受体系统．在植物
遗传物质的导人和表达的研究及作物优良品种的选
育中，物原生质体培养技术发挥着其独特而有效植
的作用．
的条件下进行准确的操作及进行转化体和重组体的分析．植物原生质体仍然保留细胞的全能性，能在控制条件下再生成完整植株，进行无性繁殖．同植物不的原生质体可以在诱导的条件下彼此融合，生质原
生命科学的发展离不开新技术的产生和完善，植物原生质体培养和体细胞杂交技术促进了与之相关领域科学研究的进程．物原生质体是脱去了细植胞壁的裸露细胞，由于无细胞壁，生质体可以摄人原细胞器、微粒体、毒以及一些大分子物质，Ｄ病如ＮＡ等．生质体的这种摄人能力，利于人们进行遗传原有物质的导人和表达的广泛研究，且也易于在控制而

微生物原生质体制备及再生的影响因素

文章篇号:1007-2764(2006)03-0263-093微生物原生质体制备及再生的影响因素谭文辉，李燕萍，许杨（南昌大学中德联合研究院食品科学教育部重点实验室，江西南昌 330047）摘要：原生质体的制备及再生，是原生质体技术的前提和基础。

本文较全面地介绍了影响微生物原生质体制备及再生的因素，以期在原生质体形成和再生的最佳条件下制备原生质体，为进一步实验打下良好的基础。

关键词：原生质体；制备；再生Factors Affect the Formation and Regeneration of Protoplasts ofMicroorganismTan Wen-hui, Li Y an-ping, Xu Y ang(The Key Laboratory of Food Science of Ministry of Education (Nanchang University); Sino-Germany Joint ResearchInstitute, Nanchang 330047, China)Abstract: Formation and regeneration of protoplasts is the precondition and foundation of protoplasts technology. The factors that affect the formation and regeneration of protoplasts from microorganism were investigated to find the optimum condition of formation and regeneration of protoplasts. It is important to make the good foundation for further research.Keywords: Protoplasts; Formation; Regeneration原生质是有组织的生活物质，是细胞生命活动的物质基础，所有的原生质有相似的基本组成成分和特性。

原生质体培养名词解释

原生质体培养名词解释原生质体培养是一种常用的植物组织培养技术，用于繁殖植物和研究植物基因转化等问题。

本文将介绍原生质体培养的定义、原理和应用等方面的名词解释。

下面是本店铺为大家精心编写的4篇《原生质体培养名词解释》，供大家借鉴与参考，希望对大家有所帮助。

《原生质体培养名词解释》篇11. 原生质体（Protoplast）原生质体是指从植物细胞中除去细胞壁后剩余的细胞质部分，包括细胞膜、质体、线粒体、质体小体、微管和微丝等细胞器。

