浙江大学生物化学丙实验报告1

实验报告

课程名称： 生物化学实验（丙） 指导老师： 方祥年 成绩：__________________

实验名称： 蔗糖酶的提取 同组学生姓名： 金宇尊、鲍其琛

一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填）

三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填）

五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理

七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得

一、实验目的和要求

1、学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法；

2、巩固理论知识，学会学以致用并发现新问题。

二、实验内容和原理

1、实验内容：

蔗糖酶的提取、分离纯化

2、实验原理：

①酵母细胞破碎

细胞破碎的常用方法

液体剪切法固体剪切法压力和研磨

物理法、化学渗透法、酶溶

本实验采用研磨的方法。通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎，把蔗糖酶从酵母细胞中提取出来。

②蔗糖酶的初步分离纯化

蛋白酶常用的初步分离纯化方法有：盐析、选择性变性、有机溶剂沉淀等。

本实验采用选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶进行初步的提纯以及收集样品。

由于一般酶蛋白在常温下分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯

操作中要始终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能得到较好地分离提纯效果。

三、实验材料与试剂

1、实验材料

市售干酵母粉10g/组(3～4人）

2、实验试剂

石英砂，95%乙醇(-20℃），20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。

四、实验器材与仪器

电子天平（称量干酵母粉）；研砵（每组一套）；50ml高速离心管（4支/组、4孔50ml离心管架一个/组）；托盘天平（离心管平衡用）；高速冷冻离心机；恒温水浴箱（50℃）；量筒（50ml）、微量移液枪（1000ul)及枪头或移液管（1ml)、玻棒、滴管等;1.5ml离心管（留样品Ⅰ、Ⅱ用）及离心管架；制冰机；－20℃冰箱。

五、操作方法和实验步骤

1、酵母细胞破粹（干磨法）

①称量：称取市售干酵母粉10g+约3-5 g石英砂放入研钵

②研磨(干磨)：至尽可能成细粉末状（约15min）

③加液+研磨：量取总体积40 ml的20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液，分2次加研磨10min，

使呈糊状液体；

④离心：将糊状液体转移到2支50ml离心管中，两支离心管平衡后(托盘天平上)，离心10min

（条件：4℃、12000r/min）

⑤收集+测量：收集上清液并量出体积V1（样品I），另留1ml上清液（样品I ）放置－20℃冰箱保存用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE分析

2、热处理

①水浴热处理：将上步抽提液（样品I），迅速放入50℃恒温水浴，保温30min，

并每隔5min用玻璃棒温和搅拌提取液。

②冰浴冷却：保温后迅速用冰浴冷却5min

③离心：将热处理后的样品I转移至两支50ml离心管中，平衡后，离心10min。

（条件：4℃，12000r/min）

④收集+测量：收集上清液并量出体积V2（样品Ⅱ），另留1ml上清液（样品Ⅱ）放置－20℃冰箱保存（用于蔗糖酶蛋白含量测定、测定蔗糖酶活力和SDS-PAGE分析。

3、有机溶剂（乙醇）沉淀

①冰浴：将热处理后的上清液加入相同体积的－20℃的95%乙醇，冰浴中温和搅动混匀，

放置约20min；

②离心：转移至两支50 ml离心管中，平衡后，离心10min；

（条件：4℃，12000r/min）

③收集保存：弃去上清液，用7 mL的20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液溶解沉淀

留出1mL溶液，并将余下溶液转移入7 mL塑料离心管，－20℃冰箱保存。

（用于实验2离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶）

六、实验数据记录和处理

1、实验数据记录

石英砂：5.00g；

干酵母粉：10.00g；

Tris-HCl提取离心后上清液体积（样品Ⅰ）V1：31.5mL；

样品Ⅰ热处理离心后上层清液体积（样品Ⅱ）V2：27.0mL。

2、实验现象：

研磨过程：干酵母颜色变浅，散发出一股难闻的气味；

第一次离心后：上清液澄清颜色土黄色；下部沉淀分层，上层酵母细胞碎片等呈棕褐色，下层石英砂呈白色；

第二次离心后：上清液更加澄清橙黄色；沉淀为米白色，较第一次变浅；

第三次离心前：上清液柠檬黄，沉淀为米白色。

七、实验结果分析讨论

1、实验结果：

①经过研磨破碎的酵母提取液样品Ⅰ（1mL）；

②将样品Ⅰ经过热处理的样品Ⅱ（1mL）；

③经过选择性变形和有机溶剂沉淀处理过的样品Ⅱ，用 Tris-HCl pH7.3 缓冲液溶解保存在一只7mL 和一只1mL的离心管中（样品Ⅲ、Ⅳ）。

注意：所有收集样品均需在管壁外用油性记号笔做好标记，先放在一次性PE手套中，并放入-20 ℃冰箱中保存，用于后续实验。

2、结果分析：

①最后得到的两管沉淀，其中一管为米白色沉淀，另一管夹杂部分黄色沉淀，疑为杂质蛋白,或是由于在加入乙醇时体积比例没有调整好而造成，具体结果有待进一步检测。

②误差分析：

a：称量天平精确度不高，可能会对石英砂和干酵母的称量结果造成误差；

b:在研磨过程中，有少部分粉末洒出，存在操作误差；

c：在平衡过程中，为了保持平衡用胶头滴管在两支离心管之间进行调节，有部分溶液残留在胶头滴管里。可以将所有的材料放进一支离心管，另外一支离心管加入水，通过改变水的含量达到平衡的效果，以此来减少误差。

八、讨论、心得

1、实验原理探析

①石英砂的作用：加入石英砂是为了在研磨过程中增大摩擦力，将酵母细胞充分研磨破裂，提取蔗糖酶；

②高温水浴：利用了蔗糖酶的耐热性（最受温度为45-50℃），可以在50℃的水浴热处理下将不耐热的杂蛋白去除；

③有机沉淀：乙醇提供疏水的环境，破除蛋白质外层的水膜，从而使提取的蔗糖酶聚集在一起沉淀分离；

④冰浴作用：使分子运动速度下降，再加以搅拌使之快速沉降。

⑤低温操作：防止操作过程温度升高引起有效成分变性。

2、思考题：本实验在从干酵母中提取和分离纯化蔗糖酶的过程中具体运用了哪些方法？你认为还有哪些方法可以运用？说说你的设想。

答：①在本次试验中采用机械法中固体剪切法的研磨法；分离纯化过程用了选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇）沉淀的方法，后通过离心达到真正分离纯化的目的。

②其他常用细胞破碎方法：液体剪切法中的超声波法、机械搅拌法、高压匀浆法以及固体剪切法中的压力法和非机械法中的溶胀和自溶、化学渗透和生物酶降解等。由于蔗糖酶存在于细胞内部，所以需要将细胞破碎以获取蔗糖酶。另外，浓缩方法有沉淀法、吸附法、超过滤法、透析法、减压蒸馏法、冰冻干燥法等。

不同的方法都各有优势和缺点，我们要根据不同的实验条件和要求、目的来选择较为适宜的方法。（《生物化学技术原理及应用》赵永芳第四版）

3、实验感想

第一次做生化实验，感觉还是很新鲜。在实验开始研磨的过程中，就有点被一股难闻的味道恶心到了。之后在实验具体操作过程中，发现实验本身比较简单，所以即使第一次实验没有预习，还是能够很快的理解实验的内容。但是之后的实验应该还是比较复杂的，所以需要我们好好预习，并进行一定的思考，以便在下次实验课上能充分的将理论课上所学知识应用到实验中去。