原生质体是一个高度液态的细胞质体系，其形态和功能类似于一个微小的细胞。

原生质体可以通过融合实现远缘杂交，从而扩大植物遗传资源的利用范围。

2. 原生质体培养（Protoplast Culture）原生质体培养是指将离体的植物原生质体在适当的培养基上进行培养，以获得再生的植物组织或细胞。

原生质体培养的主要目的是通过原生质体的融合，克服远缘杂交障碍，实现植物遗传资源的利用和改良。

3. 原生质体融合（Protoplast Fusion）原生质体融合是指两个或多个原生质体合并成一个细胞的过程。

原生质体融合可以通过电激、化学处理或生物方法等手段诱导。

融合后的细胞称为杂种细胞，可以用于植物遗传资源的利用和改良。

4. 再生（Regeneration）再生是指通过培养技术，使离体的植物组织或细胞重新分化、再生为新的植株或组织。

再生是原生质体培养的重要应用之一，也是植物组织培养技术的基础。

5. 遗传转化（Genetic Transformation）遗传转化是指将外源基因或基因组导入植物细胞内，并使其表达的过程。

遗传转化是植物基因工程的重要组成部分，也是原生质体培养的应用之一。

通过原生质体培养技术，可以将目的基因导入植物细胞内，并实现植物的遗传转化。

6. 植物组织培养（Plant Tissue Culture）植物组织培养是指将离体的植物组织或细胞在适当的培养基上进行培养，以获得再生的植物组织或细胞。

第八章植物原生质体培养

第八章植物原生质体培养
一、原生质体的分离二、原生质体的纯化三、原生质体的培养方法四、影响原生质体培养的因素五、原生质体再生
原生质体：原生质体：指脱去植物细胞壁后裸露的、有生活力的原生质团。后裸露的、有生活力的原生质团。和植物正常细胞相比，除了没有细和植物正常细胞相比，胞壁外，具有活细胞的一切特征。胞壁外，具有活细胞的一切特征。
封口后，离心，封口后，离心，原生质体漂浮在上面
用吸管收集原生质体液面，用吸管收集原生质体液面，放入液体培养基或甘露醇悬浮洗涤原生质体2-3次或甘露醇悬浮洗涤原生质体次
将原生质体悬浮在液体培养基中备用
漂浮法的优点：漂浮法的优点：原生质体纯度高。缺点：原生质体收率低。缺点：
3、不连续梯度法、
（2）酶分离法）
两步法：两步法：
果胶酶处理材料
优点：
所获得的原生质体均匀一致、体均匀一致、质量好；量好；
游离出单细胞
纤维素酶处理单细胞
缺点：
操作复杂，操作复杂，已被淘汰。淘汰。
分离出原生质体
一步法
外植体
酶液配制：注意纤维素酶、酶液配制：注意纤维素酶、果胶酶和渗透压稳定剂（甘露醇）的配比及pH 透压稳定剂（甘露醇）的配比及酶液离心过滤灭菌后-20℃ 过滤灭菌后 ℃保存外植体放入酶液，外植体放入酶液，真空泵抽引渗透处理 26℃摇床振荡2-8小时 ℃摇床振荡小时
3、原生质体的分离方法、
首先对外植体进行预处理，有两种方法：首先对外植体进行预处理，有两种方法：
低温处理：外植体放在4℃下，黑暗中1-2天。外植体放在 ℃ 黑暗中天等渗溶液处理：外植体放在等渗溶液中数小时。外植体放在等渗溶液中数小时。

组织培养——精选推荐

组培的基本操作1、培养基的主要成分①水分：构成培养基的绝大部分组分为水分。

在研究上，常用蒸馏水来配制培养基，而最为理想的水应该是纯水。

②无机盐类：无机盐类中根据植物的需要量可以分为大量元素和微量元素。

植物从培养基中吸收的大量元素有N、P、K等。

它们是构成植物细胞中核酸、蛋白质以及生物膜系统等必不可少的营养元素。

微量元素包括Fe、Mn、Zn、B等，它们在培养基中的添加量虽然很少，但也是不可缺少的，这些元素是很多酶和辅酶的重要成分，直接影响着蛋白质的活性，铁又是叶绿素的重要成分。

③有机营养成分I、糖类物质：对于植物组织培养中幼小的外植体而言，由于其光合作用的能力较弱，培养基中的糖类物质就成了其生命活动中必不可少的碳源和能源。

除此之外，糖类的添加还有调节培养基渗透压的作用II、维生素类：维生素类物质的添加对愈伤组织和器官形成有促进效果。

维生素C还有防止组织褐变的作用III、氨基酸类：在培养基中常用的氨基酸有甘氨酸、酪氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、天门冬胺等。

这些氨基酸类物质不仅为培养物提供有机氮源，同时也对外植体的生长以及不定芽、不定胚的分化促进作用。

④植物生长调节物质：植物生长调节剂在培养基中的用量虽然微小，但是其作用很大。

它不仅可以促进植物组织的脱分化和形成愈伤组织，还可以诱导不定芽、不定胚的形成，最常用的有生长素和细胞分裂素，有时也会用到赤霉素和脱落酸。

⑤天然物质；椰子汁、香蕉泥等天然有机物质的添加，有时会有良好的效果，在这些天然有机物质中，通常含有机营养成分或生理活性物质。

⑥PH；pH过高时，培养基会变硬；pH过低时，则影响培养基的凝固⑦凝固剂：在配制固体培养基时，需要使用凝固剂。

最常用的凝固剂是琼脂⑧其他添加物：有时为了减少外植体的褐变，需要向培养基中加入一些防止褐化的物质，如活性碳、维生素C等。

此外，在灭菌比较困难的植物材料时，也可以添加一些抗生素物质，以此来抑制杂菌生长。

2、培养基的基本类型①含盐量较高的培养基：其代表是MS培养基，主要特点是无机盐浓度高，特别是硝酸盐、钾离子和铵离子含量丰富，元素平衡较好，缓冲性能好，微量元素和有机成分含量齐全且丰富，是目前使用最广泛的培养基。

原生质体培养

4、融合过程
（1）收集原生质体（2）滴150ul混合双亲的原生质体悬浮液于载体玻片上，形成一层薄层。（3）吸取PEG融合诱导液450ul,使PEG溶液逐
渐与原生质体接触，促使原生质体相粘连。
（4）保温后，取高Ca2+-高PH溶液0.5ml，滴入原生质体悬浮液与PEG混合液中。
（5）吸取2ml原生质体培养基洗涤PEG处理过的
四、影响原生质体数量和活力的因素
4、质膜稳定剂为了提高质膜的稳定性和增加原生质体的产量，可
在酶液中添加多聚阳离子和无机钙离子作为质膜稳定剂。
一般添加0.5%-1.0%的葡聚糖硫酸钾或0.1%氯化钙。
四、影响原生质体数量和活力的因素
5、PH 酶液的PH对原生质体的产量和活力影响很大，因植物
材料不同要求也不同，一般为5.5-5.8。如原生质体的供
三、原生质体存活率、密度及产量的测定
（一）双醋酸盐荧光素染色法测定存活率存活率=存活原生质体数/总原生质体数×100 （二）测定原生质体的密度
原生质体的密度（个/ml）=（原生质体数/1区域）
×104×稀释倍数
（三）原生质体产量的测定 Y=DV / FW
Y（个/g）——原生质体产量
D（个/ml）——存活原生质体密度 V（ml）——制备所得原生质体悬液的总体积
三、原生质体活力的测定
1、荧光素二乙酸法
2、染色识别
用0.1%酚番红或Evans蓝进行染色。
3、形态识别形态上完整，含有饱满的细胞质，颜色新鲜的原
生质体即为存活的。
四、影响原生质体数量和活力的因素
1、供试材料一般选用继代后处于旺盛分裂时期的淡黄色、颗粒状的愈伤组织、悬浮细胞系或生长健壮植株上的较幼嫩外植体。 2、酶的种类、组合和酶解时间选择纯度高的酶类，根据酶解材料细胞壁的特性及酶活性大小确定适宜的酶液组合。酶浓度不宜过高，酶

植物原生质体培养及细胞融合

2．染色观察
• 取一滴0.02％的FDA液与一滴原生质体悬浮液在载玻片上混匀，25E室温染色5～ 10min。用荧光显微镜观察，激发光波长 330～500nm，活的原生质体产生黄绿色荧光。用计数器计算存活百分率。
(二)酚藏花红染色法
• 酚藏花红(phenosafranine)是一种碱性染料，溶于水显红色并带黄色荧光，其最大激发和射波长分别为527nm和588nm 。酚藏花红能被活的原生质体吸收而呈红色，无活性的原生质体因无吸收能力而五色。
(三)不连续梯度离心法
• 在离心管中首先放人不同浓度的Ficoll 溶液，构成不同的浓度梯度，在上部滴人1～2ml酶一原生质体混合液，在150g 下离心5min，不同比重的原生质体漂浮在不同的浓度梯度的界面上，用吸管收集原生质体，悬浮洗涤备用。该方法的优点是获得的原生质体大小均匀致，纯度高；缺点是操作繁杂，原生质体的收率低。
(五)分离方法 • 1．机械分离法 • 但由于该方法获得的原生质体产量低，不能满足实验需要，而且液泡化程度低的细胞不能采用该方法，因此，机械分离法没有得到广泛应用。 • 2．酶分离法
• 1960年，德国诺丁汉大学的Cocking首先利用纤维素酶从番茄幼苗根尖中分离获得原生质体，而且收率高、完整性好、活力强。经过数十年的不断完善，目前酶分离法已成为植物原生质体分离最有效的方法。 • 酶分离法又分为两步法和一步法。两步法是先用果胶酶处理材料，游离出单细胞，然后再用纤维素酶处理单细胞，分离出原生质体。其优点是所获得的原生质体均匀一致、质量好。但由于操作繁杂，目前已逐渐被淘汰。 • 一步法是将纤维素酶和果胶酶等配制成混合酶溅处理材料，一步获得原生质体。因操作简便，目前几乎均采用该方法。

原生质体制备和再生的影响因素

原生质体制备和再生的影响因素【摘要】以酿酒酵母YS5为出发菌株，经蜗牛酶酶解获得原生质体后，用紫外线进行诱变处理，通过一级筛选得到了61株诱变菌株，将这些诱变株直接进行发酵，利用气相色谱对发酵液酒精产量进行分析。

结果表明，经过紫外线照射30s后，通过筛选获得了一株酒精发酵较高产菌株，酒精产率达到了10.36%（v/v），比出发菌株提高了3.6%。

【关键词】酿酒酵母；原生质体；紫外诱变；甘蔗汁发酵酵母细胞的融合及酵母原生质体的诱变的一个重要前提就是如何制备大量的原生质体，原生质体制备率受到各种条件的影响，如菌龄、酶浓度、温度、预处理等的影响，因此确定不同因素对酵母原生质体的影响及优化不同因素，可以大大提高产率。

1.菌体菌龄对原生质体制备的影响微生物的生理状态是决定原生质体产量的主要因素之一，特别是菌龄，明显影响原生质体释放的频率。

不同时期的菌体，对各种溶壁酶的敏感性不同，原生质体的形成率与再生率也有很大差异。

较年轻的菌体细胞制备原生质体较为容易，而且此阶段的原生质体再生率也较高。

处于对数生长期的菌体代谢活性高而稳定、细胞壁对酶的作用较为敏感，且大小比较一致，生长适应能力强，故通常取处于对数生长期的菌体制备原生质体。

有研究表明对数生长早期形成率最高，对数生长中期时再生率最高，对数生长晚期的再生率也比对数生长中期的低。

这是由于细胞壁越稚嫩，越易被酶破坏，对数生长早期菌体幼小，代谢活性高而稳定、细胞壁对酶的作用较为敏感，且大小比较一致，故生活适应能力强；对数生长中期幼小菌体对不利因素抵抗能力差，一旦失去细胞壁，较难恢复；对数生长晚期的原生质体存在着很大比例的非活性个体。

菌体如果进入稳定期，细胞壁结构趋于稳定和老化，不易去壁形成原生质体，原生质体形成率显著降低，而且再生率也有所下降。

微生物的菌龄是随着菌种和培养条件而异，酵母菌菌液中加入β-巯基乙醇可以破坏细胞壁组分中的二巯基，处于对数生长期的酵母菌菌体代谢极为旺盛，细胞壁易被瓦解，其细胞壁对蜗牛酶较为敏感，易于酶解脱壁，且酵母菌制备原生质体时，要使菌体同步化才能大幅度的提高制备率。

第五章原生质体培养

图示原生质体分离过程（以叶片为例）
加果胶酶和纤维素酶
过滤、离心
二、原生质体纯化
• 酶解处理后得到混合液包括原生质体、细胞团和组织碎片等，必须将杂质和酶液除去，才可以继续培养。清除这些杂质的过程称为原生质体纯化。 • 原生质体纯化方法有：沉降法、漂浮法和不连续梯度离心法三种
1、沉降法
• 这些材料不受外界环境的影响，试验重复性好，产生的原生质体产量、活性和稳定性等比较理想。
④ 花粉细胞
• 花粉原生质体具有单倍体和原生质体的双重优点，花粉具有群体数量大、一致性好和取材方便等优点，是细胞工程中一种特殊的试验体系。
2. 酶的种类、组合和酶解时间
• 不同植物种类、组织和细胞由于细胞壁结构、组成不同，分解细胞壁所需酶的种类、浓度、组合及酶解时间也不同。
一、概念： • 原生质体的概念 • 原生质体培养的概念
原生质体（Protoplast）
• 1880, Hanstein：质壁分离时，能够与细胞壁分开的那部分细胞物质。
• 含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。
植物原生质体培养的概念
指将植物细胞游离成原生质体，在适宜的培养条件下，依据细胞的全能性使其再生细胞壁，进行细胞的分裂分化，并发育成完整植株的过程。
3.酶液渗透压
原生质体由于细胞壁的解除和壁压的消失将引起破碎。因而在酶液、原生质体洗涤液、培养液中必须调整渗透压，维持细胞内外平衡，防止细胞吸水涨破和脱水邹缩（破坏内部结构）。
糖醇系统
• 常用的渗透压稳定剂是糖醇系统，包括甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。
• 目前大多数使用甘露醇或山梨醇，它们能稳定地维持渗透浓度。浓度一般为0.4-0.8 mol/L。而蔗糖等易被原生质体吸收利用，降低渗透浓度，故不常用。但有的植物分离原生质体又是蔗糖的效果最好。

原生质体制备和再生的影响因素

结果表明，经过紫外线照射30s后，通过筛选获得了一株酒精发酵较高产菌株，酒精产率达到了10.36%（v/v），比出发菌株提高了3.6%。

1.菌体菌龄对原生质体制备的影响微生物的生理状态是决定原生质体产量的主要因素之一，特别是菌龄，明显影响原生质体释放的频率。

不同时期的菌体，对各种溶壁酶的敏感性不同，原生质体的形成率与再生率也有很大差异。

较年轻的菌体细胞制备原生质体较为容易，而且此阶段的原生质体再生率也较高。

有研究表明对数生长早期形成率最高，对数生长中期时再生率最高，对数生长晚期的再生率也比对数生长中期的低。

菌体如果进入稳定期，细胞壁结构趋于稳定和老化，不易去壁形成原生质体，原生质体形成率显著降低，而且再生率也有所下降。

微生物原生质体制备及再生的影响因素

本文较全面地介绍了影响微生物原生质体制备及再生的因素，以期在原生质体形成和再生的最佳条件下制备原生质体，为进一步实验打下良好的基础。

原生质体的培养

原生质体的培养原生质体（Protoplast）:指采用机械或酶解法去掉细胞壁的裸露细胞。

一、原生质体的应用由于没有细胞壁，原生质体为作物遗传改良和植物学研究提供了极为有利的试验材料。

原生质体可以用于下面几种研究。

用作细胞杂交服务于作物改良用作遗传转化的对象研究细胞壁的发生过程筛选突变体膜的结构、运输、激素接受位点等的研究用于分离细胞器和大分子种质资源保存二、原生质体分离、纯化原生质体分离的最基本原则是保证原生质体不受伤害及不损害它的再生能力。

（一）分离方法机械法分离缺点：产量极低；应用的材料受限制；操作极费力酶法分离Cocking最早开展这方面研究，克服了机械法分离的缺陷，可分为直接法和顺序法两种。

酶法可在短时间内获得大量原生质体，缺点是：不纯的酶制剂所含杂质对原生质体可能有不同程度的毒害作用。

（二）影响原生质体分离的因素（酶法）从理论上讲，只要用适当的酶处理，就能从任何活组织中分离得到原生质体。

但是对于原生质体培养来说，要得到活性高、能进行分裂、形成愈伤组织、最后再生完整植株的原生质体则受许多因素的影响。

原生质体分离时主要应考虑取材、酶的种类、纯度、酶液的渗透压、酶解时间、温度等。

1. 外植体来源:生长旺盛、生命力强的组织和细胞是获得高活力原生质体的关键，并影响着原生质体的复壁、分裂、愈伤组织形成乃至植株再生。

用于原生质体分离的植物外植体有叶片、叶柄、茎尖、根、子叶、茎段、胚、愈伤组织、悬浮培养物（Suspensioncultures）、原球茎、花瓣和叶表皮等。

叶肉细胞是常用的材料,因为叶片很易获得而且能充分供应。

取材时，一般用刚展开的幼嫩叶片。

另一个分离原生质体的常用材料是愈伤组织或悬浮细胞，采用其作材料可以避免植株生长环境的不良影响，可以常年供应，易于控制新生细胞的年龄，处理时操作方便，无需消毒. 选用悬浮细胞作材料时，需每隔3-5天继代一次，培养一段时间使细胞处于旺盛生长状态。

一般在继代后的第三天游离原生质体。

影响原生质体培养的因素课件

生物融合
总结词
利用生物酶或微生物诱导原生质体融合。
详细描述
生物融合技术利用某些生物酶或微生物分泌的物质，促进原生质体的融合。该方法对细胞损伤较小，但融合效率相对较低，需要进
一步优化和改进。
PART 06
原生质体培养的应用与展望
在细胞生物学研究中的应用
细胞膜结构和功能研究
原生质体培养可用于研究细胞膜的组成、结构和功能，以及膜运输、信号转导等过程。
THANKS
感谢观看
REPORTING
VS
原生质体的渗透压一般较低，培养基的渗透压过高或过低都可能对原生质体造成伤害。因此，在选择培养基时，要根据原生质体的渗透压进行选择，以确保适宜的渗透压条件。同时，在培养过程中，要避免培养基过度蒸发或稀释，以保持适宜的渗透压。
光照
光照是影响原生质体培养的环境因素之一，它能够影响原生质体的光合作用和形态建成。
浓度优化
优化无机盐浓度，以促进原生质体的生长和分裂。
生长因子
生长因子
促进细胞分裂和增殖的微量有机物。
种类选择
根据细胞类型选择适当的生长因子。
浓度调整
根据实验需求，调整生长因子的浓度，以获得最佳的生长效果。
PART 03
培养条件
温度
温度是影响原生质体培养的重要因素之一，过高或过低的温度都可能对原生质体造成伤害。
细胞活力
原生质体培养时，细胞的活力对其分裂和生长能力具有显著影响。
高活力的细胞具有更强的分裂和生长能力，能够更好地适应原生质体培养的环境。因此，选择活力较高的细胞进行原生质体培养是提高培养效率的重要因素。
PART 05
原生质体的融合与遗传转化

原生质体再生的影响因素发酵简答题

原生质体再生的影响因素发酵简答题
原生质体再生是指某些原生生物在受到适当刺激后，由部分或全部体积发生分离、胞间的某些物质流动和核分裂等过程，以新生的形态和结构来实现再生和生长的能力。

影响原生质体再生的因素包括：
1. 刺激条件：原生质体再生需要一定的刺激条件，如适当的营养物质、温度、pH值等因素。

2. 社会环境：原生生物在群体中的环境对原生质体再生也有影响。

例如，群体中某些细胞或生物的分泌物可以作为刺激物，促进原生质体再生。

3. 基因因素：各种原生生物的遗传物质不同，对于原生质体再生的敏感度也存在差异。

有些基因可以促进原生质体再生，而另一些则会抑制其再生。

4. 细胞状态：原生质体再生的效率与细胞状态有关，例如细胞的份裂活性、代谢水平等。

同时，细胞状态也受到外界环境的影响。

5. 化学物质：一些化学物质可以促进原生质体再生，而另一些则会抑制。

综上所述，影响原生质体再生的因素包括刺激条件、社会环境、基因因素、细胞状态以及化学物质。

这些因素中相互作用，最终影响原生质体再生的效率。

FDA染色法

FDA染色法：是测定原生质体活性的一种方法，即荧光素双醋酸酯染色，FDA本身无荧光，进入原生质体后便产生荧光素，它不能自由进入原生质体膜，因此有活力的细胞便产生荧光。

原生质分离：酶（纤维素酶，离析酶）步骤：叶片表面消毒→去除表皮→叶碎片漂浮在含有酶和渗透压稳定剂的溶液中→培育→原生质体沉到培养皿底部→除去酶溶液→将原生质体移入CPW清洗→离心→清洗基质两次→重悬浮于培养基→除去小的个体，用血球计计数→调整到合适的密度重悬浮于培养基。

原生质体的培养：培养基：MS＋NAA 2.0ppm＋BA 0.5ppm＋3％蔗糖＋9％甘露醇注意：1、原生质体分离后，非常脆弱，需要渗透压保护剂的保护直到细胞壁形成。

2、针对不同的研究对象，培养基中生长素和细胞分裂素的水平要做适当调整。

影响原生质体培养的因素：营养需求（NH4＋不能过多），渗压剂，培养密度（105/mL），贮藏条件（通常在黑暗处）。

培养方法：液体基质培养法，半液体基质培养法，固体基质培养法，看护培养。

固体培养的步骤：原生质体移入培养基→1体积含原生质体的培养基与1体积含琼脂糖（40℃）的培养基混和→倒转培养皿在25℃下培养→原生质体重新产生细胞壁并分裂成细胞团→细胞团于琼脂糖基质中传代培养，培养基中应减少渗压剂以利于愈伤组织的形成→诱导分化成植物的根，茎。

原生质体分离培养的意义：1、除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍，同时叶为制造新杂种开辟了道路。

2、原生质体可摄入外源DNA，细胞器、细菌或病毒颗粒，这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础。

3、获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。

取洗涤过的原生质体悬浮液 0．5ml，置于10×100mm的小试管中，加入 FDA溶液使其最终浓度为 0．01％，混匀、置于室温5min后用荧光显微镜观察。

激发光滤光片用QB24，压制滤光片用JB8。

发绿色荧光的原生质体为有活力的，不产生荣光的为无活力的。

影响原生质体培养的因素

第九章++植物原生质体培养

原生质体制备

细胞工程植物原生质体培养和体细胞杂交

植物原生质体培养的影响因素分析

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原生质体培养名词解释

第八章植物原生质体培养

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第五章 原生质体培养

原生质体制备和再生的影响因素

微生物原生质体制备及再生的影响因素

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影响原生质体培养的因素课件

原生质体再生的影响因素发酵简答题

FDA染色法

第五章原生质体培养